Maestro fabricación de moldes de silicona Litografía Materiales: <ul><li> 75 obleas de silicio mm </li><li> SU-8 2 fotosensible negativa (Microchem, Boston, MA) </li><li> N2 </li></ul> Método: <ol><li> Deshidratar oblea de Si a 120 º C durante 2 horas. </li><li> La superficie de la capa de ozono UV tratar durante 7 minutos para eliminar materia orgánica. </li><li> Superficie N2 golpe para eliminar las partículas. </li><li> Aplicar SU-8 2 para cubrir el 70% de la superficie (aproximadamente 10 ml de obleas de 75 mm). </li><li> Giran a 2000 rpm durante 20 segundos con 300 rpm de aceleración / s. </li><li> Lugar de la oblea en una placa y una rampa de temperatura ambiente a 95 ° C. </li><li> Softbake el fotoprotector durante 15 minutos a 95 ° C. </li><li> Inundaciones exponer las placas para los 20 a 25 mJ/cm2 dosis a 365 nm (I-line) para formar la capa inferior. </li><li> Aplicar SU-8 2 para la capa fotosensible segundos. </li><li> Giran a 550 rpm durante 20 segundos con 300 rpm de aceleración / s para una película de aproximadamente 11 micras de espesor. </li><li> Lugar de la oblea en una placa y una rampa de temperatura ambiente a 65 ° C. </li><li> Softbake la oblea a 65 ° C durante 5 minutos. </li><li> Rampa de la zona de cocción de 65 ° C a 95 ° C. </li><li> Softbake la oblea por 55 minutos a 95 ° C. </li><li> Oblea de enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. </li><li> Alinear a la máscara de MPAD en la oblea y exponer de 95 a 100 mJ/cm2 dosis a 365 nm (I-line). </li><li> Lugar de la oblea en una placa y una rampa de temperatura ambiente a 95 ° C. </li><li> Después de la exposición hornear el fotoprotector durante 25 minutos a 95 ° C. </li></ol> Desarrollar Materiales: <ul><li> Platos de 100 mm de vidrio (5) </li><li> Propileno glicol metil éter acetato (PGMEA) </li><li> Isopropanol (IPA) </li><li> N2 </li></ul> Método: <ol><li> En una campana química, llenar cinco platos con PGMEA (2), IPA, y hexano (2). </li><li> Mantenga la oblea en primera PGMEA durante 10 segundos </li><li> Agite la oblea durante 50 segundos </li><li> Transferencia de láminas hasta la segunda PGMEA con menisco de PGMEA. </li><li> Agite por 5 segundos. </li><li> Transferencia de obleas para la API de menisco de PGMEA. </li><li> Agite durante 20 segundos. </li><li> Transferencia de láminas hasta la primera IPA. </li><li> Agite por 5 segundos. </li><li> Transferencia de láminas hasta la segunda IPA. </li><li> Agite por 5 segundos. </li><li> Quite rápidamente la oblea de la IPA segundo con menisco de la IPA y seco, con N2 </li><li> Inspeccione el patrón. </li><li> Hardbake de obleas de 120 ° C durante 14-20 horas para entrecruzar SU-8. </li><li> Dados de la oblea con un cortador de diamantes </li><li> Monte la oblea en un portaobjetos de vidrio con epoxi </li><li> Fluorosilanize la oblea (vea las instrucciones en el moldeo de replicación) </li></ol> Replicación de moldeo de mPADS Molde negativo Materiales: <ul><li> De aluminio desechables peso barco </li><li> Polidimetilsiloxano (PDMS) de base y agente de curado (Dow, Midland, MI) </li><li> Razorblade </li><li> Silano: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-triclorosilano </li><li> Portaobjetos de vidrio </li><li> Pasteur de vidrio con una pipeta </li></ul> Método: <ol><li> Mix PDMS 10:1 en peso y desgasificar en bajo vacío durante 1 hora para eliminar las burbujas. </li><li> Silicio lugar principal de moho en bote de aluminio. </li><li> Verter 50-60 g de PDMS sobre molde maestro en bote de aluminio. </li><li> Degas al vacío durante 30 minutos para eliminar las burbujas. </li><li> Soplar atrapados en la superficie las burbujas de aire en PDMS con ráfaga rápida de N2. </li><li> Barco Coloque en el horno de convección a 110 ° C durante 15 minutos hasta que esté firme PDMS. </li><li> Cortar bote de aluminio. </li><li> Con hoja de afeitar, recortar PDMS debajo de silicio maestro. </li><li> Pelar PDMS lejos de maestro de silicio con un movimiento lento y constante en una dirección para evitar la destrucción del maestro. </li><li> Inspeccione el maestro de silicio de los daños. </li><li> Cortar el molde negativo en 4 trozos. </li><li> Repita los pasos 1-10 para un gran lote de moldes negativos. </li><li> Plasma de oxígeno tratar molde negativo de 1,5 minutos para activar la superficie, o </li><li> La capa de ozono tratamiento de molde negativo durante 10 minutos para activar la superficie. </li><li> Colocar los moldes negativos en desecador con características MPAD expuestos. </li><li> Propagación 250-500 L de silano en portaobjetos de vidrio en el centro de desecador </li><li> Vidrio lugar pastos pipeta con 150-200 L de silano en la punta dentro de un desecador. </li><li> Cámara de vacío para evaporar moldes negativos de silano y un abrigo de&gt; 14 horas. </li></ol> mPADS Materiales: <ul><li> Polidimetilsiloxano (PDMS) de base y agente de curado (Dow, Midland, MI) </li><li> De boca ancha de pipetas desechables </li><li> 2 &quot;x 3&quot; portaobjetos de vidrio </li><li> Escriba vidrio </li><li> N2 </li></ul> Método: <ol><li> Mix PDMS 10:1 en peso y desgasificar en bajo vacío durante 1 hora para eliminar las burbujas. </li><li> encaje silanizada moldes negativos en la &#39;cruz&#39; </li><li> Pipeta de PDMS en los moldes negativos de modo que las características están completamente cubiertos con un espesor de 1 mm. </li><li> Espere 30 minutos para que cualquier burbuja de aire en el PDMS a la altura de la superficie. &lt;/ Li&gt; <li> En el 30 &#39;el tiempo de inactividad, el polvo de 22x22mm (No. 2) cubreobjetos de vidrio con una corriente de N2. </li><li> Plasma de oxígeno portaobjetos de vidrio tratar mitades durante 1,5 minutos para limpiar y activar vidrio </li><li> Soplar atrapados en la superficie las burbujas de aire en PDMS con ráfaga rápida de N2. </li><li> Coloque con cuidado el borde del vidrio cubreobjetos de PDMS con la cara limpia de plasma frente a la PDMS. Baje lentamente el portaobjetos de vidrio para que el pleno PDMS contacto con la superficie de vidrio entero y evitar burbujas de aire queden atrapados debajo de la lámina de vidrio. </li><li> Colocar los moldes montados en el horno de convección a 110 ° C durante 20 horas para curar completamente. </li><li> Retire los moldes del horno y dejar enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Mantenga portaobjetos de vidrio con una mano en la parte superior y poco a poco la cáscara negativo de distancia del molde negativo de la parte inferior para liberar el MPAD. </li><li> Inspeccione el MPAD bajo un microscopio para los puestos se derrumbó. </li><li> Re-silanizar molde a través de plasma y silano cada cuatro piezas de fundición. La vida útil del molde negativo para la replicación buena es de aproximadamente 6.20 moldes. </li></ol> Las células de siembra en mPADS Estampado Materiales: <ul><li> PDMS sellos para la UCP (ver Tien, J &amp; Chen, CS, en los métodos de la Ingeniería de Tejidos, 2001, pp 113-120.) </li><li> Etanol (100% y 70%) </li><li> El agua esterilizada desionizada </li><li> 50 ug / ml fibronectina humana en agua destilada estéril (BD Biosciences) </li><li> 5 ug / ml Solución DII se filtra con membrana de 0,2 micras (D-3886, Molecular Probes, OR) </li><li> 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, Nueva Jersey) </li><li> Fosfato Buffer 1X solución. </li><li> 100 mm x 25 mm caja de petri (4) </li><li> 150 mm x 25 mm caja de petri (2) </li><li> Lámina de aluminio </li><li> N2 </li><li> Pinzas </li><li> Hood estéril </li></ul> Método: <ol><li> Recorte el exceso de PDMS mPADs </li><li> Si el sello PDMS se ha utilizado previamente, sonicar sellos en etanol al 100% durante 5 minutos para depurar las proteínas contaminantes. </li><li> En campana estéril, mantener los sellos en sus lados con unas pinzas y seco con N2 tras caer sellos en etanol 100% frescos y agua estéril </li><li> Lugar en 150 mm placa de Petri con el trabajo hacia arriba. </li><li> Alícuota de gotas de solución de fibronectina en cada estampilla. Comience con las esquinas de cada uno de los sellos, y luego los bordes, y, por último, las regiones del interior. Inicialmente, la superficie del sello PDMS es hidrofóbica, pero se convierte en hidrófila la proteína es absorbida. De trabajo &quot;afuera hacia adentro&quot;, cambia el ángulo de contacto del PDMS, para que un menor volumen de la solución de fibronectina es totalmente necesario para cubrir el sello. </li><li> Deje reposar durante 1 hora en la capilla de la adsorción de proteínas. </li><li> Lavar con agua DI sellos vertiendo en un plato y dejar que el nivel del agua aumentará en los sellos. </li><li> Lavado de sellos en 100 mm placa de Petri con agua DI. </li><li> Retire y seque con N2. </li><li> MPADS ozono tratar durante 7 minutos para activar la superficie de sellado. </li><li> Bajo el capó, el sello mPADS mediante la colocación de sello en el borde MPAD y suavemente bajar para hacer un contacto pleno. Golpee suavemente la parte superior de la estampilla con pinzas para asegurar que todas las áreas tienen un buen contacto, pero tenga cuidado de no contraer los mensajes. </li><li> Retire con cuidado sellos con unas pinzas. </li><li> MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con un 100% de etanol durante unos 15 segundos. Mantenga microagujas de deshumectación durante la transferencia mediante la transferencia rápida entre los platos. </li><li> MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con 70% de etanol durante unos 15 segundos. </li><li> MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS sumergirse en el segundo 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS sumergirse en 150 mm placa de Petri con agua destilada. </li><li> MPADS sumergirse en 150 mm placa de Petri con 100 ml de solución de DII. </li><li> Cubra con papel aluminio y remoje por 1 hora. </li><li> MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS sumergirse en 150 mm placa de Petri con 10 ml de Pluronics 2% y 90 ml de PBS a la concentración total de Pluronics 0,2%. </li><li> Cubra y remoje por 1 hora. </li><li> MPADS sumergirse en 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS sumergirse en el segundo 100 mm placa de Petri con agua destilada para ~ 15 segundos. </li><li> MPADS sumergirse en la tercera 100 mm placa de Petri con PBS durante unos 15 segundos. </li></ol> Siembra Materiales: <ul><li> Celda elegida línea </li><li> Tripsina-EDTA (0,25% de tripsina con EDTA • 4NA, Cat Gibco. N º 25200-056) </li><li> El crecimiento medio </li><li> Fosfato Buffer 1X solución. </li></ul> Método: <ol><li> En campana estéril, mPADS lugar en 100 mm placa de Petri y se llenan de medio ml 17. </li><li> Colocar placa de Petri en la incubadora se caliente a 37 ° C </li><li> Suspender las células a través de la tripsina </li><li> Aspirado varias veces para romper los cúmulos de células. </li><li> Pipeta de suspensión de células en la placa de Petri con la mPADS. Añadir estas células se mantendrán las células individuales (sin contactos célula-célula) en el momento del análisis. La cantidad exacta de las células a añadir es de tipo celular específico ydepende del área de la celda difusión y la tasa de crecimiento. </li><li> Suavemente se dispersan las células en placa de Petri con pippetting lento. </li><li> Lugar en la incubadora durante 2 horas para permitir que las células se asiente y se adhieren a microagujas. </li><li> Inspeccione mPADS para ver si las células se han extendido. Las células tienen aspecto aplanado y el período de seis o más mensajes. </li><li> Si las células se propagan, la transferencia de mPADS a los nuevos platos de Petri de 100 mm con 21 ml de medio fresco. </li><li> El mPADS está listo para su experimento. </li></ol> Tinción y montaje mPADS Fijación Materiales: <ul><li> Agua desionizada </li><li> Paraformeldahyde (16%) vial </li><li> Fosfato solución tampón 10X. </li><li> Fosfato Buffer 1X solución. </li></ul> Método: <ol><li> En un tubo de centrífuga de 50 ml, agregar 30 ml de DI, 10 ml de paraformeldahyde (vial completo), y 4,5 mL de PBS 10X para la solución de fijación. </li><li> Añadir ~ 25 ml de solución fijadora a un 100 mm placa de Petri. </li><li> Sumergir suavemente MPAD con las células en la fijación de plato y dejar incubar durante 20 minutos. </li><li> MPADS sumergirse en 100 mm plato con 1X PBS tres veces. </li><li> Listo para inmunoticción y montaje. </li></ol> Análisis de las fuerzas celular en mPADS Microscopía confocal Materiales: <ul><li> Microscopio confocal </li><li> Objetivo 63X </li><li> Cubos de filtros de anticuerpos secundarios </li><li> Filtro verde cubo (rodamina) para DII imágenes de microagujas. </li></ul> Método: <ol><li> MPADs lugar en el escenario y encontrar células individuales con 300 ms de exposición, no hurgar en la basura. </li><li> Tapas de la imagen de microagujas de imagen superior. </li><li> Z utilizando el control de lectura, captura de imágenes de microagujas de imagen inferior. </li><li> Imagen de los otros canales que tienen manchas en (Hoechst, phalloidin etc) </li></ol> Análisis de Imágenes Materiales: <ul><li> MATLAB con Image Processing Toolbox </li></ul> Método: <ol><li> Girar y registro de imágenes superior e inferior </li><li> Centroides medida de fondo (sin desviarse) y altos puestos (desviado) </li><li> Calcular el desplazamiento </li><li> Utilizando la constante del resorte de los puestos (conocido, depende de la geometría post), calcular vector de fuerza en cada puesto </li><li> El análisis de errores se basa en la capacidad de resolver las fuerzas, y depende de la resolución de la imagen y la resolución de detección de centroide </li><li> Organizar los datos según sus necesidades a medida - por ejemplo, magnitudes, la fuerza y ​​/ o dirección, como un curso a tiempo, muchas mediciones en diferentes condiciones, etc </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li><li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S., Wang, Y. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Silicone+Elastomeric+Post+Arrays+for+Measuring+Traction+Forces+of+Adherent+Cells.">Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells.</a> Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. 83, 313-328 (2007).</li><li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics &amp; Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li></ol>

microfabricated post-array-detectors (mpads): an approach to isolate mechanical forces

En este video, vamos a presentar nuestro enfoque para medir fuerzas de tracción celular utilizando una matriz de microfabricated de los puestos. Fuerzas de tracción se generan a través de la miosina-actina de las interacciones y juegan un papel importante en nuestra fisiología. Durante el desarrollo, que permiten a las células se mueven de un lugar a otro con el fin de formar las estructuras iniciales de los tejidos. Ayudar a las fuerzas de tracción en los procesos de curación. Son necesarios para el cierre adecuado de las heridas o la migración y el rastreo de los leucocitos a través de nuestro cuerpo. Estas mismas fuerzas pueden ser perjudiciales para nuestra salud en el caso de la metástasis del cáncer o de crecimiento vascular hacia un tumor. El método más común para el estudio de células in vitro ha sido la de utilizar un vaso o un plato de poliestireno. Sin embargo, la rigidez de los soportes hace que sea imposible medir físicamente las fuerzas de tracción de células, y son relativamente pocos los métodos para estudiar las fuerzas de tracción. Nuestro laboratorio ha desarrollado una técnica para superar estas limitaciones. El método se basa en una matriz vertical de voladizos flexible, la rigidez y la escala de tamaño de las cuales son tales que las células individuales repartidas en muchos voladizos y desviar en el proceso. Los pilares que utilizamos son de 3 m de diámetro, 10 m de altura, y se configuran en una matriz regular con 9 m de centro a centro de separación. Sin embargo, estas dimensiones físicas pueden ser fácilmente variar para acomodar una variedad de estudios. Empezamos con un maestro de silicio, pero el final de los mensajes están hechos de caucho de silicona llamado poli (dimetil-siloxano), o PDMS. Podemos medir las deflexiones bajo un microscopio y calcular la magnitud y dirección de las fuerzas de tracción necesaria para producir las desviaciones observadas. Llamamos a estos sustratos microfabricated post-serie de detectores o mPADs. Aquí le mostraremos cómo fabricar y utilizar la mPADs para evaluar las modulaciones de la contractilidad celular.

Watch this Scientific Journal Video about Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces at JoVE.com

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

En este vídeo, que muestran cómo fabricar y utilizar microfabricated detectores de POST (mPADs) para evaluar la modulación de la contractilidad celular.

Microfabricated Post-Array-detectores (mPADs): un enfoque para aislar las fuerzas mecánicas

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

12.4K vistas.  University of Pennsylvania. En este vídeo, que muestran cómo fabricar y utilizar microfabricated detectores de POST (mPADs) para evaluar la modulación de la contractilidad celular.

Video: Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desarrollar herramientas de diagnóstico

Investigación

Biología

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo Enfoque de reticulación para aislar Complejos de Proteína Desde Drosophila Los embriones

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Un método de alta salida para aislar los pericytes cerebrales del ratón

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

A Finite Element Approach for Locating the Center of Resistance of Maxillary Teeth

The center of resistance (CRES) is regarded as the fundamental reference point for predictable tooth movement. The methods used to estimate the CRES of teeth range from traditional radiographic and physical measurements to in vitro analysis on models or cadaver specimens. Techniques involving finite element analysis of high-dose micro-CT scans of models and single teeth have shown a lot of promise, but little has been done with newer, low-dose, and low resolution cone beam computed tomography (CBCT) images. Also, the CRES for only a few select teeth (i.e., maxillary central incisor, canine, and first molar) have been described; the rest have been largely ignored. There is also a need to describe the methodology of determining the CRES in detail, so that it becomes easy to replicate and build upon.
This study used routine CBCT patient images for developing tools and a workflow to obtain finite element models for locating the CRES of maxillary teeth. The CBCT volume images were manipulated to extract three-dimensional (3D) biological structures relevant in determining the CRES of the maxillary teeth by segmentation. The segmented objects were cleaned and converted into a virtual mesh made up tetrahedral (tet4) triangles having a maximum edge length of 1 mm with 3matic software. The models were further converted into a solid volumetric mesh of tetrahedrons with a maximum edge length of 1 mm for use in finite element analysis. The engineering software, Abaqus, was used to preprocess the models to create an assembly and set material properties, interaction conditions, boundary conditions, and load applications. The loads, when analyzed, simulated the stresses and strains on the system, aiding in locating the CRES. This study is the first step in accurate prediction of tooth movement.

This study outlines the necessary tools for utilizing low-dose three-dimensional cone beam-based patient images of the maxilla and maxillary teeth to obtain finite element models. These patient models are then used to accurately locate the CRES of all the maxillary teeth.

Un enfoque de elementos finitos para localizar el centro de resistencia de los dientes maxilares

The center of resistance (CRES) is regarded as the fundamental reference point for predictable tooth movement. The methods used to estimate the CRES of ...

Methods Article

Microfabricated Post-Array-detectores (mPADs): un enfoque para aislar las fuerzas mecánicas