Me gustaría agradecer a la Dra. Jennifer Curtiss de las imágenes de la figura. 1 y Jeremy Fagan y el Dr. Florencia Marlow para la lectura crítica del manuscrito. Nuestro trabajo es apoyado por el NIH subvención 1R01GM088202.

1. Volar disección cabeza <ol><li> Asegúrese de tener todos los materiales a mano (incluidos los portaobjetos recubiertos de gelatina). Preparar glutaraldehido y fijadores de osmio (ver más abajo). Por genotipo de integrar, alícuota de 200μl solución de arreglo de glutaraldehído en tubos de 1,5 ml en hielo. </li><li> Anestesiar a las moscas en la plataforma de CO 2 (por lo general diseccionar siete cabezas vuelan a incorporar seis por genotipo en el caso de un jefe se destruye durante el procedimiento). </li><li> Mantener y presione ligeramente el tórax de la mosca, la parte dorsal para arriba, con las pinzas y el uso de un escalpelo afilado para cortar la cabeza. </li><li> Estabilizar la cabeza de mosca al tocar el cuello con las pinzas y con cuidado rebanar una pequeña parte de un ojo. Esto aumenta la penetración del fijador (si tiene intención de utilizar su buen ojo para las secciones de análisis clonal, le cortó el ojo con los clones no o menos). Evite tocar y dañar el ojo intacto que posteriormente se seccionó. </li><li> Toque la cabeza con unas pinzas o bisturí sobre la superficie del corte del ojo y la transferencia de la cabeza en fijador de glutaraldehído / fosfato en el hielo (los jefes suelen flotar en la superficie del aislante) Las cabezas disecadas no deben ser mantenidos en solución de glutaraldehído durante más tiempo de 15 minutos antes de la adición de osmio. Repita los pasos 1.2 a 1.5 con las otras moscas del mismo genotipo. </li></ol> 2. Fijación e inclusión (uso de guantes para todos los pasos!) <ol><li> Haga girar la flyheads en centrífuga Eppendorf durante 1 minuto a 10.000 rpm. Continuar, incluso si los jefes no se hunden. </li><li> Agregar 200μl de solución de OsO 4 y fijar, por lo menos 30 minutos y hasta 1 hora en hielo. </li><li> Con una pipeta Pasteur, retire la solución de glutaraldehído / osmio (asegúrese de usar los procedimientos adecuados de eliminación de residuos!) Y reemplazar con la solución de osmio 200μl. Incubar en hielo durante 1-6 horas. Asegúrese siempre de que las cabezas están completamente cubiertos con el líquido y no eliminar toda la solución, como la cabeza o los ojos se derrumbaran! </li><li> Con una pipeta Pasteur, deseche el fijador, se añaden 0,5-1ml etanol al 30% e incubar durante al menos 5 minutos en hielo (asegúrese de usar los procedimientos adecuados de eliminación de residuos ya que el etanol contiene osmio ahora!). </li><li> Repita el paso anterior con un 50%, 70%, (80%), 90% y el doble de etanol al 100%. Incluir la etapa de etanol al 80% si se utiliza la vista para el análisis de microscopia electrónica. Después de la etapa de lavado del 70%, las muestras se pueden quitar el hielo. </li><li> Vuelva a colocar el etanol con un volumen igual de óxido de propileno (volátiles, seguir trabajando en la campana). Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Repetir el lavado de óxido de propileno. Trabajar por lotes, si el procesamiento muchos genotipos en paralelo para evitar el colapso de los ojos debido a la evaporación del óxido de propileno. </li><li> Eliminar la mayor parte del óxido de propileno y con una pipeta de transferencia de plástico, añadir unos 500μl de una relación 1:1 de resina: La solución de óxido de propileno. Equilibre la noche a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Incrustación y su colocación en moldes <ol><li> Asegúrese de que todos los moldes están etiquetados para el seguimiento de sus genotipos diferentes, llenar los moldes con el 100% de resina. No llene en exceso (no &#39;montes altos &quot;sobre la superficie de los moldes cuando se mira directamente a través de la superficie del molde). El uso de resina dura para el análisis de EM. </li><li> Con una pipeta de transferencia, eliminar la resina 50% de los jefes, reemplace con un 100% de resina, e incubar durante 3-4 horas a temperatura ambiente. Mientras los jefes están infiltradas con resina, que se hunden hasta el fondo del tubo. </li><li> Con un palillo que se ha visto afectada en una superficie dura una vez para crear un pequeño gancho, la transferencia de una cabeza en el momento en un molde. </li><li> Coloque papel de aluminio en la zona de trabajo de su microscopio de disección para proteger contra derrames de resina. </li><li> Utilizando una aguja de disección y buscando aunque su ámbito de aplicación, haga girar la cabeza un poco en la resina y con cuidado se mueven en el fondo del molde cerca de la punta. </li><li> Alinee cuidadosamente la superficie de la intacta (!) Ojo (o su futuro avión de seccionamiento, si usted quiere tener secciones transversales) del cuello hacia abajo con la pared frontal del molde, asegurándose de mantener la superficie tangencial de los ojos aproximadamente la mitad de una cabeza diámetro de la pared del molde. En casos raros, un colapso del ojo que puede ser visto como un espacio vacío entre la superficie del ojo y la cabeza de la cutícula. Si usted tiene un ojo se derrumbó, reemplazarlo por el ojo 7 de repuesto. </li><li> Repita el procedimiento con todos los jefes. Una vez hecho esto con todas las alineaciones, vuelva a revisar todos los ojos para asegurarse de que no se movió al extraer la aguja de la resina. </li><li> Si tiene problemas con los ojos en movimiento cuando se quita la aguja de disección, la posición del ojo como se desee, de forma rápida retracción de la aguja un poco lejos de la cabeza y luego extraer la aguja lentamente por completo. </li><li> Hornee los moldes durante la noche a 70 ° C. </li></ol> 4. Corte y seccionamiento <ol><li> Retire los bloques endurecidos de los moldes por la flexión de los moldes, keeping pista de qué bloque se corresponde con el genotipo (por ejemplo, tienda en viales de centelleo pequeño). </li><li> Para cortar, usar un plato apropiado para su microtomo que se monta boca arriba sobre un bloque de metacrilato o el aluminio. Monte el bloque de ajuste, hasta los ojos, en el plato. </li><li> En el ámbito de disección utilizando una navaja de afeitar teflón mandó, corte con cuidado sólo la capa superior de su bloque. Esto dejará una superficie transparente a través del cual usted debe ver el ojo y por lo tanto se puede predecir el futuro avión de la sección. Evitar cortar los dedos! </li><li> Cortar el exceso de plástico en ambos lados de la cabeza y en el frente (es decir, lo que solía ser la parte superior del molde cuando la alineación de los ojos) hasta que la mayoría del plástico en la cabeza es cortada. Lo mejor es acercarse poco a poco la cabeza, cortando varias capas delgadas de plástico. </li><li> Usando una hoja de afeitar limpia, retirar con cuidado las capas delgadas de la parte superior del ojo en el plano exacto que desea para más adelante (por lo general tangencialmente a la vista, con una ligera inclinación de la superficie del molde original). </li><li> Continúe hasta que usted acaba de empezar a cortar la superficie externa del ojo. Asegúrese de utilizar las áreas limpias de la hoja para obtener una superficie brillante, transparente, lo que hace más fácil la alineación en el microtomo. </li><li> Para ahorrar en cuchillas de afeitar, cuchillas de mayor uso para el crudo de recorte alrededor de los lados del bloque y el uso de una hoja fresca de la corte fino (primer corte y 4.6). Al final, usted tendrá una pirámide de tres lados con una ligera inclinación, de corte superior que corresponde a su plano de sección en el futuro. </li><li> Monte el bloque en el microtomo. Corte real puede variar dependiendo del tipo de microtomo y no se describirán en detalle aquí. Utilizamos un Sorvall MT5000 con un cuchillo de diamante para cortar histo calidad de 0,5 a 1μm secciones. Para el análisis microscópico de luz, pequeñas variaciones en el espesor de corte no tienen importancia. Si clones corte marcado por una sección blanca + transgén, 1μm secciones para asegurarse de tener suficiente gránulos de pigmentos junto a la rhabdomeres por sección (Fig. 2). </li><li> Secciones flotan sobre el agua. Levante primeros 20-30 secciones con un extremo aplanado de un Q-tip de madera de debajo de la superficie del agua en un movimiento de rotación y transferirlos a una gota de agua sobre un portaobjetos de vidrio recubierto de gelatina (se guardan en una placa de calentamiento a unos 100 ° C ). </li><li> Repita con el otro 20 a 30 secciones. Espere hasta que el agua se haya evaporado y las secciones se adhieren a la diapositiva. Por lo general, las secciones de tres ojos dispuestos en tres columnas (tres ojos) por filas TWP (arriba / secciones inferiores) encajan bien en una diapositiva. </li></ol> 5. Tinción y análisis microscópico <ol><li> A menos que los clones de la sección, secciones mancha. Lugar de diapositivas con las secciones de un bloque de calentamiento fijado en 90 ° C. Prescindir de toluidina azul solución de tinción de una jeringa de 30 ml conectada a un filtro de 0.22μm sobre el portaobjetos y teñir durante 10 segundos. Lavar inmediatamente ampliamente con agua destilada. Aire seco. </li><li> Con una pipeta de transferencia de plástico, distribuir 3 gotas de DPX medio de montaje sobre el portaobjetos y un cubreobjetos. Parte superior con tres monedas de diez centavos y dejar que el medio de montaje endurecer (por ejemplo durante la noche a temperatura ambiente). </li><li> Imagen al microscopio de luz. Utilice un objetivo de 5x o 10x para encontrar una buena sección y luego cambiar a una lente de 63x de inmersión en aceite para su análisis detallado y la fotografía. Por lo general, utilizar la configuración de contraste de fase, pero la óptica de campo oscuro funciona tan bien. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Con más frecuencia, los ojos están incrustados en plástico para un análisis detallado de los ojos externos fenotipos áspera detectado como parte de un examen genético o en el proceso de las pruebas de interacciones genéticas con genes conocidos por afectar tanto a la estructura general de los ojos o la polaridad. Los resultados típicos de las secciones de los ojos se muestran en la Figura 3. De tipo salvaje omatidios (Fig. 3) muestran el complemento completo de los fotorreceptores, rodeado por un entramado de células pigmentarias. Por el contrario, en un estrabismo (stbm, también conocido como van gogh-7) mutante, la polaridad ommatidial se pierde y, a pesar de que el complemento completo de los fotorreceptores está presente, la rotación y la quiralidad son asignados al azar (Fig. 3B). Por otra parte, ya que el alelo seccionado stbm estaba en aw - fondo, los gránulos de pigmento no se encuentran en la figura. 3B. La figura 3C muestra un ejemplo de un análisis clonal. Drosophila Rho-cinasa (Drok) es necesario para la rotación ommatidial, así como para la integridad estructural del ojo 8. Homocigotos Drok dos clones se pueden identificar por la ausencia de pigmento en las células de pigmento y el rhabdomeres (por lo general, los clones son inducidas por el uso sin ojos-FLP y un P-elemento con un gen marcador fuertemente expresado blanco como complemento de una w de fondo - la mutación en la naturaleza tipo de tejido y heterocigoto). Por tanto, es posible identificar las áreas mutante por la falta de pigmento. Debido a la autonomía de las células de la pigmentación en la R-cells se mencionó anteriormente, los genotipos de cada uno de R-células puede determinarse (ver puntas de flecha en la figura. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. El ojo de Drosophila es un excelente sistema modelo para los biólogos, ya que, en contraste con la superficie lisa de un ojo de tipo salvaje (A), la superficie de un ojo mutante es externamente con frecuencia en bruto (B), indicativo de los fenotipos de los ojos subyacente . En todas las figuras, es anterior a la izquierda y dorsal está arriba. Imágenes cortesía de la Dra. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, EE.UU.. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Luz imágenes microscópicas de una sola omatidios seccionado utilizando el método descrito. Sólo siete R-células son visibles a la vez por omatidio, ya que R7 se encuentra en la parte superior del R8. (A, A &#39;) En el plano R7, el cuerpo celular de R7 se detecta entre R1 y R6 (flecha amarilla en A&#39;). En contraste, a nivel R8 (B), el cuerpo celular de R8 se detecta entre R1 y R2 (flecha amarilla en B &#39;). Puntas de flecha azul marca los gránulos de pigmento que se puede utilizar como un marcador de pigmento en células autónomas. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Tangencial a través de las secciones de tipo salvaje (A), stbm (B) y Drok (C) los ojos de adulto mutante de Drosophila. Esquemas a continuación las secciones indican la polaridad de omatidios (ver (A) para las flechas). Los círculos representan omatidios con defectos en la dotación de los fotorreceptores. Las líneas amarillas representan la línea dorsal / ventral de la simetría (ecuador). En contraste con los omatidios bien orientado de tipo salvaje (A), la organización plana que se pierde en el mutante stbm (B). Tenga en cuenta que la sección de los mutantes stbm muestra carece de pigmento debido a su w - fondo mutante. (C) Debido a que las mutaciones son letales Drok, tienen que ser analizados en los clones. Así, las células pigmentadas de tipo salvaje o heterocigotos (lleno de puntas de flecha azul), mientras que R-carece de células pigmentarias (abierto puntas de flecha azul) son mutantes homocigotos. Además de los defectos de rotación, los mutantes Drok también muestran defectos estructurales, incluidos los números faltantes o en exceso de la R-células. Tenga en cuenta que para el análisis clonal, las secciones no están marcados para evitar ocultar los gránulos de pigmento.

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No hay conflictos de interés declarado.

Con Drosophila como organismo modelo, las pantallas de genética llevó a la identificación de muchos de los miembros fundadores de familias de genes esenciales para la mayoría de las vías de señalización altamente conservados en eucariotas superiores incluidos los seres humanos. Ya que, en condiciones de laboratorio, un ojo funcional es prescindible para la supervivencia, el ojo es un tejido especialmente adecuado para el descubrimiento de las funciones de genes nuevos y la evaluación de las redes genéticas. El análisis ultraestructural del ojo de la mosca utilizando el método descrito así a los descubrimientos fundamentales relevantes para el desarrollo y la enfermedad. Inicialmente, el análisis clonal de células individuales se realizó a través de rayos X combinada con clones inducidos por conocidos estrechamente asociado células autónomas marcadores recesivos. Más recientemente, la disponibilidad del sistema de FLP / FRT para generar clones ha facilitado enormemente el análisis fenotípico de las mutaciones letales en 6,9 secciones ojo. El análisis de las secciones del ojo no se limita a los cortes tangenciales se describe aquí. Si lo desea, los jefes pueden ser alineados en cualquier orientación en los moldes y las secciones transversales se pueden obtener para estudiar las capas más profundas en la cabeza, como la lámina y la médula. El protocolo se describe aquí es, pues, un método versátil para el análisis de las estructuras de los adultos los ojos y la cabeza de Drosophila.

Equipos de uso general: <ul><li> Para la cría de moscas en general véase el punto 10 </li><li> Microscopio de disección estándar (por ejemplo, Nikon SMZ-645 microscopio estéreo con zoom), preferiblemente con una fuente de luz del anillo para evitar que una sombra de tus manos. </li><li> CO 2 Fly almohadilla, cubierto con papel Whatman 3MM para proporcionar una protección contra la suciedad durante la disección. </li><li> Portaobjetos recubiertos de gelatina: se disuelven 10 g de gelatina y 1 g CrKSO 4 x 12 H 2 O en 1 litro de agua en una placa calefactora (llevar casi a punto de ebullición, es de aproximadamente 2 horas). Dip se desliza bien lavados (jabón) y enjuagados (DH 2 O) en los titulares en la solución de gelatina y aire seco cubierto con papel de aluminio durante la noche. </li><li> Horno de calentamiento (70 ° C; los antiguos hornos de vacío que se utiliza para el secado de nitrocelulosa filtro son adecuados para este propósito). </li><li> Capaz de seccionamiento ultrafino (0,5 a 1 m de espesor) microtomo, por ejemplo, los utilizados por las instalaciones de microscopía electrónica. Utilizamos un Sorvall MT5000 ultramicrotomo con un cuchillo de diamante Histo calidad. Cuchillas de vidrio, también funcionan. </li></ul> Soluciones de fijación: <ul><li> Prepare una solución madre de tampón fosfato 0,2 M de sodio, pH 7,2. </li><li> Preparar glutaraldehido al 2% en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2 (se puede almacenar a 4 ° C durante 4 semanas). Hacer por lo menos lo suficiente para tener 200μl por genotipo que desea incrustar. Mantener en hielo. </li><li> Solución de osmio: 2% OsO 4 en tampón fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2. Haz sólo lo suficiente para tener 200μl por genotipo desea incrustar, ya que la solución no se puede almacenar. Mantener en hielo. </li></ul> Glutaraldehido y OsO4 son altamente tóxicos y deben manejarse con extremo cuidado en una campana bien ventilada. Use las puntas de filtro cuando se manejan OsO4 para evitar el ennegrecimiento de la pipeta. Deshidratación: Hacer 30%, 50%, 70% (80%), 90% y 100% de soluciones de etanol. Preferentemente fresco 30%, 50%, 70% de etanol en el hielo antes de su uso. Solución de tinción: 1% de toluidina y azul en el 1% bórax. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Suave </th><th> Duro </th></tr><tr><td> Una resina </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Endurecedor B </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Acelerador de C </td><td> 2.5g </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Plastificante D </td><td> 10g </td><td> 0,75 g </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Resina de preparación Para preparar la resina, con cuidado, pero mezcle todos los ingredientes en un vaso de plástico con un agitador magnético con una barra de agitación general. Evitar las burbujas. Después de alícuota de la mezcla, en viales de centelleo estándar o recipientes similares y congelar a -20 ° C. El uso de resina suave para todas las aplicaciones a menos que su instalación de EM pide la formulación más difícil. Use guantes para manipular la resina (cancerígenos en su forma polimerizada). Para polimerizar la resina en el equipo y los desechos, cocer al horno a 70 ° C durante la noche. Después, el desecho puede ser descartado con seguridad y equipos de limpiar y reutilizar. Resina derramada no polimerizado se puede limpiar con isopropanol. <table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Proveedor </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Volar pad </td><td> por ejemplo, Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldehído </td><td> Sigma </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OsO4 </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Óxido de propileno </td><td> Pescador </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> Bisturí se encarga, por # 3 </td><td> Pescador </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> Hojas de bisturí # 11 </td><td> Pescador </td><td> 08 a 916-5B </td></tr><tr><td> Pipetas de transferencia </td><td> Pescador </td><td> 13-711-7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM resina </td><td> Sigma (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> De acero de disección aguja </td><td> Pescador </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEM molde incorporación de planos </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencia. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> Teflon hojas de afeitar recubierto </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencia. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-tip (hisopos estériles) </td><td> Pescador </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio </td><td> Pescador </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> Cubreobjetos n º 1, 22X60 mm </td><td> Pescador </td><td> 12-531k </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Pescador </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodecahidrato </td><td> Sigma </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> Diamante Histo cuchillo, 6mm </td><td> Diatome EE.UU. </td><td> 60-Su </td></tr><tr><td> Azul de toluidina O </td><td> Pescador </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> El bórax (Na-tetraborato) </td><td> Pescador </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX medio de montaje </td><td> Sigma </td><td> 44.581-100ML </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Materiales

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

Drosophila ha sido utilizado como sistema modelo para estudiar el desarrollo, principalmente debido a la facilidad con que es manejable de forma genética. Con los años, una gran cantidad de cepas mutantes y trucos técnicos se han desarrollado para permitir a las preguntas sofisticado para ser formuladas y contestadas en un plazo razonable de tiempo. Idea fundamental en la interacción de los componentes de todas las conocidas vías principales de señalización que se haya obtenido en avance y retroceso de los estudios genéticos Drosophila. El ojo de la mosca ha demostrado ser excepcionalmente adecuado para el análisis de las mutaciones, ya que, en condiciones de laboratorio, las moscas pueden sobrevivir sin los ojos funcionales. Además, la superficie del ojo de un insecto se compone de alrededor de 800 ojos de cada unidad (o facetas omatidios) que forman una superficie regular, lisa cuando se observan bajo un microscopio de disección. Por lo tanto, es fácil ver si una mutación podría afectar el desarrollo del ojo o el crecimiento por el exterior en busca de la pérdida de la superficie lisa (fenotipo &quot;ojo áspera; Fig. 1.) O el tamaño total del ojo, respectivamente (para ver ejemplos de pantallas basadas en la morfología externa del ojo ver, por ejemplo 1). Posterior análisis detallado de los fenotipos de los ojos requieren la fijación, la incorporación de plástico y delgado corte de los ojos de un adulto. El ojo de Drosophila se desarrolla desde el disco de los ojos llamada imaginal, una bolsa de las células epiteliales que proliferan y se diferencian en las etapas de larva y pupa (para revisión ver por ejemplo 2). Cada ommatidio consta de 20 células, entre ellas ocho fotorreceptores (las células de relaciones públicas o R;. Fig. 2), cuatro secreción de lentes células conos, células pigmentadas (&quot;hexágono&quot; en torno a R en células de racimo) y una cerda. Los fotorreceptores de cada ommatidio, más fáciles de identificar por sus orgánulos sensibles a la luz, el rhabdomeres, se organizan en un trapecio formado por los seis &quot;de afuera&quot; (R1-6) y dos &quot;interior&quot; fotorreceptores (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] se encuentra debajo de R7 y por lo tanto sólo se ve en las secciones de las zonas más profundas del ojo). El trapecio de cada faceta es precisamente alineados con los de sus vecinos y los ejes anteroposterior y dorsoventral general del ojo (Fig. 3). En particular, el omatidios de la dorsal y ventral (flechas de color negro y rojo, respectivamente) mitades de los ojos son imágenes especulares uno del otro y se corresponden con dos formas quirales de señalización establecidos en la polaridad celular plana (para una revisión véase, por ejemplo 3). El método para generar semi-delgadas secciones de los ojos (como los presentados en la Fig. 3). Describe aquí es ligeramente modificada de la que inicialmente se describió por Tomlinson y Ready 4. Permite el análisis morfológico de todas las células, excepto para las células cono transparente. Además, el pigmento de las células de R-(puntas de flecha azul en la figura. 2 y 3) se puede utilizar como un marcador de células autónomas para el genotipo de un R-célula, por lo tanto las necesidades genéticas de los genes en un subconjunto de R-células pueden fácilmente se determinará 5,6.

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Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Un enfoque estándar para preparar a los adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ojos de semi-fino corte y el análisis al microscopio óptico se presenta aquí. El protocolo se puede utilizar para el análisis morfológico de los defectos del ojo, o con los ajustes indicados se puede utilizar para determinar los requerimientos de genética de genes en tipos celulares específicos del ojo (por ejemplo, análisis clonal de los fotorreceptores) o para el análisis de microscopia electrónica.

Preparación de los adultos Drosophila Ojos de seccionamiento fino y análisis microscópico

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

preparation-adult-drosophila-eyes-for-thin-sectioning-microscopic

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

16.0K vistas.  Albert Einstein College of Medicine. Un enfoque estándar para preparar a los adultos Drosophila Los ojos de semi-fino corte y el análisis al microscopio óptico se presenta aquí. El protocolo se puede utilizar para el análisis morfológico de los defectos del ojo, o con los ajustes indicados se puede utilizar para determinar los requerimientos de genética de genes en tipos celulares específicos del ojo (por ejemplo, análisis clonal de los fotorreceptores) o para el análisis de microsco...

Video: Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

El corte delgado de los preparativos de círculo para inmunohistoquímica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Investigación

Biología

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Las grabaciones de células enteras del cerebro del adulto de Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

La disección de Gyrus dentado del hipocampo de ratones adultos

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Automated Charting of the Visual Space of Housefly Compound Eyes

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands of visual units called ommatidia. Each ommatidium samples the optical information from a small solid angle, with an approximate Gaussian-distributed sensitivity (half-width on the order of 1&#730;) centered around a visual axis. Together, the ommatidia gather the visual information from a nearly panoramic field of view. The spatial distribution of the visual axes thus determines the eye's spatial resolution. Knowledge of the optical organization of a compound eye and its visual acuity is crucial for quantitative studies of neural processing of the visual information. Here we present an automated procedure for mapping a compound eye's visual axes, using an intrinsic, in vivo optical phenomenon, the pseudopupil, and the pupil mechanism of the photoreceptor cells. We outline the optomechanical setup for scanning insect eyes and use experimental results obtained from a housefly, Musca domestica, to illustrate the steps in the measurement procedure.

The protocol here describes the measurement of the spatial organization of the visual axes of housefly eyes, mapped by an automatic device, using the pseudopupil phenomenon and the pupil mechanism of the photoreceptor cells.

Cartografía automatizada del espacio visual de los ojos compuestos de la mosca doméstica

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands ...

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Evaluación de la toxicidad química en adultos Drosophila melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...