Los autores desean dar las gracias a todos los colegas que hicieron posible este trabajo, especialmente Maya Balamane, Elizabeth Johnston Blanco, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott y Lungani Ndwandwe. Los autores también desean agradecer a todo el personal del Departamento de Salud y personal de África Centro que trabajan el Tratamiento del VIH Hlabisa y el Programa de Atención.

<ol>
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<div> Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Unión Europea (SANTE 2007 147-790), el Centro de EE.UU. para el control de enfermedades a través de CAPRISA (Título del proyecto: Fortalecimiento de Sistemas de Salud y el fracaso del tratamiento del VIH (VIH- TFC)), y el Programa Común de Investigación suizo africano del sur (SSJRP) beca de investigación titulado &quot;Swiss Prot / Sudáfrica: Proteína Bioinformática Desarrollo de Recursos de patógenos relacionados con la salud importantes&quot;. RL es apoyada por el Wellcome Trust (número de concesión 090999 / Z / 09 / Z). Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia. </div>

Varios de bajo costo métodos internos se han descrito en los esfuerzos para tratar de hacer el genotipado de resistencia del VIH más asequible 33, 34, 36. No hay duda de la necesidad de integrar las pruebas de resistencia a los medicamentos en el continuo de la atención a las personas en tratamiento antirretroviral en entornos con recursos limitados. Sin embargo, la mayoría de los métodos denunciados se centran en la aplicación de genotipado resistencia a los medicamentos en la vigilancia de la resistencia a los medicamentos a nivel de población. El método de genotipificación SATURN / Life Technologies es un protocolo totalmente integrado para la vigilancia y el seguimiento de la farmacorresistencia. Este método fue diseñado para ser un protocolo asequible implementar fuente mayoría abiertos y abiertas recursos bioinformáticos de acceso para la interpretación de la resistencia a los medicamentos y la generación de informes para la gestión clínica. Se ha demostrado a través de la comparación con el método de genotipificación ViroSeq aprobado por la FDA para serprecisa en la identificación de mutaciones de resistencia a medicamentos de un panel de muestras de ensayos de aptitud ANRS, en el 100% de las muestras del panel de laboratorio que fueron amplificados con éxito. La precisión también se evaluó en muestras clínicas de los virus del subtipo C, el subtipo más dominante en el sur de África. El método era tan precisa sobre muestras del subtipo C, ya que era el subtipo A y B. Sin embargo, si el método se utiliza en otras partes del mundo donde CRF02_AG es frecuente, hay una necesidad para la modificación de los cebadores ya que el método fallado para amplificar una de las muestras de panel que ha demostrado tener CRF02_AG. Alternativamente, un conjunto degenerado de cebadores sensibles a todos los virus del grupo M 33, 36 podría ser utilizado en regiones en las que la distribución subtipo es más heterogéneo 38. La sensibilidad de la transcripción inversa y la PCR se puede aumentar mediante la extracción de ARN a partir de mayores volúmenes de plasma, tales como 500 ml. El plasma se puede Centrifuged a 21.000 xg durante 90 minutos para concentrar las partículas virales antes de proceder con el protocolo descrito por el mini-kit de extracción de ARN viral QIAamp. Como se muestra, el nuevo método tiene una ventaja adicional que produce informes completos para la gestión individual del paciente. Estos informes son una consolidación del genotipo, el inmunológico y los datos de vigilancia virológica, así como la historia clínica y el tratamiento de RegaDB. Esto va acompañado de una interpretación de laboratorio detallada del perfil de resistencia seguida de un examen igualmente detallada de la historia clínica del paciente, así como recomendaciones de tratamiento. La utilización de un médico especialista para revisar los informes y proporcionar recomendaciones de tratamiento para los pacientes ofrece la tutoría muy necesaria para los profesionales de enfermería, así como a los médicos sin experiencia, que están proporcionando cada vez ART en Sudáfrica como parte de las recomendaciones de la OMS para el cambio de tareas. Estos clínicainformes han demostrado ser medios de enseñanza eficaces para los médicos con poca o ninguna experiencia en la gestión de resistencia a los medicamentos. Desde la perspectiva del paciente, nuestro método reduce la necesidad de viajar a sitios centralizados para acceder a los servicios de VIH especializados. Por lo tanto, el protocolo descrito considerado en su conjunto ofrece una buena plataforma a través del cual la gestión de la resistencia del VIH se puede integrar, a un costo accesible, en la continuidad de la atención a las personas infectadas por el VIH no ART. Los datos generados se pueden usar para fines epidemiológicos para evaluar la evolución y la transmisión de la resistencia a los medicamentos en la comunidad. El tamaño del fragmento pol generado es lo suficientemente bueno para el análisis filogenético más complejo que producirá mejor comprensión de la epidemia a nivel de la población.

La epidemia de VIH en el sur de África ha ido evolucionando rápidamente 1 con un aumento exponencial concomitante en los individuos en terapia antirretroviral (ART), especialmente en el sur de África 2, 3. Como evidencia del impacto epidemiológico de los programas de tratamiento a gran escala en la reducción de la incidencia de 4 y el aumento de la esperanza de vida en los entornos con recursos limitados (RLS) 5 continúa acumulándose, se intensificarán los esfuerzos para aumentar la cobertura de ART. La evolución de las directrices para el uso del tratamiento como herramienta de prevención 6, 7, bajo la prueba y los programas de tratamiento significa que el número absoluto de personas en tratamiento se incrementará aún más. Un gran número de personas estarán en ART durante períodos más largos de tiempo ya que la esperanza media de vida de las personas en tratamiento antirretroviral se acerca a la de la población no infectada por VIH 8. El desarrollo y la transmisión de la farmacorresistencia del VIH tiene always sido considerado una amenaza para los logros de la ART 12.9. Por lo tanto, hay una necesidad de más rigurosa vigilancia y el control de la resistencia a fármacos como se inician más individuos en ART. Efectuar pruebas de resistencia genotípica de drogas (TRB) se ha utilizado con éxito en los países desarrollados, tanto para la vigilancia y el monitoreo del VIH-1 resistencia a los medicamentos en las personas que reciben tratamiento antirretroviral. En esta configuración, GRT se ha integrado en la continuidad de la atención para el VIH-1 en individuos infectados. La mayoría de las guías internacionales recomiendan TRB para adultos y pacientes pediátricos en su defecto ART (de primera línea y de segunda línea) 13-15, los pacientes pediátricos expuestos a la prevención de la transmisión materno-infantil (PTMI) regímenes pero posteriormente infectan 16, y en entornos con altos niveles de resistencia a los medicamentos de transmisión entre las personas con infección aguda 13-15. Sin embargo, los requisitos de coste, la tecnología y la infraestructura han limitado la implementaciónción de enfoques similares para la supervisión resistencia a los medicamentos en el SPI. El tratamiento de Sudáfrica el VIH y las directrices de seguimiento no se recomienda actualmente el uso de toneladas de registro bruto en la orientación de la elección de la terapia antirretroviral para las personas que fallan regímenes de primera línea 17. Las personas se conectan basado principalmente en virológica parámetros (VIH-1 RNA carga viral). Sin embargo en 2012, el sur de África Los clínicos Sociedad VIH publicó las primeras directrices de las pruebas de resistencia de drogas ARV África del Sur 18. Estas directrices recomiendan las pruebas TRB para todos los adultos en su defecto de primera línea y de segunda línea y para los bebés y niños infectados expuestos a pMTCT 18. Sin embargo, GRT, no se recomienda para las personas de 18 infectados en forma aguda debido a que no hay evidencia actual de altos niveles de resistencia a los medicamentos de transmisión en el sur de África 19-29. Se espera que algunas de estas recomendaciones se integrarán con el tiempo en el tre nacionaldirectrices tamiento y seguimiento de los distintos países de la región. Ya en los 2013 las directrices de tratamiento de Sudáfrica ahora hay recomendación del GRT en el momento del fallo de segunda línea para adultos y al momento de la falla régimen basado en IP de primera o de segunda línea para los niños 30. Se ha demostrado que la incorporación de TRB en las guías de tratamiento en Sudáfrica sería potencialmente costo-neutral. Teniendo en cuenta el costo de los medicamentos de segunda línea régimen que son relativamente más caros que los fármacos de primera línea, utilizando TRB para identificar a los pacientes que realmente necesitan ser cambiado a la terapia de segunda línea no supondrá ningún coste adicional para el programa. Además, GRT también puede identificar otras razones para el fracaso, la conservación de las opciones de tratamiento y generar información sobre los patrones de resistencia emergentes 31. Por lo tanto, es necesario para reducir el coste de los métodos de monitoreo de resistencia a fármacos aún más con el fin de mejorar el acceso, la calidad de un cuidadolos resultados d. A continuación, presentamos un método TRB destinados a utilizar (de código abierto) cebadores genéricos para la transcripción reversa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación (Tabla 1), así como software de código abierto en su mayoría para la interpretación resistencia a los medicamentos. Para la gestión clínica, el protocolo se complementa con un método integral y notificando a la interpretación especialista del informe resistencia a los medicamentos de laboratorio con una estrecha adhesión a las directrices nacionales de tratamiento. El protocolo se divide en cuatro componentes diferentes: 1) Ácido VIH ribonucleico (ARN) Extracción, 2) transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de amplificación de dianas virales, 3) Secuenciación y 4) los métodos de bioinformática para el análisis de los cromatogramas, alineación, curación y la interpretación de los datos de secuencia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

VIH-1 resistencia a los medicamentos tiene el potencial de comprometer seriamente la eficacia y el impacto de la terapia antirretroviral (ART). Como los programas de TAR en África subsahariana siguen expandiéndose, las personas en tratamiento antirretroviral deben ser estrechamente monitorizados para la aparición de resistencia a los medicamentos. La vigilancia de la farmacorresistencia transmitida para rastrear la transmisión de cepas virales resistentes a los antirretrovirales ya es también crítico. Desafortunadamente, las pruebas de resistencia a los medicamentos aún no es de fácil acceso en los entornos con recursos limitados, ya que la genotipificación es caro y requiere de laboratorio sofisticado y la infraestructura de gestión de datos. Un acceso abierto método de seguimiento de la resistencia genotípica al fármaco para gestionar personas y evaluar la resistencia a fármacos de transmisión se describe. El método utiliza el software libre de código abierto para la interpretación de los patrones de resistencia a los medicamentos y la generación de informes individuales de los pacientes. El protocolo de determinación del genotipo tiene una tasa de amplificación de más de un 95% para las muestras de plasma con AVcarga iral&gt; 1000 VIH-1 RNA copias / ml. La sensibilidad disminuye significativamente para cargas virales &lt;1.000 copias de ARN del VIH-1 / ml. El método descrito aquí se valida con un método para el VIH-1 resistencia a los fármacos de ensayo aprobados por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos (FDA), el método de genotipificación ViroSeq. Limitaciones del método descrito aquí incluyen el hecho de que no está automatizado y que también falló para amplificar la forma circulante CRF02_AG recombinante a partir de un panel de validación de muestras, aunque se amplificó subtipos A y B de la misma panel.

El método validado fue una modificación de un método descrito previamente 20. El método de genotipificación ViroSeq, que ha sido aprobado por la FDA, se utilizó como método de referencia en la validación. Un panel de muestras de ensayos de aptitud obtenidos de las agencias nacionales de francés para la Investigación sobre el SIDA y la hepatitis viral (ANRS) se utilizó en la comparación principal entre los dos métodos. Los dos métodos de genotipificación fueron 100% concordantes en la identificación de todas las mutaciones clínicamente importantes asociadas a la resistencia de la droga tal como fue interpretado por el programa HIVDB para las muestras que fueron amplificados con éxito por ambos métodos. Como se muestra en la Tabla 6, las secuencias de nucleótidos de los tres pares eran 99,5% idéntica. Las secuencias de aminoácidos predichas eran 100% idénticas. Una muestra de cada cinco no pudo ser amplificado con éxito por ViroSeq. Además de la muestra no amplificada por ViroSeq, el método de la casa no pudo amplificar una segunda muestra, que se muestraser un virus recombinante de circulación (CRF02_AG) por ViroSeq. Las tres muestras que amplificaron con ambas metodologías eran del subtipo B (dos muestras) y el subtipo A (una muestra). <img alt="La figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figura 5. El uso de un Vecino Participar árbol HKY hecho como parte de la garantía de calidad de secuencias. Hay cuatro pares / grupos de secuencia con las distancias genéticas muy cortos. La distancia genética entre RES655 y RES655_1 (mismas muestras en secuencia en diferentes días) es 0,003. El es un posible error con el par RES637_1/RES638 como su distancia genética es demasiado corto (0.075) para muestras de diferentes individuos no vinculadas epidemiológicamente. Hay otro RES637 en el árbol con una distancia de 0,075 cuando se compara con RES638_1. El clúster CQ01/CQ02 sugiere que las dos muestrasdesde el panel son duplicados de la misma muestra. Se agrupan junto con la secuencia de referencia subtipo B que confirma el subtipo asignado por la herramienta REGA Subtipificación. CQ05 y CQ04 agrupan con los subtipos A y G, respectivamente, mientras que la herramienta de subtipificación REGA los clasificó como A y CRF02_AG respectivamente. Otra herramienta útil para los subtipos y la recombinación del VIH es SCUEL, que está disponible en http://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> Se utilizó un panel de cinco muestras para evaluar la precisión del método en-casa. Diez genotipos replicados se generaron para cada una de las cinco muestras. Usando el analizador genético 16 Capilar 3130xl, 48 de los 50 genotipos fueron generados a partir de las 24 carreras, preparados en el mismo día. Para todas las cinco muestras, las secuencias de aminoácidos predichas fueron 100% concordantes entre repeticiones. Para la secuencias de ácido nucleico, THere era&gt; 99% de similitud por pares. Durante los dos primeros años de la utilización de este método, sesenta muestras se repiten al azar de la extracción de RNA a secuenciación. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre la puntuación de calidad de secuencia y el número de bases mixtas entre las repeticiones. Tanto el de nucleótidos y de aminoácidos comparaciones por pares para las sesenta pares fueron mayores que 99% idéntica. Por lo tanto las mutaciones de resistencia a fármacos para todos los pares fueron 100% concordantes. Reducción de costes Los volúmenes de reacción para RT, PCR y secuenciación se redujeron en al menos la mitad, en relación con el método original 20, 32, sin comprometer la calidad de las secuencias generadas. Esto permitió una reducción en el costo de 50% para las etapas de RT y PCR. El nuevo método fue diseñado originalmente para trabajar con seis cebador de secuenciación para secuenciar<html> todos los 99 codones del gen de la proteasa y los primeros 300 codones del gen de la transcriptasa inversa 20, 32. Métodos similares también utilizan seis a ocho cebadores 33, 34. Algunos métodos recientemente publicados han utilizado menos de seis cebadores, aunque a veces la secuenciación de la proteasa y los genes RT seprately 35, 36. Hemos tratado de reducir el número de cebadores de secuenciación de seis a cuatro, (Figura 6) <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> Figura 6. Comparación de secuencias contiguas de seis vs cuatro cebadores de secuenciación para la generación de la secuencia de Pol 1197 pb que cubre todos los 99 VIH-1 codones de la proteasa y los primeros 300 codones del gen de la transcriptasa inversa.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. Secuencias de un conjunto de 17 muestras generadas a partir de seis cebadores se compararon con las secuencias generadas después de la exclusión de dos cebadores (MAW46 y RTY). Los subtipos fueron 14 el subtipo C, dos subtipo B, y un subtipo A. No hubo diferencias significativas en las puntuaciones de calidad de secuencias. Una vez más, la identidad promedio pairwise entre los 17 pares de ácido nucleico fue de 99% y 100% en el nivel de aminoácidos. Por lo tanto, la reducción de los cebadores de secuenciación de seis a cuatro resultó en una reducción en el costo de secuenciación en casi un tercio. La única herramienta de software propio que se utiliza en este protocolo fue Geneious para la secuencia de montaje. Las herramientas de interpretación resistencia a los medicamentos, así como el informe de la generación de herramientas son todo, herramientas de acceso abierto y gratuito. Esto reduce el coste aún más mediante la eliminación de los costos asociados con el uso de software propietario. Además, collective la negociación permitió a los reactivos para este protocolo para ser empaquetados en un estuche para facilitar el acceso de Life Technologies y está disponible como las Tecnologías de Saturno / Life método de genotipificación de 37. Por otra parte, los miembros de Saturno puede acceder a los reactivos a un precio con descuento. Ámbito clínico El protocolo descrito ha sido implementado en el control y la vigilancia de la resistencia a las drogas en una comunidad rural de KwaZulu-Natal. Un total de 604 genotipos fueron generados a partir de muestras clínicas, entre diciembre de 2010 y mayo de 2013, a una tasa de amplificación de 95% para las muestras con una carga viral&gt; 1000 ARN copias / ml. Este estudio clínico de resistencia del VIH fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Biomédica de la Universidad de KwaZulu-Natal (BF052/10 ref.) y el Comité de Investigación de la Salud del Departamento de Salud de KwaZulu-Natal (ref. HRKM 176/10). Los informes individuales de los pacientes fueron generados y enviados de vuelta a las clínicaspara el manejo del paciente. Setenta y dos (72) genotipos también fueron generados como parte de un estudio de vigilancia de la resistencia a los medicamentos de transmisión, anidan dentro de un amplio estudio de vigilancia del VIH de base poblacional prospectivo. Las muestras primarias fueron toda pinchazo sangre recogida en microtubos EDTA. En genotipado hubo una tasa de amplificación de 79% 19. Ética aprobación para el genotipado de las muestras del estudio de vigilancia se obtuvo de la Universidad de Comité de Ética de la Investigación Biomédica de KwaZulu-Natal (BE066107 ref.). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nombre Primer </td><td> Secuencia </td><td> Longitud </td><td> Dirección </td><td> Posición HXB2 </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Adelante </td><td> 2028-2050 </td><td> Primera ronda de PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Reverse </td><td> 3539-3509 </td><td> Primera ronda de PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC cacca </td><td> 20 </td><td> Adelante </td><td> 2147-2166 </td><td> Segunda ronda de PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 3462-3441 </td><td> Segunda ronda de PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Adelante </td><td> 2486-2508 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Reverse </td><td> 2630-2604 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Adelante </td><td> 2956-2994 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Reverse </td><td> 3129-3101 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> RT-Y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 2967-2946 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Adelante </td><td> 2251-2277 </td><td> Secuenciación </td></tr></tbody></table> Tabla 1. La transcripción, PCR, y cebadores de secuenciación personalizados utilizados en la generación de un fragmento de 1197 pb Pol cubriendo todos los 99 VIH-1 codones de la proteasa y los primeros 300 codones del gen trascriptase inversa inversa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. dNTP / Primer mezcla para la reacción de transcripción inversa. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (ml) / reacción </td><td> Concentración / reacción </td></tr><tr><td> Primera Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Superíndice III transcriptasa inversa (200U/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Mezcla de enzimas para la reacción de transcripción inversa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (ml) / reacción </td><td> Concentración final / Reacción </td></tr><tr><td> DEPC agua tratada </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tampón de PCR (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> mezcla de dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Cebador Froward (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Cebador inverso (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq polimerasa (5 U / ml) </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> Total parcial </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Master mezcla para la PCR anidada. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (ml) / reacción </td><td> Concentración / reacción </td></tr><tr><td> DEPC agua tratada </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Secuenciación de búfer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3,2 pmol / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> Grandes terminador mezcla de secuenciación del tinte </td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Total </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 5. Mezcla maestra para las reacciones de secuenciación. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> ViroSeq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> % NA Similitud </td></tr><tr><td> ID de la muestra </td><td> Subtipo </td><td> El nivel de calidad </td><td> PR mutaciones </td><td> Mutaciones en RT </td><td> Subtipo </td><td> El nivel de calidad </td><td> Mutaciones PR </td><td> RT mutaciones </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> La </td><td> 99.7 </td><td></td><td> K103N </td><td> La </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Resul comparativots de un análisis paralelo entre el método de genotipificación ViroSeq y el método de la casa usando un panel de muestras proporcionada por la ANRS.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Pruebas de resistencia a los medicamentos para el VIH-1 en individuos infectados no respondían al tratamiento antirretroviral (ART) puede guiar futuras terapias y mejorar los resultados del tratamiento. Optimización de los resultados de salud individual y poblacional en la alta prevalencia del VIH, sino entornos con recursos limitados, en última instancia requerirá genotipado resistencia a los medicamentos asequibles y accesibles y los métodos de interpretación.

Un método de monitoreo asequible VIH-1 Resistencia a los medicamentos para los entornos con recursos limitados

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

18.4K vistas.  University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa.  Pruebas de resistencia a los medicamentos para el VIH-1 en individuos infectados no respondían al tratamiento antirretroviral (ART) puede guiar futuras terapias y mejorar los resultados del tratamiento. Optimización de los resultados de salud individual y poblacional en la alta prevalencia del VIH, sino entornos con recursos limitados, en última instancia requerirá genotipado resistencia a los medicamentos asequibles y accesibles y los métodos de interpretación. 

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Método para el desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer utilizando explantes tumorales de las piezas quirúrgicas


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Investigación

Medicina

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Las técnicas para Ojos Procesamiento implantados con una retina Prótesis para análisis histopatológico localizado: Parte 2 Epirretinal Implantes de retina con tachuelas

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementación de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga Resistencia Ensayos: Maximizar el Potencial de Descubrimiento clínicamente relevantes mecanismos de resistencia

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Método de cuantificación del tumor bioluminiscencia-base para la progresión tumoral Monitoreo y efectos del tratamiento en modelos de ratón linfoma

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Un método mejorado para la rápida intubación de la tráquea en ratones

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, pancreatitis, and pancreatic cancer. All three of these diseases mark active areas of study, not only to develop immediate therapy, but also to better understand their pathophysiology. There are few tools to further these areas of study. Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. The technique requires the intricate dissection of the second portion of the duodenum and ampulla, followed by the occlusion of the bile duct and the cannulation of the pancreatic duct. Although the technique is technically challenging at first, the applications are myriad. Ambiguity in the specifics of the procedure between groups highlighted the need for a standard protocol. This work describes the expression of a green fluorescent protein (GFP) within the pancreas after the pancreatic duct infusion of a viral vector expressing GFP versus a sham surgery. The infusion and therefore expression is specific to the pancreas, without expression present in any other tissue type.

Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. A pancreatic duct infusion technique for drug and viral delivery to pancreatic cells is presented here.

Infusión del conducto pancreático: un método eficaz y selectivo de administración de fármacos y virus

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Método optimizado de LC-MS/MS para el análisis de alto rendimiento de las muestras clínicas de Ivacaftor, sus principales metabolitos y Lumacaftor en fluidos biológicos de pacientes con Fibrosis quística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...