Los cánceres de la región de la cabeza y el cuello son cada vez más frecuentes. Sin embargo, hay una comprensión limitada del microambiente tumoral y los mecanismos de resistencia al tratamiento en esta región. Esta técnica se puede utilizar para recapitular el microambiente nativo de tumores de cabeza / cuello de una manera accesible y produce manifestaciones clínicas similares a las observadas en los seres humanos.
Cuando el cultivo celular tumoral haya alcanzado el 70% de confluencia, lave las células tres veces con PBS frío por lavado y conecte las células con suficiente 0,25% de trippsina para cubrir la superficie inferior del matraz de cultivo. Después de tres a cuatro minutos en la incubadora de cultivo celular, confirme el desprendimiento bajo un microscopio ligero y neutralice la trippsina con 12 mililitros de DMEM F12 medio, complementado con suero bovino fetal. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros y mezcle las células de tres a cuatro veces por inversión.
Luego recoger las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en suero y DMEM libre de antibióticos en un uno por 10 a las sextas células tumorales por cada 50 microlitros de concentración media en hielo. Inmediatamente antes de la inyección, mezcle las células en una unidad de matriz de membrana de una a una a una célula tumoral en hielo. Cargue una jeringa de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 23 con 100 microlitros de células por animal receptor.
Coloque las jeringas sobre hielo y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro. A continuación, inserte la aguja en la región bucal derecha o izquierda a través del espacio abierto disponible a ambos lados de la boca manteniendo la jeringa paralela a la región bucal mientras está dentro de la cavidad oral para facilitar la inyección del volumen completo de 100 microlitros de la suspensión de la matriz de membrana del sótano celular durante un período de cinco segundos. Mantenga la jeringa en su lugar durante cinco segundos adicionales para asegurarse de que todo el material se ha inyectado antes de retirar la jeringa suavemente.
Los tumores se volverán muy visibles en aproximadamente una semana. Una semana después de la inyección, utilice pinzas para medir la longitud y el ancho de cada tumor para determinar el volumen tumoral de una a dos veces por semana. Y medir el peso de cada animal para evaluar los efectos del crecimiento tumoral en la alimentación.
En el punto final experimental adecuado, utilice tijeras afiladas y fórceps contundentes para hacer una incisión cutánea a través de la línea media en el cuello. E inserte las tijeras suavemente debajo de la piel que cubre el tumor para crear bolsas de aire empujando las tijeras a través y en la piel. Una vez que la piel está lo suficientemente desprendida del tumor, extirpa los ganglios linfáticos drenantes para evitar que el tejido tumoral se confunda por la presencia de tejido linfático y atraviesa los bordes del tumor hasta que todo el volumen se desprende.
Para procesar el tumor para el análisis aguas abajo, corte el tumor en trozos de uno a dos milímetros y coloque las piezas en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga colagenasa tres, DNA uno e inhibidor de la trippsina. Después de incubar las piezas tumorales a 37 grados Celsius durante 30 minutos, con temblores cada 10 minutos, añadir 20 mililitros de HBSS al tubo y pasar la suspensión que contiene las piezas tumorales a través de un colador de nylon de 70 micrómetros verter. Utilice un émbolo de jeringa de cinco mililitros para triturar las piezas tumorales en el colador y añadir 10 mililitros adicionales de HBSS a través del colador.
Gire las células por centrifugación. Re-suspender el pellet en dos o tres mililitros de tampón de lysis de glóbulos rojos con pipeteo riguroso, neutralizando la lelisis con 20 mililitros de HBSS fresco después de dos minutos a temperatura ambiente. Luego vuelva a suspender las células en 20 mililitros adicionales de HBSS para otra centrifugación y tensar las células a través de un filtro de vertido de 40 micrómetros para eliminar cualquier residuo final de la suspensión de la célula tumoral.
Los tumores LY2 crecen a una tasa más alta, en comparación con los tumores B4B8. Y los ratones que presentan desplazamiento de la mandíbula desarrollan rápidamente pérdida de peso, debido a la disfagia. La mediana de supervivencia en ratones LY2 también es inferior a la mitad que se observó para ratones portadores de tumores B4B8.
La resonancia magnética de ratones portadores de tumores muestra tumores bien demarcados que se extienden a la capa interna de la mucosa bucal, pero no a la lengua u otros órganos cercanos. El examen histológico indica que todos los ratones portadores de tumores LY2 desarrollan carcinoma de células escamosas mal diferenciados, mientras que los ratones con tumores B4B8 desarrollan carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciadas. Todos los ratones con tumor LY2 también tienen necrosis confirmada histológicamente, y la mayoría demuestra necrosis de moderada a grave.
En este experimento representativo, un tumor LY2 fue cosechado y procesado tres semanas después de la inyección de células tumorales de la región bucal, como se demostró. Las células inmunitarias CD45 positivas representaron el 7,3% de la población total de células tumorales. Las células mieloides CD11b positivas representaron el 37,8% de todas las células positivas CD45, la mayoría de las cuales se determinó que eran macrófagos positivos a F480, y también se observaron pequeñas poblaciones de neutrófilos y células supresoras derivadas de mieloides.
Las células T comprendieron el 15,9% de la población de células inmunitarias CD45 positivas, de las cuales el 53,4% eran células T reguladoras de FoxP3 positivas CD4. Las células asesinas naturales comprendían menos del 2% de todas las células cd45 positivas. Es importante practicar la inyección para desarrollar confianza y comodidad en la sujeción de la aguja y el ratón receptor y en la exposición de la boca del animal.
Una vez que el procedimiento se ha realizado con éxito, se pueden realizar experimentos que impliquen la evaluación de la respuesta tumoral a la terapia o la evaluación del tumor de factores intrínsecos y microambientes. Esta técnica ha allanado el camino en el diseño de un ensayo clínico iniciado por el investigador, evaluando los efectos de la combinación de radioterapia con terapia anti-PL1 en pacientes con cáncer de cabeza y cuello.
