Las biomoléculas experimentan cambios estructurales pequeños y rápidos a menudo en respuesta a la fuerza. Las pinzas magnéticas de alta resolución pueden explorar estas dinámicas bajo fuerzas fisiológicamente relevantes. Como el método realiza mediciones a nanoescala con una precisión de milisegundos, es posible monitorear cambios sutiles en ácidos nucleicos y proteínas en tiempo real.
El mal funcionamiento de las proteínas del primer rodamiento y mecanosensibles puede conducir potencialmente a trastornos cardiovasculares y musculoesqueléticos. Las pinzas magnéticas pueden proporcionar información sobre los mecanismos de trabajo de estas proteínas. El conjunto debe estar correctamente alineado y calibrado para obtener buenas resoluciones.
Además, se debe tener cuidado durante la preparación e identificación de construcciones moleculares para las mediciones. Comience instalando un microscopio invertido en una mesa óptica antivibración. A continuación, instale una cámara CMOS de alta velocidad y un capturador de fotogramas.
Monte verticalmente una etapa lineal motorizada con una longitud de recorrido de más de 20 milímetros en una etapa XY manual para construir una etapa de traslación para la manipulación de imanes en 3D. A continuación, instale un motor paso a paso rotativo y un sistema de correa y polea para la rotación del imán. Monte los imanes en un soporte de acrílico en el que los imanes paralelos idénticos están separados por un milímetro.
Ajuste la posición vertical de la etapa de traslación para que la superficie inferior del imán se alinee con el plano de muestra en la posición más baja de la etapa. Con una lente de objetivo de bajo aumento, alinee los imanes con el centro del campo de visión. Compruebe la rotación del imán para asegurarse de que el desplazamiento del centro del par de imanes sea limitado.
Instale un diodo súper luminiscente para la iluminación de cuentas. Pase el haz a través del espacio del imán asegurándose de que el haz esté correctamente colimado para encajar en el espacio y que la iluminación no esté ensombrecida por los imanes. Ahora instale un escáner de lente piezoeléctrica en la pieza de la nariz y monte una lente objetivo de inmersión en aceite 100X con una apertura numérica de 1.5 para el seguimiento de cuentas.
Asegúrese de que la iluminación sea uniforme con el movimiento del imán para evitar posibles artefactos en el seguimiento de cuentas. Finalmente, ajuste la luz al brillo máximo sin saturación de píxeles. Comience tomando dos cubreobjetos de vidrio para la parte superior e inferior de la celda.
Limpie los cubreobjetos sonicándolos en un hidróxido de potasio molar durante 30 minutos. A continuación, enjuague los cubreobjetos con agua destilada y manténgalos sumergidos en agua. Pecilar el cubreobjetos inferior y almacenarlo a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior.
El día del experimento, seque los cubreobjetos pegilados con una pistola de nitrógeno. Para hacer los canales simples, prepare tiras de cinta de doble cara de aproximadamente dos milímetros de ancho y coloque cuatro tiras paralelas entre sí a cinco milímetros de distancia en el cubreobjetos inferior. Ahora coloque un cubreobjetos superior en el centro del cubreobjetos inferior, dejando aproximadamente cinco milímetros de espacio en los bordes cortos para las entradas y salidas del canal.
Con unas pinzas, presione suavemente la parte posterior del cubreobjetos superior para sellar firmemente los canales. Recorte el borde de una punta de pipeta de 200 microlitros y corte unos 10 milímetros de la abertura más ancha para permitir que contenga más de 200 microlitros de solución. Prepare tres agujas de jeringa que se ajusten al tubo para la bomba de la jeringa.
Conecte la aguja en la salida del canal de la celda de flujo a la bomba de jeringa con tubo de polietileno. Equilibra los canales con PBS. Resuspender los agregados de perlas vorticando las soluciones de perlas.
Luego, introduzca secuencialmente las soluciones requeridas en el canal succionando con la bomba. Lave las perlas no unidas mientras aplica 0,1 piconewtons de fuerza. En la superficie del canal celular de flujo, identifique las perlas magnéticas atadas a moléculas individuales de la construcción de ADN.
Localice una cuenta de referencia cerca. Gire la cuenta candidata para comprobar si gira libremente. Gire las cuentas durante unas vueltas más y estime el radio de rotación, eligiendo una cuenta con un radio de rotación más pequeño.
Aumente la fuerza de cero a cinco piconewtons para identificar buenas cuentas atadas individuales buscando un gran cambio en el patrón de difracción de cuentas resultante de un estiramiento de amarre de par de cinco kilobases. Usando la PCR, prepare cinco pares de kilobases de fragmentos de ADN bicatenario marcados con biotina en un extremo y azida en el otro extremo. Después de preparar una celda de flujo con el producto de PCR, registre las coordenadas X e Y de la cuenta atada a 1,2 kilohercios y los imanes en posición de reposo.
Mueva los imanes más cerca de la celda de flujo y repita las mediciones de posición del talón hasta que los imanes apenas toquen la parte superior de la celda de flujo. Calcule la fuerza en cada posición D del imán utilizando cualquiera de los métodos alternativos. Repita las mediciones de fuerza para algunas construcciones más de ADN sondeando de tres a cinco cuentas para promediar la variabilidad de la fuerza entre las cuentas magnéticas.
Una vez que se encuentre una cuenta magnética adecuada junto con una cuenta de referencia, haga clic en el botón calibrar para comenzar a prepararse para el seguimiento de cuentas. Haga clic en las cuentas de la imagen para definir las ubicaciones de las cuentas. Para el seguimiento en la dirección Z, el software escalonará la lente del objetivo con un escáner piezoeléctrico en pasos equidistantes y registrará las imágenes de cuentas promediadas de fluctuación en cada posición para generar una tabla de búsqueda.
Habilite el seguimiento y el enfoque automático y haga clic en el botón Adquirir para registrar las posiciones de las cuentas. La aplicación de fuerza a una construcción de horquilla de ADN dio como resultado el modelo de cadena similar a un gusano de extensión inducida por fuerza. A seis piconewtons, la construcción mostró fluctuaciones en la extensión asociadas con la descompresión reversible, que desapareció a ocho piconewtons y se encajó en una nueva curva modelo.
Los experimentos de seguimiento de horquilla a 100 hercios mostraron un aumento en la extensión, pero los histogramas no resolvieron poblaciones distintas. A 1,2 kilohercios, la mediana de las trayectorias filtradas reveló dos poblaciones distintas. La separación entre las dos poblaciones siguió siendo la misma en el régimen de descompresión de la fuerza.
El estado abierto superior se volvió gradualmente dominante con mayor fuerza. Las tasas de transición variaron exponencialmente con la fuerza aplicada que favorece la descompresión e inhibe la recompresión. En el régimen de fuerza intermedia, se obtuvo una desviación de Allan de dos a tres nanómetros a la velocidad máxima.
Los mangos de ADN de una construcción compleja SNARE se comportaron como polímeros de cadena similares a gusanos. Cuando la fuerza se relajó de un régimen superior, la extensión volvió a la curva original o siguió un nuevo modelo. A 14 piconewtons, el complejo SNARE no pudo pasar al estado descomprimido, mientras que una mayor fuerza permitió la transición.
El despliegue completo del complejo a fuerzas más altas se confirmó mediante el repliegue observado en dos piconewtons. La identificación de las correas de cuentas de muestra correctamente formadas es lo más importante que debe recordar al intentar nuestro procedimiento. Este paso permite una selección precisa y, por lo tanto, un análisis de la estructura objetivo.
Las pinzas magnéticas se pueden usar para estudiar el súper enrollamiento del ADN aplicando torque. Además, podría combinarse con imágenes de fluorescencia para observar interacciones o despliegues de proteínas altamente complejas.
