Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Welch (I-1657) y el NIH (RO1EY18884). PRH es un erudito de Eugene McDermott en la investigación biomédica.

1. Introducción En este video, vamos a demostrar cómo preparar cerebro de Drosophila y retinas de imágenes en vivo e inmunohistoquímica con un enfoque en las células fotorreceptoras. En primer lugar, vamos a mostrar cómo prepararse para la disección del cerebro. A continuación, vamos a demostrar dos disecciones básicos comúnmente utilizados para inmunohistoquímica que forman la base para la preparación en vivo. Estas dos preparaciones son el cerebro adulto y disecciones del ojo. A continuación, vamos a demostrar la disección utilizado para imágenes en vivo del cerebro adulto y en desarrollo, con énfasis en su uso de imágenes en vivo de los fotorreceptores. Por último, se describe la forma en que el tejido de imágenes en vivo y mostrar algunos ejemplos de imágenes en vivo utilizando microscopía confocal de resonancia. 2. Disección de la preparación <ol><li> Para las disecciones bueno, usted necesita pinzas afiladas. El uso de un bloque de afilar o papel de lija muy fino (&gt; 1500), pasar suavemente la pinza de ida y vuelta en cada lado hasta que los extremos se encuentran en una punta fina. Utilizamos una piedra nivel de nitidez estándar. No vamos a cubrir la técnica de enfoque aquí, pero tenga en cuenta que las pinzas afiladas son esenciales para las disecciones en vivo. Afilamos fórceps antes de cada disección. </li><li> Para la disección del cerebro adulto, el lugar de las moscas en una plataforma de CO 2 para anestesiar y resolver el genotipo deseado. Para las disecciones de pupa, simplemente la mano en el frasco y retirar con cuidado una pupa con sus pinzas, teniendo cuidado de no romper la envoltura pupal. </li><li> Humedezca un Kimwipe con agua. Van a utilizar este durante la disección para eliminar los restos de su fórceps. Coloque un plato de disección en el escenario de un estereoscopio y llenarlo con una solución HL3. Todas las disecciones se llevará a cabo en HL3 para asegurarse de que el tejido se mantiene vivo y saludable durante el proceso de disección. Además, usamos un plato de disección que tiene una cubierta inferior de Sylgard para proteger fórceps durante la disección. </li><li> Ahora, preparar la fijación de solución si va a realizar la inmunohistoquímica. Lugar 180μL de HL3 en un tubo de microcentrífuga de 500μL. Añadir 20μL de formaldehído al 37% para obtener una solución de formaldehído al 3,7%. </li><li> Por último, la posición adecuada de las manos es importante para las disecciones buena. Con la posición de la mano buena, la pinza se firme y capaz de movimientos controlados y sutil. Primero, coloque la pinza en el lado del dedo pulgar. A continuación, llevar el dedo índice hacia abajo de tal manera que la punta del dedo se apoya en la parte superior. Ahora descansa al lado de la pinza en el lado del dedo medio y pasar al plato de la disección. Tener contacto físico con el plato de su dedo pulgar y el dedo medio. Mientras descansa el pulgar y el dedo medio en el plato, planta de la muñeca en la platina del microscopio. De esta manera, usted tiene tres puntos firmemente plantados en las superficies durante la disección y ahora es posible hacer manipulaciones muy sutiles de las pinzas. Esta técnica se puede sentir un poco incómodo al principio, pero con la práctica, que pronto será un maestro de la disección del cerebro. </li></ol> 3. Cerebro adulto <ol><li> En la plataforma de CO 2, orientar una mosca adulta lado ventral hacia arriba con la cabeza lejos de su mano. Coge el tórax, inmediatamente por debajo de la cabeza. Si se realiza correctamente, las piernas y la trompa se extiende. Al tiempo que visualiza en un estereoscopio, agarrar la trompa extendida con pinzas para quitar de la cabeza. Deseche el cuerpo y sumergir la cabeza. Reorientar a la cabeza sumergida. La disección completa se llevará a cabo en solución. Es muy importante mantener a la cabeza con unas pinzas en todo momento. De lo contrario, el jefe va a flotar y es difícil de recuperar. Si la cabeza se mueve fuera de foco durante la disección, sólo tiene que mover de nuevo en el plano focal, sin ajustar el microscopio. Esta tarea aparentemente simple puede ser difícil al principio, pero manteniendo la cabeza en el enfoque será más fácil el paso del tiempo. </li><li> Comenzar la disección, en primer lugar romper el tejido conjuntivo entre la trompa y el ojo. Lágrima en el ojo mientras se mantiene firme con al menos una pinza en todo momento. Asegúrese de que la punta de la pinza es justo debajo de la retina o cutícula, para evitar daños en la parte de abajo del cerebro. Alternando izquierda y derecha, utilice el fórceps para separarse de la retina, trabajando hacia la parte posterior de la cabeza. Arrancando la retina aumenta las probabilidades de que la lámina se mantiene unido al lóbulo óptico a lo largo de esta disección. Continuar por la parte trasera de la cabeza, lagrimeo cutícula en el camino. Lágrima en el ojo y otros que comienzan a separarse cutícula. Siempre y cuando se están apoderando de la cutícula, usted sabe que no están aplastando el cerebro! Con esto en mente, seguir para sacar la cutícula y la retina se desprenda hasta que el cerebro se pone de manifiesto. </li><li> Una vez que el cerebro es visible, se puede empezar a eliminar la tráquea conectado al cerebro (Fig. 1A). Continuar a tirar de la tráquea y la cutícula hasta que el cerebro está aislado. En este punto, se debe reorientar hacia el fondo de su plato para tque pasos restantes. Retire el resto de la tráquea, porque el cerebro de lo contrario pueden flotar durante el lavado de anticuerpos durante la noche. Para obtener imágenes de las terminales de los fotorreceptores, es conveniente mantener la lámina, pero tiene que quitar de la retina, que contiene los cuerpos celulares y los pigmentos fuertemente autofluorescentes. Para ello, tire con cuidado los restos celulares espesas y pigmentadas sin dañar la lámina. Esta es una habilidad más fino y requiere práctica. </li><li> El cerebro adulto puede ser mantenido con vida durante horas o incluso días con las condiciones que se discutirán en la sección 6. Por inmunohistoquímica, el cerebro adulto está listo para ser fijado en formol. 2 Utilice un pipetteman P20 establecido en 5μL para mover el cerebro de un adulto a la solución de fijación que ya ha preparado. Continúe la disección de los cerebros de adultos durante 20 minutos, que debe producir 4.10 cerebros. Deja el cerebro de fijar por un período adicional de 40 minutos, sin embargo, este plazo puede variar para la tinción óptima anticuerpo primario. Retire la solución de formaldehído y lavar el cerebro de 3 veces durante 5 minutos cada uno en 400μL de una solución de PBS y 0,4% TritonX-100, en lo sucesivo, PBS-Tritón. Después de terminar de lavar la solución de arreglo, es posible agregar la solución de anticuerpo primario. </li></ol> 4. Ojo adulto <ol><li> Comience esta disección se ha descrito para el cerebro adulto. Después de sumergir la cabeza y la reorientación del microscopio, empezar por romper el tejido conjuntivo entre la trompa y el ojo. Por encima de la trompa, aparte de la cutícula de los ojos. Ahora, separado de la cutícula de la parte inferior del ojo, trabajando hacia la parte posterior de la cabeza. Con una pinza, tomar el centro de la parte posterior de la cabeza. Con el otro, llaman la atención y tirar. Permitir que el ojo se depositan en el fondo del plato (Fig. 1B). La lámina es probable que permanece unido a la vista y se puede utilizar para obtener imágenes en directo de los terminales de las células fotorreceptoras completamente intacto en este momento. Para continuar con imágenes en vivo de los órganos de las células fotorreceptoras, vaya a la sección 4.5. Las tres secciones siguientes explican inmunohistoquímica ojos fijos. </li><li> Por inmunohistoquímica, mover el ojo a la fijación de solución con un conjunto de pipetteman P20 5μL. Continúe la disección de los ojos de un adulto para un total de 10 minutos. Dejar los ojos en la solución durante 30 minutos. Eliminar la solución de fijar y realizar lavados como se describe en la disección del cerebro adulto. </li><li> Si en última instancia, desean a la imagen de la estructura ommatidial del ojo de la lámina debe ser retirado ahora. Volver la mirada fija en su plato de disección y eliminar las células tráquea o grasa que aún se puede unir. A continuación, mientras mantiene la parte exterior del ojo con una pinza, retire la lámina con la otra. Se debe salir en una sola pieza, dejando al descubierto la cellbodies debajo (Fig. 1B). Tenga cuidado al agarrar la lámina única! De lo contrario, corre el riesgo de desprendimiento de los fotorreceptores de la retina. </li><li> El uso de un pipetteman P20, mover los ojos a 400uL PBS-Tritón en un tubo de 500 ul. Con cuidado, la roca a 4 grados durante la noche para eliminar el pigmento rojo autofluorescentes de los fotorreceptores. Al día siguiente, se puede descartar la solución de lavado y agregar la solución de anticuerpo primario. </li><li> Para imágenes en vivo de los ojos de un adulto y sólo la usamos moscas pharate adultos, es decir, las pupas de etapa tardía, poco antes de la eclosión. En esta etapa, los cuerpos de las células fotorreceptoras por separado desde las terminales de la lámina durante la disección. </li><li> Pharate adultos pupas tienen bien definidas las alas, ojos, y la cutícula visible a través de la envoltura pupal. Seleccione una pupa y eliminar la parte anterior de la cápsula de la pupa para exponer la región de la cabeza. Retire con cuidado la membrana delgada interior que encierra, además, la mosca en desarrollo. Coge la base de la cabeza con su pinza y tire. Deseche el resto de la pupa, mientras que mantener la cabeza sumergida. </li><li> Proceder como se demuestra en la disección de los ojos para inmunohistoquímica. En la etapa adulta pharate, sin embargo, los cuerpos de las células fotorreceptoras se desprenden más fácilmente de la lámina, lo que le permite a la imagen de los cuerpos celulares ubicado en la retina. Además, la lámina permanece unido al lóbulo óptico, lo que le permite a la imagen de la lámina distal. Si desea la imagen de la lámina proximal, donde los cartuchos de la terminal de fotorreceptores se puede observar, a continuación, realizar la disección del ojo de una mosca adulta, donde es más fuerte la lámina adjunta a la vista. </li></ol> 5. El desarrollo de los ojos del cerebro disco complejos <ol><li> El disco del ojo en desarrollo en un 20% el desarrollo pupal (P 20%) se ha convertido en uno de los favoritos para obtener imágenes en vivo en nuestro laboratorio, porque esta sola capa de células en desarrollo relativamente grande es fácilmente observable mediante microscopía confocal. 3 </li><li> Para seleccionar un 20% de pupa, busque los túbulos de Malpighi, un punto verde aparece debajo de la del caso de pupa, pupa y evitar que tengan un &quot;cuerpo negro&quot; 4. Después de seleccionar un sumergirse P +20% pupa, en HL3 en su plato de disección y retire con cuidado una porción anterior de la bolsa de pupa, teniendo cuidado deno para penetrar en la membrana interna delgada. Sujete la membrana interna con sus pinzas y se separan. </li><li> Con cuidado, buscar a través de los contenidos lanzado para encontrar el desarrollo del cerebro y los discos de los ojos que son muy prominentes (Fig. 1C). El ojo de disco complejo del cerebro que se separa fácilmente en esta etapa de la metamorfosis. Aislar el cerebro en la parte inferior de la placa de disección. Separar cuidadosamente el cerebro central del lóbulo óptico. La óptica del lóbulo / ojo disco se va utilizar en las imágenes en vivo. </li></ol> 6. Vivir de imagen: En el microscopio <ol><li> Si desea la imagen de un corto período de tiempo en sólo una o dos soluciones, es posible que la imagen de su tejido en un portaobjetos de vidrio. En este caso, preparar la diapositiva por primera capa de la superficie con Sylgard con las instrucciones del fabricante. Lugar 20μL HL3 en el centro de la diapositiva. El transporte de sus tejidos disecados en 20 l adicionales de HL3 a la diapositiva. El tejido NUNCA debe ser expuesto al aire. Además, el estrés o la tensión de la manipulación o la pipeta de la tensión superficial solución debe ser evitado. </li><li> Para imágenes en vivo, el tejido debe estar firmemente asegurado con una manipulación mínima y el contacto. De manera segura a la posición del cerebro utilizando el GluShield agua polimerización pegamento quirúrgico aplicado a través de un microelectrodo, una técnica habitual utilizada para la preparación de embriones para la electrofisiología 5. Obtener un electrodo de vidrio como los que sacó de los registros electrofisiológicos. Romper la punta y rellene el final con GluShield presión de aire negativa generada por la boca. Romper sólo lo suficiente del electrodo que el pegamento puede entrar. Ahora el uso de presión positiva para aplicar una pequeña cantidad de pegamento a la Sylgard en una gota de HL3. Ahora, rápidamente el tejido de la cola, el mantenimiento de la orientación deseada para la imagen en vivo. Una lente de inmersión en agua se puede utilizar ahora para obtener imágenes. Si quiere añadir un colorante membrana permeable, se puede añadir al baño, mientras que la imagen. </li><li> Nosotros usamos un microscopio de barrido confocal de resonancia que permite imágenes rápidas con la reducción de photobleaching. 6 Para imágenes durante largos períodos de tiempo o de soluciones de intercambio total o varias veces, se utiliza una cámara de perfusión (Harvard IC30 microscopía confocal de la cámara) que se conecta a una bomba peristáltica que poco a poco perfunde solución de cultivo sobre el tejido vivo (Fig. 2A). Movimiento de cambio constante contacto con líquidos y GluShield mínima reducir el aplastamiento de los tejidos que se ha observado durante períodos más largos de tiempo 7. Tenga en cuenta que para la imagen de los períodos de tiempo de desarrollo, el ojo de disco complejo del cerebro que tiene que estar intacto y tienen un contacto mínimo con el pegamento. </li><li> Use una hoja de cubierta revestida con una gota de Sylgard que se afeita para que sea delgada y plana. Dispense 20μL HL3 en el centro del cubreobjetos y la cola del tejido vivo de la Sylgard. Generar una junta que permitir que las burbujas para pasar a través de la cámara, sin exponer el tejido vivo al aire (Fig. 2B). La junta debe ser lo suficientemente gruesa como para evitar el aplastamiento de los tejidos, pero lo suficientemente delgada como para que el tejido cerca de la lente de un microscopio confocal, que utilizamos en nuestra configuración de 250 micras. Montar la cámara de perfusión, teniendo cuidado de mantener el tejido sumergido por completo en todo momento. Comenzar la perfusión inicialmente a una tasa cercana a 100μL por minuto, utilizando una bomba peristáltica. Esta velocidad es más rápida en función del espesor de la junta que define la altura de la cámara. Para la imagen en la escala de horas, puede que tenga que añadir 20 hidroxiecdisona y antibióticos, antimicóticos, pero no, y realizar la perfusión a una velocidad mucho más baja alrededor de 10μl por minuto. Finalmente, la burbuja de oxígeno en el medio de cultivo que abastece a la cámara de perfusión. </li></ol> 7. Los resultados representativos: Al final de nuestro protocolo de vídeo se muestra un ejemplo de imagen en vivo de las células fotorreceptoras de desarrollo a través de la preparación en la Sección 5. Esta preparación se aprovecha de Drosophila transgénesis de células expresan específicamente a los periodistas fluorescentes. En el ejemplo mostrado, dos reporteros fluorescentes se expresan bajo el control de los fotorreceptores específicos de GMR-Gal4 conductor 8: la membrana de la etiqueta myrRFP y el marcador endosomal 2xFYVE-GFP 9. De dos canales conjuntos de datos 3D con una caja de delimitación de 70x70x17.5μm y un tamaño de voxel de 137x137x700nm (512x512x26) se obtuvieron cada 1 min. La película muestra un plano seleccionado con el tiempo en esta base de datos 4D que revela la dinámica del tráfico intracelular de vesículas endosomal y eventos de fusión. Imágenes representativas de preparaciones de tejidos fijos del ojo y la lámina se muestra en la figura. 3.

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Las sondas fluorescentes para la imagen A continuación se describen las ventajas y limitaciones de la preparación del sistema visual de Drosophila para una selección de sondas fluorescentes a partir de tres clases: (1) Las sondas que se añaden a una preparación de tejido vivo exógenamente, (2) las proteínas fluorescentes que están genéticamente codificados por tanto en directo como imágenes fijas, (3) tintes fluorescentes que se añaden al tejido fijado para inmunohistoquímica. 1. Sondas exógenas: LysoTracker Verde DND-26 o Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Estos se encuentran disponibles comercialmente fluorescente membrana, compuestos que se acumulan en los compartimentos fuertemente acidificados en la célula, lo más prominente lisosomas, endosomas tarde, y autofagosomas. LysoTracker en concentraciones nanomolares (que suelen utilizar 50 nm) penetra en la L3 y la P 20% dto los ojos totalmente en menos de un minuto. Desde LysoTracker continuamente se acumula y ejerce un efecto alcalinizante, que la imagen en menos de 5 minutos. En contraste con los discos de los ojos, LysoTracker no penetra en el cerebro, sin alteración de los tejidos. Sin embargo, cuidado de rotura de la membrana externa permite la penetración de un diámetro de unos pocos celulares en el lóbulo óptico. Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) En contraste con LysoTracker, Lysosensor no se acumula en compartimentos acidificados, sino que exhibe un aumento de fluorescencia a pH ácido. Lysosensor tiene características de penetración que son muy similares a LysoTracker. Usamos Lysosensor a una concentración de 1μM. 2. Sondas genéticamente codificados: Para muchos experimentos de imagen en vivo, que expresan los genes etiquetados con diferentes moléculas fluorescentes, como las buenas prácticas agrarias, TagRFP 10 o el pHluorin sensible al pH 11 bajo el control del sistema de expresión binaria GAL4/UAS 12. Gal4 líneas que expresan en los fotorreceptores en desarrollo incluyen GMR-GAL4 (todos los fotorreceptores) 8 y mDelta0.5-Gal4 (desarrollo R4 y R7) 13. Varios subtipos específicos de conducir Gal4 existen líneas directas que los promotores del uso de diferentes rodopsina 14. Sondas fluorescentes especialmente útil en imágenes en vivo son proteínas fotoconvertible. Hemos utilizado con éxito Dendra2, un monómero de verde a rojo proteína photoconvertable 15. Tenga en cuenta que Dendra2 está diseñado para ser fotoconvertible utilizando un rayo láser de argón 488 nm. Sin embargo, no somos capaces de lograr una conversión con la luz azul visible con nuestro set-up en modo de escaneo de resonancia convencional o confocal. Por el contrario, la conversión con láser UV 405 nm es eficiente. 3. Inmunohistoquímica: Para el ojo del adulto fijo, a menudo elegir rodamina phalloidin (Invitrogen, Inc.) o anti-Chaoptin (un anticuerpo específico de fotorreceptor 16) para visualizar la estructura rabdomérica (Fig. 1A). Una buena manera de analizar la estructura de la lámina de cartuchos es la combinación de anti-chaoptin 16, el marcador anti-gliales ébano 17 y 18 anti-sec6 (fig. 1B). Como se muestra en la figura. 3, esta combinación de anticuerpos que distingue a los principales presináptica (chaoptin) y postsinápticos (sec6) procesos, así como las células de epitelio (fiesta) en la lámina 19. Montaje de la cámara de perfusión Para imágenes en vivo, contamos con una cámara de perfusión que permite el intercambio lento de soluciones sin molestar a la preparación del tejido. Una demostración de montaje de cámara de perfusión está incluido en el vídeo y se muestra esquemáticamente en la Figura 2. Asamblea de la cámara de perfusión se ilustra en la figura. 2A. Comience colocando la junta sobre la primera muestra, y luego continuar con el montaje como se muestra. El propósito de la junta es crear un espacio entre la base de la cámara y la tapa, un espacio dentro de la cual se sella el tejido y por el cual la solución de flujo. El espacio dentro de la junta debe incluir la entrada (solución entra aquí), la preparación de tejidos, y la salida a través del cual la solución sale de la cámara. Dos características de la junta son fundamentales: en primer lugar, la junta debe ser lo suficientemente gruesa para que el cerebro aún lo suficientemente delgada como para permitir que las imágenes con una lente de alta resolución. El espesor de la junta ideal depende de la configuración específica de los parámetros. En segundo lugar, una muesca en la junta proporciona un compartimiento que permite una burbuja para pasar sin ponerse en contacto con la muestra (Fig. 2B). Imágenes en el microscopio Utilizamos un 63x (apertura 1.3) lente de inmersión en glicerina para la cámara de perfusión o de una lente de 63x de inmersión en agua directamente en el medio de cultivo en una diapositiva. Lentes de glicerina proporcionan mayor distancia de trabajo que las lentes de petróleo. Nosotros usamos un microscopio de barrido confocal de resonancia que explora a un ritmo mucho más rápido que un escáner convencional (8000 Hz en comparación con 1400 Hz, respectivamente). De exploración de resonancia permite grabaciones en 3 dimensiones en el tiempo en rápidoer velocidades de fotogramas. Además, la mayor velocidad de escaneo láser reducen significativamente fototoxicidad 6, que es una preocupación importante para los análisis repetidos de los tejidos vivos. Un balance de la intensidad del láser y el voltaje de PMT (ganancia) se debe lograr maximizar la señal y reducir al mínimo el ruido y photobleaching. Una consideración importante es que la cantidad de impactos de láser en una región dada se determina por resolución y zoom. Por ejemplo, una región de la elección se explora en la misma resolución a 256x256, zoom de 2x al 512x512, zoom 1x, sin embargo, la velocidad de imagen en vivo al máximo posible es 4 veces más rápido en 256x256, zoom de 2x. Para registrar la actividad de movimiento rápido compartimentos intracelulares, hemos registrado con éxito con los siguientes valores: 5 fotogramas por z-stack, a razón de un z-stack por 10 segundos con una velocidad de escaneo de 8000 Hz y un promedio de línea de 2x. Para las sesiones de formación de imágenes de largo en la escala de horas, que a menudo reducen la velocidad de fotogramas a una por varios minutos y elegir áreas más grandes como la preparación es más probable que cambie. Anatomía del sistema visual de Drosophila La Figura 3 muestra la anatomía del ojo adulto de Drosophila (Fig. 3A), el cerebro adulto (Fig. 3B), y el 20% y 25% complejo de pupa ojo disco / cerebro (Fig. 3C). Figura 3 ilustra el ojo del adulto, con y sin la lámina y las células de grasa adherida. Durante la disección del ojo adulto, la lámina, la cual se encuentra en el centro del ojo situado en un recipiente formado por los cuerpos de las células fotorreceptoras (izquierda), se debe extraer sin alterar los cuerpos celulares de bajo (derecha). Para la disección del cerebro adulto, uno debe ser capaz de distinguir los cuerpos de las células fotorreceptoras, la lámina, el lóbulo óptico, el cerebro central, y la tráquea (Fig. 3B). Los fotorreceptores y la tráquea que ser eliminado debido a que esta disección, dejando la lámina adjunta en el lóbulo óptico. Para ayudar en la identificación de los ojos de pupa 20-25% del disco / cerebro complejo, una imagen en vivo se presenta en la Figura 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) del cerebro adulto. (B) para adultos ojo. (C) 20% -25% de pupa complejo eye-disc/brain. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) conjunto de la cámara de perfusión y (B) junta posicionamiento relativo a la muestra. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (A) tinción de Adultos rhabdomere utilizando anti-chaoptin. (B) Adultos lámina tinción con anti-chaoptin (verde, los fotorreceptores), anti-ébano (de color rojo, la glía), y sec6 (azul, las interneuronas).

Equipos especiales: <ol><li> Alcance de la disección: Leica Mz12.5 con cámara digital </li><li> Leica TCS SP5 Confocal Tandem-Scanner microscopio para la exploración convencional y resonancia en vivo imágenes de microscopía, incluyendo el azul (488nm), verde (561nm), naranja (594nm) y rojo lejano (633 nm) láser, así como 63x especial, glicerina y un 1.4 63x, 1,3 lentes de inmersión en agua. </li><li> Harvard Instrumentos microscopía confocal Cámara RC-30 y la bomba peristáltica modelo 720 </li><li> Sutter extractor pipeta P-97 </li><li> Software: Amira 5.2, Visage Imaging </li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Cerebro y el sistema visual son ampliamente utilizados sistemas modelo para estudiar el desarrollo neuronal de funciones, y la degeneración. Aquí se muestran tres preparaciones de cerebro y del sistema visual que cubren la gama desde el ojo-cerebro en desarrollo del disco complejo en el desarrollo de las pupas de ojos individual y la disección del cerebro de las moscas adultas. Todos los protocolos están optimizados para la cultura viva de los preparativos. Sin embargo, también presentan las condiciones para inmunohistoquímica del tejido fijado en su caso. Finalmente, se muestran las condiciones en vivo de imágenes de estas preparaciones de uso convencional y resonancia 4D imagen confocal en vivo en una cámara de perfusión. En conjunto, estos protocolos sirven de base para imágenes en vivo a diferentes escalas temporales que van desde los ensayos funcionales intracelular en la escala de minutos a los procesos de desarrollo o degenerativas en la escala de muchas horas.

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Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Este protocolo describe tres<em&gt; Drosophila</em&gt; Preparación: 1) la disección del cerebro adulto, 2) la disección de retina adulta y 3) el desarrollo del ojo-cerebro disco disección complejos. Se hace hincapié en las técnicas de preparación y condiciones especiales para imágenes en vivo, a pesar de todos los preparativos pueden ser utilizados para inmunohistoquímica del tejido fijo.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

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Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

35.2K vistas.  University of Texas Southwestern Medical Center. Este protocolo describe tres Drosophila Preparación: 1) la disección del cerebro adulto, 2) la disección de retina adulta y 3) el desarrollo del ojo-cerebro disco disección complejos. Se hace hincapié en las técnicas de preparación y condiciones especiales para imágenes en vivo, a pesar de todos los preparativos pueden ser utilizados para inmunohistoquímica del tejido fijo.

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Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Investigación

Biología

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

Preparación de los adultos Drosophila Ojos de seccionamiento fino y análisis microscópico

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparación Individual Drosophila Huevos Cámaras de Imágenes en directo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

El tomate / GFP-FLP / FRT Método para imágenes en vivo del mosaico adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...