Describimos un protocolo para diseccionar, inmunoteñir y montar cerebros de larvas y adultos de Drosophila con especial énfasis en los lóbulos ópticos. Dada la compleja organización tridimensional del lóbulo óptico, se anticipa que el protocolo descrito aquí proporcionará a los investigadores una mayor comprensión de la relación entre la orientación de montaje y las estructuras visualizadas del lóbulo óptico. Este protocolo describe tres estrategias de montaje para lóbulos ópticos larvales y adultos, cada una de las cuales proporciona un ángulo óptimo para visualizar una estructura específica del lóbulo óptico durante la obtención de imágenes.
Antes de comenzar la disección, llene todos los pocillos de una placa de tres pocillos con 400 microlitros de PBS por pocillo, y use fórceps para seleccionar suavemente 15 larvas errantes del tercer estadio que se arrastran por el interior de un frasco o botella de Drosophila. Coloque todas las larvas en el primer pocillo de la placa de tres pocillos y transfiera una larva al pocillo central del plato. Con la mano no dominante, sujete el cuerpo de la larva en la base del pozo y use la mano dominante para agarrar suavemente el gancho bucal de la larva.
Tire del gancho bucal lejos del cuerpo para extraer el cerebro. A continuación, retire los tejidos accesorios, incluidos los discos imaginales. Luego coloque el cerebro en el tercer pocillo del plato.
Cuando se hayan diseccionado todos los cerebros, use una pipeta P200 para eliminar cuidadosamente el PBS del tercer pocillo, dejando la solución suficiente para mantener el cerebro sumergido. Agregue 500 microlitros de solución de fijación en frío recién preparada al pozo. Revuelva suavemente la solución con las pinzas para que el cerebro se arremoline en el plato y cubra el pocillo con un portaobjetos de microscopio de vidrio.
Luego coloque el plato en hielo durante 30 minutos para fijar el pañuelo. Lave los cerebros cinco veces con 400 microlitros de PBS fresco más tritón por lavado. Los cerebros ya están listos para la incubación primaria de anticuerpos.
Para las disecciones cerebrales de adultos, anestesia de 10 a 15 moscas adultas y colócalas en una toallita de laboratorio sobre hielo. Use fórceps para transferir suavemente una mosca adulta por el ala a un pocillo de una placa de disección de tres pocillos que contiene 400 microlitros de PBS. Use un par de pinzas en la mano no dominante para sostener el tórax de la mosca contra la base del pozo, y use pinzas ultrafinas con la mano dominante para separar suavemente la cabeza del resto del cuerpo.
Deseche el cuerpo en una toallita de laboratorio con la mano no dominante y use la mano dominante para sostener la cabeza contra la base del pozo por la probóscide. Use ambas pinzas para despegar cada región de la cutícula entre los ojos, hasta que el cerebro quede expuesto, y retire cualquier tejido accesorio que permanezca adherido al cerebro. Coloque el cerebro limpio en el tercer pocillo y diseccione el siguiente cerebro como se ha demostrado, hasta que se hayan obtenido 15 cerebros, o haya transcurrido un período máximo de disección de 30 minutos.
Fije los cerebros con 500 microlitros de solución de fijación durante 20 minutos a temperatura ambiente, y lave los cerebros cinco veces con PBS más tritón, como se ha demostrado. Los cerebros de los adultos ya están listos para la incubación primaria de anticuerpos. Reemplace el último lavado con dos gotas de medio de montaje seguro para fluorescentes para sumergir los cerebros, y agregue una sola gota de medio de montaje al centro de un nuevo portaobjetos de microscopio de vidrio.
Use fórceps para agarrar el cerebro de cada larva por el cordón nervioso ventral para transferirlo al portaobjetos. Para visualizar los progenitores y las neuronas de la región central del centro de proliferación externo, la lámina o el tapón de la lóbula, asegúrese de que el cordón nervioso ventral se proyecte sobre los lóbulos, coloque los cerebros de las larvas en el portaobjetos con la cara anterior del tejido hacia arriba. Para visualizar las células que pertenecen a las puntas de los centros de proliferación externos o internos, asegúrese de que el cordón nervioso ventral se proyecte por debajo de los lóbulos.
Coloque los cerebros de las larvas en el portaobjetos con la parte posterior del tejido hacia arriba. Para visualizar la media luna de las neuronas de los centros de proliferación internos y externos tanto en el eje ventral dorsal como en el eje lateral medial, use un par de pinzas afiladas o una aguja de tungsteno para dividir los lóbulos del cerebro a través del cordón nervioso ventral, comenzando desde el punto de escisión entre los lóbulos. Reoriente cada lóbulo con el lado lateral hacia arriba.
Cuando los cerebros de las larvas se hayan orientado adecuadamente, coloque una pequeña gota de medio de montaje a cada lado de los cerebros. Coloque un cubreobjetos en cada gota y coloque un cubreobjetos final sobre los sesos de modo que los bordes derecho e izquierdo descansen sobre los otros dos cubreobjetos, formando un puente de cubreobjetos. A continuación, utilice un esmalte de uñas para sellar los bordes del puente deslizante de la cubierta y asegurar los cerebros montados.
Después del último lavado secundario de anticuerpos, realice un lavado final con 400 microlitros de PBS. Reemplace el PBS con tres gotas de medio de montaje seguro para fluorescentes para sumergir los cerebros. Agregue una gota de medio de montaje a los tercios izquierdo y derecho de un portaobjetos de microscopio de vidrio.
Coloque un cubreobjetos sobre cada caída para construir un puente de cubreobjetos. Selle los bordes exteriores del cubreobjetos derecho con esmalte de uñas y añada una sola gota de medios de montaje entre los cubreobjetos. Con fórceps, transfiera suavemente los cerebros al portaobjetos con mucho cuidado para evitar dañar los lóbulos ópticos.
Para visualizar los cuerpos celulares de las neuronas de la lámina y la médula, use una aguja de tungsteno para orientar los cerebros en una posición anterior con los lóbulos de las antenas sobresaliendo hacia afuera. Para visualizar las neuronas del complejo lóbulo, oriente el cerebro en una parte posterior con los lóbulos antenales hacia abajo contra la posición deslizante. Para visualizar todos los neuropilos del lóbulo óptico en un solo plano, oriente los cerebros en una posición horizontal, alinee los cerebros en un montaje anterior, luego use una aguja de tungsteno para rotar cada cerebro 90 grados hacia arriba para que se asiente en su lado ventral, descansando en el borde de la cubierta de cubierta.
Cuando los cerebros de los adultos se hayan orientado adecuadamente, coloque un cubreobjetos final sobre los sesos de manera que los bordes derecho e izquierdo se superpongan con los otros dos cubreobjetos para formar un puente, selle el portaobjetos con esmalte de uñas. Aquí hay una imagen de un lóbulo óptico larval en la orientación de montaje anterior. En la orientación de montaje anterior, el epitelio del centro central de proliferación, el neuroblasto de la médula y las neuronas de la lámina aparecen en la superficie como bandas de células que envuelven el cerebro.
Más adentro del cerebro, en el centro de la pila Z, el epitelio principal del centro de proliferación externo y sus respectivos neuroblastos y neuronas son visibles. Además, el epitelio del centro de proliferación interno y las neuronas del tapón de la lóbula son visibles en estos cortes intermedios. Los cortes Z más profundos representan el otro lado del cerebro, donde se encuentran las puntas posteriores del centro de proliferación externo.
La punta superficial del centro de proliferación interno también está presente. Nótese que estas serían las primeras estructuras visibles si el lóbulo óptico se montara posteriormente. Aquí hay una imagen de un lóbulo óptico montado de lado.
En la superficie de la montura lateral es visible la luna llámina y la media luna de tapón lóbula se encuentra entre sus brazos. La media luna neuronal de la médula aparece en una posición Z ligeramente más profunda. Aquí hay una imagen de un lóbulo óptico adulto montado en una orientación anterior.
Dado que la médula se encuentra en la superficie del montaje anterior, la corteza de la médula es inmediatamente visible. Los cuerpos celulares de la corteza proyectan sus arborizaciones en el neurópilo, que se puede visualizar en una posición Z intermedia. En este nivel también aparece el lóbulo, orientado perpendicularmente a la médula.
En la posición Z más profunda, el neurópilo final del lóbulo óptico, la placa de lóbula, es visible. Nótese que la placa de lóbula sería la primera estructura visible en una montura posterior. Aquí hay una imagen de un lóbulo óptico adulto montado en una orientación horizontal.
Cuando el cerebro se gira 90 grados de lado a una posición horizontal, todos los neuropilos y cortezas del lóbulo óptico son visibles en un solo plano. Al realizar este protocolo, lo más importante que debe recordar es mantener el tejido cerebral sumergido en solución durante todo el protocolo. Si los cerebros se exponen al aire, la calidad de la mancha y, por tanto, de las imágenes finales se reducirá significativamente.
La comprensión de cómo la orientación del montaje afecta a la visualización del lóbulo óptico es importante para la obtención de imágenes en vivo. Los cerebros de larvas y adultos se pueden cultivar y obtener imágenes durante varios días para seguir las divisiones celulares o los cambios en su propia morfología. En este caso, la orientación del montaje es crítica, ya que los tipos de células de interés deben estar cerca del cubreobjetos para una detección óptima de la señal fluorescente in vivo.
