La Sociedad Americana del Cáncer (MRSG-08-108-01), Vicente J. Sgro / La Asociación de Tumores Cerebrales de América, y la familia Khan Foundation para que Nakano.

1. Preparación de los medios de comunicación <ol><li> Los medios de comunicación fue elaborado con 10% de SFB (16140-071 - GIBCO) en DMEM/F-12 (1X), líquido 01:01 (10.565-042 - Invitrogen) con 0,6% de solución de agar purificado, Granulado (1.01614.1000-EMD ). Condiciones de esterilidad se mantuvieron durante todo el experimento. </li><li> Para la preparación de 5 ml de medios de FBS (16.140-071 - GIBCO) se añadió a 45 ml de DMEM/F-12 (1X), líquido 01:01 (10565-042 - Invitrogen) haciendo volumen final de 50 ml. Los medios preparados se mantuvo en un baño de agua a 37 ° C de temperatura. </li><li> La solución de agar se prepara mediante el método de microondas el calor. 0,3 gramos de agar granulado se disolvió en 50 ml de agua destilada utilizando microondas. La solución de agar se enfríe a 37 º C de temperatura, manteniendo que en el baño de agua. </li><li> Se utilizó el mismo volumen de los medios de comunicación desde el paso 1.2 y 1.3 y la solución madre preparada. La proporción de 0,6% de agar (0,5 ml) y el 10% FBS-D-MEM/F-12 los medios de comunicación (0,5 ml) fue de 1:1, por lo que el volumen total de 1 ml en cada pocillo de placas de 6 pocillos. </li></ol> 2. Procesamiento de tejidos <ol><li> El glioblastoma multiforme (GBM) los tejidos se recibieron inmediatamente después de la cirugía del Departamento de Patología. El tejido fue clasificado como GBM, del Departamento de Patología. </li><li> El tejido fue transferido al patri-placa con las pinzas con cuidado y se lava con 5 ml 1XPBS helada durante 3 horas. </li><li> Las secciones seriadas de las muestras fueron cortadas de las muestras disecadas para crear bloques de tumor (aproximadamente 10 mm de diámetro) con una cuchilla quirúrgica (Feather, 2976 # 10) y pinza (Fisher Scientific). </li><li> Los bloques fueron trasladados en una placa de 6 pocillos. Cada 1 ml y se contiene de los medios de comunicación mencionan en el paso 1.4. El tejido había suficiente exposición al aire para mantener el tejido viable. </li><li> Bloques tumorales fueron inyectados con cualquiera de DMSO (5%) o TMZ (2,5 nM) y se incubó durante 16 horas a 37 ° C en aire humidificado contiene 5% de CO2. 0,1 ml de DMSO (5%) o TMZ fue inyectado 3 veces en los bloques de tumor en diferentes lugares para un tratamiento coherente. La droga fue inyectada con jeringa de insulina 1 ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Point Comfort-26027). </li><li> Después de 16 horas los bloques se lavaron con 5 ml 1XPBS por 3 veces. Después de lavar los bloques se fijaron con 10 ml de 10% v / v en formol durante 24 horas (Ricca Chemical Company) en tubos de 50 ml (de Basix-5539802) y se procesa de parafina 4μm secciones. </li><li> La sección fijado en formol se coloca en el vaso sobre la placa de agitación con &quot;sin calor&quot; y procesados ​​a través de las siguientes soluciones durante 30 minutos en cada solución. 30% de etanol, etanol al 50%, 75% etanol, 80% de etanol, etanol al 95%, 100% de etanol y xileno. </li><li> El tejido se transfirieron a las toallas de papel y se coloca en parafina derretida (58 a 60 ° C, Fisher Paraplast parafina) durante 30 minutos. </li><li> El tejido se incluyó en moldes con parafina Surgipath Blue Ribbon, tejidos embebidos se enfrió a temperatura ambiente. </li><li> Embebidos en parafina secciones de tejido 4μm se tomaron y se coloca en Fisher diapositivas Plus. </li></ol> 3. Inmunohistoquímica La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente. 1 <ol><li> Deparaffinization y lugar de rehidratación de las diapositivas en un bastidor y realizar los pasos siguientes. Xileno de 3x5 minutos (3 veces durante 5 minutos), etanol al 100% para los minutos de 3x5, el 95% de etanol durante unos minutos 1x5, el 70% de etanol para el 1x5 minutos, enjuague con agua corriente del grifo durante 3 minutos. </li><li> Antígeno de recuperación de calor inducido por diapositivas de recuperación del epítopo de lleno en tampón de citrato 1X (Thermo Scientific-AP9003-500) diluido en agua destilada en un vaso de vidrio. Hervir durante 15 minutos en un plato caliente (asegúrese de que las secciones don &quot;t caen fuera de la diapositiva). Enfriar la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos con PBS 1X de 3x5 minutos. </li><li> La inhibición de peróxido de internos Sumerja los portaobjetos en metanol (Fisher Scientific-A-452-4) con peróxido de hidrógeno al 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluido en agua destilada) en un vaso de cristal durante 15 minutos. Enjuague con 1X PBS para 3x5 minutos. </li><li> El bloqueo de la cubierta de los tejidos con suero de cabra al 10% normal. Transferencia de las diapositivas de una caja húmeda e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan los portas con PBS 1X de 3x5 minutos. </li><li> Secciones primaria de anticuerpos se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario en las siguientes concentraciones: la caspasa-3 humana específica (1:1000, sistemas de I + D, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluido con PBS 1X. Enjuague los portaobjetos en PBS 1X minutos 3x10 al día siguiente. </li><li> Reacción de los anticuerpos secundarios cubren los tejidos con 2-3 gotas de HRP etiqueta secundaria de anticuerpos (prever sistemas). Poner los portaobjetos en una caja húmeda e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar con PBS 1X de 3x10 minutos. </li><li> Detección de Desarrollo para el kit de cromógeno DAB (Vector laboratorios-SK-4100) para la detección de anticuerpos primaria siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Tinción contador Sumerja las láminas con hematoxilina (10-15 s<html> egundos, asegúrese de que don &quot;t invadido DAB señal). Enjuague con agua corriente del grifo durante 3 minutos. </li><li> Sumerja la deshidratación de las diapositivas en el siguiente orden, el 70% de etanol durante 5 minutos, el 95% de etanol durante 5 minutos, 100% de etanol para los minutos de 3x5, 3x5 de xileno minutos. </li><li> Cubreobjetos las diapositivas con el reactivo de Permount montaje (Fisher Scientific-SP-15-100). </li><li> Las imágenes fueron tomadas con microscopio de fluorescencia Olympus (DP-72) .3.11). En todos los experimentos, etiquetado específico fue confirmada por el control negativo sin anticuerpo primario. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Se recogieron muestras quirúrgicas de glioblastoma multiforme (GBM). Los pacientes se sometieron a la primera cirugía sin quimioterapia previa como la temozolomida (TMZ). La imagen en T1 de la RM con gadolinio en la Figura 1a-demostró un tumor mayor en el lóbulo frontal derecho antes de la cirugía. La imagen postoperatoria (Figura 1b), confirmó la resección casi total de la lesión después de la cirugía. Los tejidos quirúrgicos fueron enviados al Departamento de Patología con el propósito diagnóstico clínico, y el resto de las muestras fueron procesadas para la obtención de tejidos en la Junta de Revisión aprobada Institucional (IRB) de protocolo en la Ohio State University Medical Center. Hematoxilina y eosina (H &amp; E) tinción demostrado la presencia de necrosis, las células pseudopallisading, y la proliferación microvascular (Figura 1-c). Por lo tanto, estos tumores fueron diagnosticados histopatológicamente como GBM. Es de destacar que los explantes de tumores después de la incubación sin TMZ hasta 48 horas mantiene la citoarquitectura de GBM. Por el contrario, con una incubación de 72 horas o más, nos dimos cuenta el aumento del número de núcleos de condensación en las muestras, lo que sugiere algunas de las células del tumor a partir de someten a la apoptosis. Como resultado, los tejidos tumorales después de la incubación ya contenía regiones irregular que perdió las células tumorales, las cuales fueron observadas preferentemente en y alrededor de las áreas necróticas (datos no mostrados). Con el fin de investigar si estas muestras de explantes de tumores de forma fiable puede ser utilizado con el propósito de la prueba de eficacia del fármaco, hemos probado el efecto del tratamiento con TMZ. Figura 2 representa el flujo de los experimentos en este estudio. Un estudio reciente indica que la inyección intratumoral de TMZ tiene un efecto más potente sobre el control del crecimiento de los gliomas malignos que la de la administración sistémica de este medicamento 2. Después de la incubación durante 16 horas, los explantes fueron incluidos en parafina y las secciones de serie se prepararon para la tinción. Inmunohistoquímica de tejidos tratados con TMZ GBM demostró una reducción sustancial de las células tumorales Ki-67-positivas en comparación con las muestras de control. A su vez, la inmunohistoquímica con un marcador de la apoptosis, la caspasa-3, no produjo ninguna diferencia significativa entre las muestras de glioma tratada con TMZ y las muestras de control (Figura 3). El efecto del tratamiento con TMZ se caracterizó además por la combinación de este ensayo de explante, juntamente con el cultivo in vitro o la citometría de flujo. En concreto, hemos tratado de determinar el efecto sobre la madre similares a las células las células tumorales (SCLTC). Por lo tanto, después de un tratamiento intratumoral con TMZ, se realizó un ensayo de formación de ámbito y citometría de flujo de estos explantes tumorales. Las muestras tratada con TMZ se disocia en las células individuales de un solo y único de estas células se sembraron a una densidad baja (1 de células por microlitro o menos) en placas de 96 pocillos en medio libre de suero complementado con bFGF y EGF. En el grupo control, la formación de esferas de tumores de los explantes de tumores se observó después de 7 días de incubación. Teniendo en cuenta que la formación de la esfera es una propiedad de SCLTC 3 4, alteraciones en el número de esferas del tumor mediante un tratamiento de drogas indica que el efecto sobre SCLTC. Del mismo modo, la citometría de flujo de los explantes de tumores disocian con un marcador de superficie celular, CD133, se llevó a cabo para verificar el efecto sobre la SCLTC. Si SCLTC en las células de tumor heterogéneo en GBM son selectivamente erradicar mediante el tratamiento con medicamentos, se podría predecir que la citometría de flujo detecta un descenso de la fracción CD133 positivas de un tratamiento (datos no mostrados). <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figure.1 imágenes por resonancia magnética (MRI) de un paciente GBM. Figuras representativas de la pre-operación de la Figura 1a-y post-operación Figura 1b. Figura 1c es la tinción H &amp; E de la muestra de tejido fresco GBM. Ampliación original, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura. 2 El flujo experimental del experimento de bloquear la cultura. Figura 2a. Imagen de GBM recién recibido de cirugía departamento de patología. Figura 2b muestra la disección del bloque del tumor en pequeñas piezas de 10 mm con la hoja de ayuda quirúrgica. Figura 2c es la droga (TMZ) el tratamiento de los bloques de tumor usando una jeringa de insulina. e 3 &quot;/&gt; Figura. 3 inmunohistoquímica. Inmunohistoquímica de los bloques de tejido GBM inyectado con DMSO o con TMZ activa la caspasa-3 y Ki67. Hematoxilina fue utilizado para la tinción nuclear. Ampliación original, 40X.

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Hay una brecha entre la eficacia de los medicamentos en el actual pre-clínicos y modelos experimentales la eficacia en los pacientes. Más específicamente, en el campo de investigación sobre el cerebro del tumor, nuevos métodos y fiable es necesario que ayude a llenar el vacío existente entre la evaluación de los medicamentos con los actuales métodos y la eficacia en los pacientes. El ensayo se describe en este estudio es una ventaja adicional, si no una solución, para facilitar el llenado de la discrepancia de los datos experimentales y los resultados de los pacientes afectados. En cultivos celulares in vitro preferentemente ampliar ciertos tipos de células tumorales, independientemente de las condiciones de cultivo, y sólo representan una subpoblación de todo el tumor. 5 Además, la transformación genética y fenotípica de la expansión de las células artificiales ocurre y es inevitable con los cultivos celulares a largo plazo . Uno de los principales obstáculos para el tratamiento de los gliomas malignos es la heterogeneidad de las células tumorales, tanto dentro de un solo tumor, y entre las muestras de tumor de 6, 7. Por lo tanto, el enriquecimiento selectivo de una cierta población de células tumorales, a pesar de un tipo u otro, no puede ser un medio apropiado para determinar la eficacia de los agentes quimioterápicos en las células tumorales heterogéneos. 8 9 Cualquier modelo animal de los tumores cerebrales derivadas de una subpoblación de las células tumorales arrojar luces sobre la eficacia del fármaco en una subpoblación, pero no todo el tumor. Varias limitaciones, por otro lado, aún permanecen en este método de explante del tumor. Una limitación de este tipo es el período relativamente corto de tratamiento. Desde células de tumores malignos son considerados para adquirir resistencia a la mayoría, si no todas, las terapias a través del tiempo, el control inicial del crecimiento de las células tumorales a corto plazo no puede ser reflejada por el pronóstico de los pacientes a largo plazo, como se informó recientemente con un anti- agente antiangiogénico, bevacizumab 10. Por lo tanto, la mejora del protocolo para este ensayo de explante para conservar los tejidos por un largo período se requiere de más investigaciones. Otra cuestión es un efecto específico de una prueba de drogas en SCLTC en el tumor. Teniendo en cuenta que SCLTC son relativamente resistentes a las terapias actuales para el glioma maligno, identificación de nuevos fármacos contra el cáncer que potencialmente erradicar SCLTC se justifica. En este sentido, en la actualidad tratan de combinar este ensayo con el consiguiente explante en experimentos in vitro, como el ensayo de neuroesfera formación (datos no mostrados). Esperamos aprender más sobre los efectos, en su caso, de un candidato a fármaco en SCLTC a través de estas pruebas combinadas. Por último, utilizando pequeños bloques de muestras de tumores pueden no reflejar la totalidad del tumor poblaciones de células, como es el caso de las líneas celulares tumorales convencionales o cultivos primarios de las muestras quirúrgicas. Estos problemas a un lado, preservar el estroma del tumor, incluyendo el nicho vascular, es útil en la caracterización de los factores ambientales de las células tumorales. Por lo tanto, este ensayo puede tener potencial para evaluar cualquier estrategia terapéutica bajo condiciones fisiológicamente más relevantes. En este caso, se estableció un ensayo para la prueba de eficacia del fármaco con explantes de piezas quirúrgicas de GBM. De hecho, con las piezas quirúrgicas a prueba, se encontró que una inyección directa de TMZ reduce la proliferación en las muestras de GBM. Este método de explantes de tejidos en teoría es aplicable a otros tumores sólidos y ofrece activos para determinar la eficacia del fármaco en el tumor de un paciente, que esperamos nos ayude a evitar un nuevo fracaso en los ensayos clínicos para el cáncer.

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De suero bovino fetal, calificado, inactivado por calor </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Líquido 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> El agar-agar purificado, Granulado </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS para la tinción </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> Richalrd allan ciencia </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% w / v caspasa-3 en formol </td><td> Ricca Chemical Company </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspasa-3 </td><td> I + D de sistemas </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Envision sistema anti-ratón </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Envision sistema anti-conejo </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vector Lab.. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tabla 1. Materiales. <table border="1"><tr><td> Nombre del equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 6 pocillos </td><td> Greiner un bio- </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Una caja de petri </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Serológicas pipeta </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Puntas con filtro </td><td> EE.UU. científica </td><td></td></tr><tr><td> 500 micras de malla de poliéster Netwell inserción </td><td> Costar </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matriz </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD jeringa de 10 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Aguja hipodérmica de aluminio de concentradores. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Frasco de cultivo de tejidos </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de centrífuga </td><td> BASIX </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> Tubos delgados de pared </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Quirúrgica de la hoja de acero inoxidable </td><td> Pluma </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> Jeringa de insulina </td><td> Confort punto </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50 ml con tapa de rosca de tubo plano de la PAC </td><td> BASIX </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Disección microscopio </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Fisher Ciencia </td><td></td></tr></table> Tabla 2. Equipo.

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

Las terapias actuales para el glioma maligno sólo tienen efecto paliativo. Para el desarrollo terapéutico, un obstáculo es la discrepancia de la eficacia determinada por las actuales pruebas de eficacia del fármaco y la eficacia en los pacientes. Por lo tanto, nuevos métodos y confiable para evaluar la eficacia del medicamento están garantizados en la fase pre-clínica. Cultivo in vitro de los tejidos tumorales, incluidas las líneas celulares, cuenta con importantes alteraciones fenotípicas, genéticas y epigenéticas de las células de cáncer causado por el medio artificial de cultivo, lo que puede no reflejar la biología de los tumores originales in situ. Modelos de xenoinjerto con los ratones inmunodeficientes también tienen sus limitaciones, es decir, la falta de sistema inmunológico y las discrepancias entre especies genéticas y epigenéticas en el microambiente. Aquí, demostramos un nuevo método utilizando los especímenes quirúrgicos de los gliomas malignos, como bloques de tumor no disociadas para evaluar los efectos del tratamiento. Para validar este método, los datos actuales con los de primera línea agente quimioterapéutico, la temozolomida (TMZ), se describen. Se utilizó la pieza quirúrgica recién eliminado de los gliomas malignos para nuestros experimentos. Se realizó la inyección intratumoral de TMZ o candidatos de otras drogas, seguido de la incubación y el análisis de piezas quirúrgicas. En este caso, hemos tratado de establecer un método de tejido explante del tumor como una plataforma para determinar la eficacia de la novela de terapias contra el cáncer, para que podamos ser capaces de superar, al menos, algunas de las limitaciones actuales y salvar la brecha existente entre la corriente experimental datos y la eficacia en tumor de un paciente real. Este método puede tener el potencial para acelerar la identificación de nuevos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de cánceres sólidos.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

En este caso, hemos establecido un método para la prueba de eficacia del fármaco con la pieza quirúrgica de los tumores cerebrales, llamado &quot;método de explante del tumor&quot;. Con este método, podemos evaluar la eficacia del medicamento sin romper el microambiente de los tumores sólidos. Para validar la fiabilidad de este método, se describen los datos representativos de nuestra muestra de glioma tratadas con la actual primera línea del agente quimioterapéutico, la temozolomida.

Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K vistas.  The Ohio State University Medical Center. En este caso, hemos establecido un método para la prueba de eficacia del fármaco con la pieza quirúrgica de los tumores cerebrales, llamado "método de explante del tumor". Con este método, podemos evaluar la eficacia del medicamento sin romper el microambiente de los tumores sólidos. Para validar la fiabilidad de este método, se describen los datos representativos de nuestra muestra de glioma tratadas con la actual primera línea del agente quimioterapéu...

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Investigación

Medicina

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

Análisis Transcriptomic de especímenes quirúrgicos retina humana usando Diario

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Un método de monitoreo asequible VIH-1 Resistencia a los medicamentos para los entornos con recursos limitados

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

Un modelo de tumor de Estrés quirúrgico para explorar los mecanismos de inmunosupresión postoperatoria y Evaluar Novel perioperatorias Inmunoterapias Ratón

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

Un Modelo Murino novela de fístula arteriovenosa Fallo: El procedimiento quirúrgico en Detalle

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Un tumor cerebral / organotípicos rebanada Co-cultura del sistema para estudiar microambiente tumoral y dirigida Medicamentos Terapias

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes