האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן (MRSG-08-108-01), וינסנט J. Sgro / האגודה האמריקנית גידול במוח, לבין קרן משפחת חאן כי אני נאקאנו.

1. הכנה של התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת הוכן באמצעות 10% FBS (16140-071 - GIBCO) ב DMEM/F-12 (1X), נוזלי 01:01 (10565-042 - Invitrogen) עם פתרון אגר 0.6% מטוהרים, מגורען (1.01614.1000-EMD ). בתנאים סטריליים נשמרו לאורך כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת 5 מ&quot;ל התקשורת של FBS (16140-071 - GIBCO) נוספה 45mL של DMEM/F-12 (1X), נוזלי 01:01 (10565-042 - Invitrogen) שהופך נפח סופי של 50 מ&quot;ל. התקשורת מוכנה הוחזק אמבט מים בטמפרטורה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון אגר הוכן באמצעות שיטת במיקרוגל החום. 0.3 גרם אגר היה מגורען מומס במים מזוקקים 50 מ&quot;ל באמצעות מיקרוגל. הפתרון אגר היה מגניב עד 37 ° C טמפרטורה ידי שמירה על אותה לאמבטיה מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשנו נפח שווה של מדיה מן צעד 1.2 ו - 1.3 פתרון מלאי מוכן. יחס אגר 0.6% (0.5mL) ו -10% FBS-D-MEM/F-12 מדיה (0.5mL) היה 01:01, מה שהופך את הנפח הכולל של 1 מ&quot;ל היטב כל אחד 6 צלחות היטב. </li></ol> 2. עיבוד רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Glioblastoma multiforme (GBM) ברקמות התקבלו מיד לאחר הניתוח מן המחלקה לפתולוגיה. הרקמה סווגה GBM מן המחלקה לפתולוגיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה הועבר צלחת patri באמצעות מלקחיים ובזהירות ורחץ עם קרים כקרח 1XPBS 5 מ&quot;ל במשך 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים סידורי הדגימות נחתכו מן דגימות גזור ליצור בלוקים הגידול (בקירוב 10 מ&quot;מ קוטר) עם להב כירורגי (Feather-2976 # 10) המלקחיים (פישר סיינטיפיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוקים הועברו לתוך צלחת 6 באר. כל 1mL גם היה המכיל התקשורת להזכיר בשלב 1.4. הרקמה היתה חשיפה מספיק אוויר כדי לשמור על רקמת קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוקים גידול הוזרקו אז גם עם DMSO (5%) או TMZ (2.5 ננומטר) מודגרות עבור 16 שעות 37 מעלות צלזיוס באוויר humidified CO2 המכיל 5%. 0.1mL של DMSO (5%) או TMZ היה מוזרק 3 פעמים גושי גידולים במקומות שונים לטיפול עקבי. התרופה היה מוזרק באמצעות מזרק אינסולין 1mL 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (נוחות נקודה 26,027). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 16 שעות בלוקים נשטפו עם 5 1XPBS מ&quot;ל במשך 3 פעמים. אחרי כביסה אבני תוקנו עם 10 מ&quot;ל של 10% v / v פורמלין למשך 24 שעות (החברה Ricca כימי) בתוך 50 מ&quot;ל צינורות (Basix-5539802) ומעובד פרפין מוטבע 4μm חלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף קבוע פורמלין הונחה כוס בצלחת ומערבבים עם &quot;חימום&quot; ומעובד באמצעות הפתרונות הבאים במשך 30 דקות כל פתרון. אתנול 30%, אתנול 50%, אתנול 75%, אתנול 80%, אתנול 95%, 100% אתנול, ו - קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרקמה נמחק על מגבות נייר והושמו פרפין נמס (58 עד 60 ° צלזיוס, פרפין פישר Paraplast) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרקמה היה מוטבע באמצעות תבניות Surgipath פרפין Blue Ribbon, רקמה מוטבע קוררו לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוטבע פרפין סעיפים 4μm רקמות שנלקחו והניח בשקופיות פישר פלוס. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה אימונוהיסטוכימיה בוצע כפי שתואר לעיל. 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinization ומקום התייבשות השקופיות במעמד ולבצע את השלבים הבאים. קסילן עבור 3x5 דקות (3 פעמים במשך 5 דקות), 100% אתנול דקות 3x5, אתנול 95% במשך דקות 1x5, אתנול 70% עבור 1x5 דקות, לשטוף במים זורמים ברז במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Antigen אחזור עם חום הנגרמת epitope שקופיות אחזור לטבול חיץ ציטראט 1X (Thermo Scientific-AP9003-500) מדולל במים מזוקקים בכוס זכוכית. מרתיחים במשך 15 דקות על פלטה חשמלית (לוודא סעיפים דון &quot;לא ליפול השקופית). פתרון מגניב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם 1X PBS עבור 3x5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכוב של מי חמצן פנימי לטבול את השקופיות של מתנול (פישר סיינטיפיק-A-452-4) עם מי חמצן 0.3% (פישר סיינטיפיק-BP2633-500-מדולל במים מזוקקים) בכוס זכוכית למשך 15 דקות. יש לשטוף ב 1X PBS עבור 3x5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת כיסוי הרקמות עם סרום 10% עז נורמלי. העברת שקופיות בתוך קופסה לח דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם 1X PBS עבור 3x5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדורים נוגדן ראשוני הודגרו לילה ° C עם נוגדן ראשוני בריכוזים הבאה 4: caspase-3 אנושי ספציפי (1:1,000, R &amp; D מערכות, AF835), Ki67 (01:01, Dako, 15626) מדולל 1X PBS. שטפו את השקופיות 1X דקות PBS 3x10 ביום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת נוגדנים משני מכסים את רקמות עם 2-3 טיפות של נוגדן הנקרא HRP משנית (לדמיין מערכות). שים שקופיות בתוך קופסה לח דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 1X PBS עבור 3x10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור לפתח עבור DAB אב צבע ערכה (וקטור מעבדות-SK-4100) לאיתור נוגדן ראשוני הבאים פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים מונה לטבול את השקופיות עם hematoxylin (15/10 s<html> econds, ודא דון &quot;לא מוצף DAB אות). לשטוף עם מים זורמים ברז במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול התייבשות השקופיות כדי שלאחר מכן, אתנול 70% במשך 5 דקות, אתנול 95% במשך 5 דקות, 100% אתנול דקות 3x5, קסילן עבור 3x5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי להחליק את השקופיות עם מגיב הרכבה permount (פישר סיינטיפיק-SP-15-100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות שנלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אולימפוס (DP-72) .3.11). בניסויים כל, תיוג ספציפית אושרה על ידי שליטה שלילי ללא נוגדן ראשוני. </li></ol> 4. נציג תוצאות: אספנו דגימות כירורגית של multiforme glioblastoma (GBM). החולים שעברו את הניתוח הראשון ללא chemotherapies לפני כולל temozolomide (TMZ). התמונה T1-המשוקלל של בדיקת MRI עם גדוליניום שיפור באיור-1a הראו גידול משופרת באונה המצחית הימנית לפני הניתוח. התמונה לאחר הניתוח (איור-1b) אישר סכום ביניים של הסרת הנגע לאחר הניתוח. רקמות כירורגית נשלחו המחלקה לפתולוגיה לצורך אבחון קליני, ואת דגימות הנותרים עובדו על רכש את הרקמה תחת עמוד אישרה סקירה מוסדיים (IRB) פרוטוקול בבית של אוניברסיטת מדינת אוהיו המרכז הרפואי. Hematoxylin ו Eosin (H &amp; E) מכתים הפגינו נוכחות של נמק, תאים pseudopallisading, ועל כלי הדם התפשטות (איור 1-c). לכן, גידולים אלה אובחנו histopathologically כמו GBM. ראוי לציין, explants הגידול הבאים הדגירה ללא TMZ עד 48 שעות שמרו על cytoarchitecture של GBM. לעומת זאת, עם הדגירה של 72 שעות או יותר, שמנו לב מספר גדל של גרעינים מרוכז בדגימות, דבר המצביע על כמה תאים סרטניים מתחילים עוברים אפופטוזיס. כתוצאה מכך, רקמת הגידול הבאים הדגירה כבר הכילה אזורים בלתי סדיר כי איבד תאים סרטניים, אשר נצפו ליד מעדיפים סביב אזורים נמקי (מידע לא מוצג). על מנת לחקור אם אלה דגימות explant הגידול יכול להיות מנוצל באופן מהימן לצורך בדיקת יעילות התרופה, בדקנו את ההשפעה של טיפול TMZ. תרשים 2 מייצג את הזרימה של הניסויים במחקר זה. מחקר שנערך לאחרונה עולה כי הזרקה intratumoral של TMZ יש השפעה חזקה יותר על בקרת הצמיחה של glioma ממאיר מזו של ממשל מערכתית של תרופה זו 2. לאחר דגירה של 16 שעות, explants אלה היו מוטבעים עם פרפין וחתכים סדרתי מוכנים מכתים. אימונוהיסטוכימיה של TMZ שטופלו רקמות GBM הפגינו צמצום משמעותי של Ki-67 חיובי תאים סרטניים בהשוואה דגימות שליטה. בתורו, אימונוהיסטוכימיה עם סמן אפופטוזיס, caspase-3, לא הניב שום הבדל משמעותי בין TMZ שטופלו דגימות glioma לבין דגימות הביקורת (איור 3). השפעת טיפול עם TMZ התאפיינה יותר על ידי שילוב זה יחד עם assay explant או בתרבות חוץ גופית או cytometry הזרימה. באופן ספציפי, אנחנו ביקשו לקבוע את ההשפעה על תאים כמו בתאי גזע סרטניים (SCLTC). לכן, לאחר הטיפול intratumoral עם TMZ, הופענו assay כדור להרכיב cytometry זרימה של אלה explants הגידול. TMZ שטופלו דגימות היו ניתק לתוך תאים בודדים בודדים אלה תאים בודדים היו זורעים בצפיפות נמוכה (1 תאים לכל microliter או התחתון) של צלחות 96-היטב במדיום סרום ללא בתוספת bFGF ו EGF. בקבוצת הביקורת, היווצרות הגידול בתחומים מן explants הגידול נצפתה לאחר דגירה 7 יום. בהתחשב בכך היווצרות כדור הוא מאפיין של SCLTC 3 4, שינויים במספר תחומים הגידול על ידי טיפול בתרופה מעיד על השפעה על SCLTC. באופן דומה, cytometry זרימה של explants הגידול ניתק עם סמן תא השטח, CD133, בוצע כדי לוודא את ההשפעה על SCLTC. אם SCLTC בתאי גידול הטרוגניות GBM הושרשו סלקטיבי על ידי טיפול תרופתי, ניתן לנבא כי cytometry זרימה אמור לזהות ירידה של שבריר CD133 חיובי על ידי טיפול (מידע לא מוצג). <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="איור 1"/> Figure.1 תמונות תהודה מגנטית (MRI) של GBM חולה. דמויות נציג מבצע טרום איור-1a שלאחר הניתוח איור-1b. איור-1c הוא H &amp; E מכתים המדגם GBM טרי רקמות. ההגדלה המקורי, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור. 2 זרם ניסיוני של הניסוי תרבות לחסום. באיור-2a. תמונה של GBM כירורגית טרי שהתקבלו המחלקה לפתולוגיה. איור מראה Dissection-2b של גוש הגידול לחתיכות קטנות 10mm בלהב כירורגי לעזור. איור-2c היא (TMZ) תרופה לטיפול בלוקים הגידול באמצעות מזרק אינסולין. ה 3 &quot;/&gt; איור. 3 אימונוהיסטוכימיה. אימונוהיסטוכימיה של גושי רקמה GBM הזריקו DMSO או TMZ עם הפעלת caspase-3 ו Ki67. Hematoxylin שימש מכתים גרעיני. ההגדלה המקורי, 40X.

<ol>
	<li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors.">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li><li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats.">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li><li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors,+including+brain+tumor+stem+cells.">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li><li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma.">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis,+delineate+a+pattern+of+disease+progression,+and+resemble+stages+in+neurogenesis.">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li><li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation.">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li><li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines].">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li><li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions.">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li><li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells.">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li><li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab:+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice.">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

קיים פער בין יעילות התרופה ב טרום קליניים המודלים הנוכחיים ניסיוניים את יעילות בחולים. באופן ספציפי יותר, בשדה גידול במוח מחקר, שיטות הרומן ואמין נדרשים שיעזור למלא את הפער הקיים בין הערכת התרופה עם השיטות הקיימות ואת יעילות בחולים. Assay המתוארים במחקר זה הוא נכס נוסף, אם לא פתרון, כדי להקל על מילוי הפער של נתונים ניסיוניים תוצאה של חולים מושפע. בתרבויות במבחנה תא מעדיפים להרחיב את התא סוגי גידולים מסוימים, ללא קשר לתנאי התרבות, מייצגים רק subpopulation של הגידול כולו. 5 בנוסף, שינוי גנטי פנוטיפי של התפשטות תאים מלאכותיים מתרחשת היא בלתי נמנעת עם לטווח הארוך בתרביות תאים . אחד המכשולים העיקריים לטיפול glioma ממאיר הוא ההטרוגניות של תאים סרטניים, הן בתוך הגידול יחיד בין דגימות גידולים 6, 7. לכן, העשרה סלקטיבית של אוכלוסיה מסוימת של תאים סרטניים, ללא תלות בסוג זה או אחר, לא יכול להיות אמצעי מתאים כדי לקבוע את היעילות של תרופות כימותרפיות על כל התאים הסרטניים הטרוגנית. 8 9 כל מודל חיה של גידולים במוח נגזר subpopulation של תאים סרטניים לשפוך אור על יעילות התרופה על subpopulation, אבל לא את הגידול כולו. מספר מגבלות, מצד שני, עדיין נשארים בשיטה זו explant הגידול. מגבלה אחת כזו היא תקופה קצרה יחסית של טיפול. מאז תאים סרטניים ממאירים נחשבים לרכוש עמידות ביותר, אם לא כולם, טיפולים לאורך זמן, שליטה ראשונית של צמיחה לטווח קצר תאים סרטניים לא יכול להיות לידי ביטוי פרוגנוזה לטווח ארוך של המטופל, כפי שדווח לאחרונה עם אנטי סוכן angiogenic, 10 bevacizumab. לכן, שיפור של פרוטוקול עבור assay זה explant לשמר רקמות לתקופה ארוכה יותר יש צורך בחקירות נוספות. שאלה נוספת היא השפעה ספציפית של תרופה נבדק על SCLTC בגידול. בהתחשב בכך SCLTC עמידים יחסית בפני טיפולים שוטפים עבור glioma ממאיר, זיהוי של תרופות נוגדות סרטן רומן potently לבער SCLTC היא מוצדקת. בהקשר זה, אנחנו כרגע מחפשים לשלב זה assay explant עם הבאים בניסויים במבחנה, כגון assay להרכיב neurosphere (מידע לא מוצג). אנו מצפים ללמוד יותר על ההשפעות, אם בכלל, של מועמד התרופה על SCLTC באמצעות מבחני אלה גם יחד. לבסוף, בעזרת קוביות קטנות של דגימות הגידול לא יכול לשקף את התא אוכלוסיות שלמות הגידול, כפי שקורה עם תא קווי רגיל או תרבויות הגידול העיקרי של דגימות כירורגית. נושאים אלה בצד, שמירה stroma הגידול, כולל נישה כלי הדם, מסייע באפיון הגורמים הסביבתיים על תאים סרטניים. לכן, assay זה עשוי להיות פוטנציאל להעריך כל אסטרטגיות טיפוליות תחת מצב יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. כאן, הקמנו assay לבדיקת יעילות התרופה עם explants דגימות כירורגית של GBM. למעשה, עם דגימות כירורגית שנבדקו, מצאנו כי הזרקה ישירה של TMZ מפחית שגשוג של דגימות GBM. שיטה זו explant רקמות ישים תיאורטית סרטן מוצקים אחרים ומספק הנכס כדי לקבוע יעילות התרופה על גידול של המטופל, אשר בתקווה לעזור לנו למנוע עוד כישלון בניסויים קליניים עבור סרטן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> עוברית שור סרום, מוסמך, חום מומת </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) נוזלי 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar-agar מטוהרים, מגורען </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS עבור מכתים </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> Richalrd אלן מדע </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% w / v caspase-3 פורמלין </td><td> Ricca חברת כימיקלים </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspase-3 </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> סיגמא </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> דמיינו מערכת אנטי העכבר </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> דמיינו מערכת נגד ארנב </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-Kit </td><td> וקטור מעבדה. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> טבלה 1. חומרים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 6 ובכן פלייט </td><td> גריינר ביו one </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> צלחת פטרי </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> סרולוגית פיפטה </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> סנן טיפים </td><td> ארה&quot;ב מדעי </td><td></td></tr><tr><td> פוליאסטר 500 מיקרומטר רשת Netwell להכניס </td><td> שחקן המשנה </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel מטריקס </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD מזרק 10 מ&quot;ל </td><td> BD מדעי החיים </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> מחט המזרק אלומיניום Hub. </td><td> טייקו בריאות </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> תרבות רקמות צפחת </td><td> קורנינג </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה צינורות </td><td> Basix </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> קיר דק צינורות </td><td> איטון </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> כירורגי Blade נירוסטה </td><td> נוצה </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> מזרק אינסולין </td><td> נוחות נקודה </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל כובע שטוח העליון בורג צינור </td><td> Basix </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Dissection מיקרוסקופ </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> אולימפוס </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> המלקחיים </td><td> פישר Sci </td><td></td></tr></table> 2. טבלה ציוד.

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

טיפולים שוטפים עבור glioma ממאיר יש רק אפקט פליאטיבי. לפיתוח טיפולית, משוכה אחת היא אי התאמה של יעילות נקבע על ידי הנוכחית יעילות בדיקות סמים את היעילות על חולים. לכן, שיטות רומן אמין להערכת יעילות התרופה הם ערובה בשלב טרום קליניים. בתרבות במבחנה של רקמות הגידול, כולל שורות תאים, יש שינויים פנוטיפי, גנטית, epigenetic משמעותי בתאי סרטן נגרם על ידי הסביבה המלאכותית של תרבית תאים, אשר אולי לא משקפים את הביולוגיה של גידולים המקורי באתרם. מודלים xenograft עם העכברים immunodeficient גם יש מגבלות, כלומר, היעדר מערכת החיסון interspecies פערים גנטיים epigenetic ב microenvironment. הנה, אנחנו מדגימים שיטה חדשה באמצעות דגימות כירורגית של glioma ממאיר כאבני הגידול undissociated כדי להעריך השפעות הטיפול. כדי לאמת בשיטה זו, הנתונים עם סוכן קו ראשון הנוכחי כימותרפיות, temozolomide (TMZ), מתוארים. השתמשנו הדגימה שאך להסיר כירורגית של glioma ממאיר לניסויים שלנו. ביצענו הזרקה intratumoral של TMZ או לתרופות אחרות, ואחריו הדגירה ניתוח כירורגי על דגימות. כאן, ביקשנו להקים שיטת הגידול explant רקמות כפלטפורמה כדי לקבוע את יעילותם של טיפולים נגד סרטן הרומן, כך נוכל להתגבר, לפחות, חלק מן המגבלות הנוכחיות למלא את הפער הקיים בין הניסוי הנוכחי נתונים על יעילות על גידול של המטופל בפועל. שיטה זו עשויה יש פוטנציאל להאיץ זיהוי תרופות כימותרפיות חדשנית לטיפול בסרטן מוצק.

Watch this Scientific Journal Video about Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens at JoVE.com

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

כאן, הקמנו שיטה לבדיקת יעילות התרופה עם דגימות כירורגית של גידולים במוח, המכונה &quot;שיטת explant הגידול&quot;. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להעריך את יעילות התרופה בלי לשבור את microenvironment של גידולים מוצקים. כדי לאמת את האמינות של שיטה זו, אנו מתארים נתונים עם נציג הדגימה glioma שלנו שטופלו הסוכן קו ראשון הנוכחי כימותרפיות, temozolomide.

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

method-for-novel-anti-cancer-drug-development-using-tumor-explants

Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K Views.  The Ohio State University Medical Center. כאן, הקמנו שיטה לבדיקת יעילות התרופה עם דגימות כירורגית של גידולים במוח, המכונה "שיטת explant הגידול". באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להעריך את יעילות התרופה בלי לשבור את microenvironment של גידולים מוצקים. כדי לאמת את האמינות של שיטה זו, אנו מתארים נתונים עם נציג הדגימה glio...

Video: Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

ניתוח של דגימות כירורגית transcriptomic רשתית אדם שימוש Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

מודל גידול מאוס של מתח כירורגי כדי לחקור את המנגנונים של דיכוי מערכת חיסוני לאחר ניתוח והערכת immunotherapies Perioperative רומן

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

מודל Murine רומן של אי מורסה arteriovenous: ההליך הכירורגי בהרחבה

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.