This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

1. Las células de cultivo en micropost Arrays Nota: Todos los pasos deben realizarse en una cabina de bioseguridad para garantizar la esterilidad. Los volúmenes que se dan aquí son para frascos de cultivo de células T25. La densidad media de la receta y la siembra de células de cultivo de células están optimizados para líneas celulares de cáncer de hueso HuO9 y M132. <ol><li> Preparar un cultivo de células para la siembra en una matriz micropost. <ol><li> Inspeccione la calidad del cultivo celular colocando el frasco de cultivo en un microscopio óptico estándar. Asegúrese de que las células muestran un crecimiento y morfología típicos mediante la estimación de la cantidad del fondo frasco de cultivo está cubierto. Una cobertura de 70% -80% refleja una tasa de crecimiento saludable. Preste atención a la cantidad de células flotantes ya que representan las células muertas y / o una cultura con mucha vegetación. </li><li> Trypsinize células mediante la eliminación de medio y el lavado con 4 ml de 1x tampón fosfato salino tampón (PBS). Añadir 0,8 ml de 1x tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a RT hasta que la células dislodge, que toma alrededor de 2-4 min. Compruebe el proceso con el microscopio y, ocasionalmente, golpee suavemente el frasco para apoyar el desalojo. </li><li> Añadir 5 ml de medio de cultivo celular (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) / F12 con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptavidina (Pen / Strep)) para detener la reacción y para lavar las células residuales que todavía se sientan en la parte inferior del matraz. Posteriormente, verter esta suspensión hacia arriba y abajo varias veces para obtener una mezcla homogénea. Asegúrese de pipeta todas las soluciones en todo el área de crecimiento original del matraz para obtener un desalojo efectivo. </li><li> Transferir la suspensión celular en un tubo de 15 a ml y centrifugar usando una centrífuga de mesa en 0,5 xg durante 3 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 5 ml de medio pipeteando arriba y abajo 5 veces. Asegúrese de evitar la generación de burbujas mientras lo hace. </li><li> Determinar la densidad celular mediante el uso de una cámara de recuento celular y un microsco luzEducación física. Consultar la suspensión celular en cámara de recuento celular para los agregados de células y garantizar tener solamente células individuales para el experimento posterior. Pipetear otra vez hacia arriba y abajo varias veces si las células tienden a formar agregados para separarlas. </li><li> Diluir la suspensión de células con medio suficiente para obtener una solución de células de 25.000 células / ml. Mezclar bien invirtiendo el tubo cerrado en varias ocasiones. </li></ol></li><li> Preparar una matriz micropost para la siembra de células. Nota crítico: No pipetear en la matriz micropost directamente como esto podría dañar las microposts, sobre todo cuando se introducen burbujas no deseadas. Además, asegúrese de que la matriz micropost nunca se seca como se producen fuerzas capilares conducen al colapso de los microposts. <ol><li> Coloque el sustrato de vidrio con la matriz micropost boca arriba en un pocillo de una placa de 12 pocillos usando un par de pinzas y mojar mediante la adición de 1 ml de etanol (99%). Incubar a temperatura ambiente durante 20 a 30 segundos. </li><li> Diluir el etanolpaso a paso mediante la adición de aproximadamente 1 ml de agua desionizada estéril (agua DI) en el lado de aspiración bien y aproximadamente 1 ml usando una pipeta de transferencia o dispositivo de aspiración. Repita este paso al menos 3 veces. </li><li> Sustituir el agua DI con PBS-buffer de la misma manera mediante la adición y la aspiración de aproximadamente 1 ml. Repita este paso 3 veces. </li><li> Sustituir el tampón PBS con medio mediante la adición de aspiración y aproximadamente 1 ml de medio. Repita este paso 3 veces. </li></ol></li><li> Pipeta solución de 1 ml de células (25.000 células) en la parte superior de cada matriz micropost preparado. Cerrar placa de pocillos múltiples y transferirlo a una incubadora (CO 2 al 5%, 37 ° C). Deje que las células se adhieren y crecen en la parte superior de microposts para 6 -7 horas. </li><li> Inspeccione el proceso de adhesión en ocasiones mediante el uso de una luz de un microscopio. Compruebe que la mayoría de las células aparecen extendían a través de múltiples microposts. </li></ol> 2. Fijación y tinción de las células Nota: Todas las medidas yvolúmenes que se dan aquí son para un solo pocillo de una placa de 12 pocillos. Se recomienda para procesar no más de cuatro de los doce pozos en un momento para evitar una desecación de los pocillos después de la aspiración de cualquier líquido, lo que resultará en un colapso de los microposts. <ol><li> Aspirar medio del pozo y lavar las células 2 veces con 1 ml de PBS-buffer. Asegúrese de aplicar una fuerza suave mientras se lava con PBS para eliminar los desechos celulares que se acumuló en la matriz micropost durante la incubación y para desprender las células muertas. </li><li> Fijar las células con una solución de formaldehído tamponado 0,5 ml 3,7% durante 5 min. </li><li> Reemplace la solución de formaldehído por lavado de las 2x matriz micropost con 1 ml de agua DI estéril. </li><li> Teñir las células con colorante (0,05% Coomassie azul brillante en el 50% de agua, 40% de etanol y ácido acético al 10%) por alrededor de 90 segundos. Lave solución de tinción exceso de 2 veces con 1 ml de agua DI estéril. Añadir agua DI 1 ml a micropost matriz. </li><li> Compruebe la tinción con un microscopio óptico. Repita tque manchaba paso, si el cuerpo celular es demasiado débil para ser visualizado. </li><li> Matrices micropost tienda con las células teñidas en la parte superior en un refrigerador a 4 ° C. Asegúrese de mantenerlos bajo el agua en todo momento. </li></ol> Imagen 3. celular Nota: El paso 4 sólo se aplica a los microscopios y sin infinito corregido la óptica. <ol><li> Añadir 2 ml de agua DI a una placa de Petri con un fondo de cristal fino para obtener imágenes de alta resolución. </li><li> Transferencia array micropost usando un par de pinzas en el plato de imagen con las microposts hacia arriba. </li><li> Coloque la imagen placa de Petri en un escenario móvil de un microscopio de luz. </li><li> Girar el anillo de compensación de la lente utilizada para formación de imágenes hasta que el número en la escala representa el espesor total de todos los materiales a lo largo de la trayectoria óptica para compensar la falta de coincidencia en los índices de refracción del sustrato de vidrio, el elastómero de silicona y el líquido en la parte superior. Esto debería conducir a un aspecto brillante de los micropostsnúcleos. </li><li> Cerrar el iris en el lado de la iluminación a 50% y eliminar cualquier anillos de contraste de fase de la trayectoria óptica que permite un modo de campo brillante ordinaria. </li><li> Alinear la matriz micropost que los microposts forman una línea horizontal a través del campo de observación. Definir un punto de partida (por ejemplo, arriba a la izquierda) y mover el plato de Petri por etapas a través del escenario escanear la matriz micropost mientras toma numerosas imágenes. </li><li> Tome todas las imágenes con la configuración más alta resolución de la cámara utilizando un objetivo 20X o 40X. Objetivo es tener una sola célula en el centro de la imagen. </li><li> Barrer lo largo del eje z a través del sustrato hasta que las puntas micropost están en foco. Utilice la rueda de enfoque fino de sintonización del microscopio y gire hacia centrándose en la parte inferior micropost durante unos 2-3 micras. </li><li> Establecer un procedimiento de imagen estándar tomando serie de imágenes de prueba de una sección matriz barriendo a través de los parámetros de una imagen a la vez (por ejemplo, tiempo de exposición,ajuste de iris, la configuración de la lámpara, etc.). Analizar imágenes con MechProfiler y determinar un conjunto de parámetros adecuados para un análisis rápido y fiable. </li></ol> Análisis 4. Imagen con Open Source Software &quot;MechProfiler&quot; Nota: Todas las funciones de software se pueden activar con un dispositivo señalador con el botón izquierdo del ratón. Sin embargo, un operador entrenado utilizará la combinación de teclas documentados diseñados para estar en la media izquierda del teclado para permitir un procesamiento de imagen de dos manos eficiente. <ol><li> Comience el análisis de imágenes MechProfiler software y abrir una serie de imágenes que necesitan ser analizados haciendo clic en &quot;Abrir&quot;. </li><li> Inserte todos los parámetros en la sección &quot;Configuración&quot; propuesta por el desarrollador de software. Determinar los parámetros que se deben configurar a medida (es decir, el umbral de contorno y distancia mínima) de acuerdo con los procedimientos descritos en detalle en el manual de software. </li><li> Analizar imagens uno por uno a los cultivos a la zona de interés mediante el uso de &quot;Recortar&quot; (haga clic y arrastre con el botón del ratón pulsado). Haga doble clic dentro del rectángulo dibujado para terminar esta acción. </li><li> Marcado cada contorno celular visible uno por uno haciendo clic en &quot;Dibujar contornos celulares&quot; y utilice el cursor de cruz para el dibujo incluyendo todos microposts la célula está unido a. </li><li> Deseche cualquier microposts no deseados haciendo clic en &quot;Descartar Mensajes&quot; y utilice el cursor de cruz para el dibujo. Adjunte todos microposts que pertenecen a una celda fuera de la sección de imagen o que son desviados por cualquier otra razón, pero no por la célula de interés. </li><li> Inicie el software de subrutina &quot;Encuentra centroides&quot; por clic del ratón. Ajustar la configuración justo al lado del botón &quot;Buscar centroides&quot; hasta que todos microposts están registrados, que es visible por una cruz roja en su centro de filtro. Si el ajuste del filtro es demasiado serán ignorados microposts bajas, si es demasiado alta muposiciones ltiple estarán marcados por un solo micropost. Mantenga el filtro de la creación constante durante una sesión de análisis. </li><li> Utilice la función de edición manual &quot;Edición manual&quot; para centroides con múltiples o perdidas posiciones micropost. Utilice la cruz del ratón para seleccionar el micropost en cuestión haciendo clic y arrastrando al otro lado. Haga doble clic dentro del rectángulo y colocar el marcador rojo que falta en la sección de imagen ampliada, que se cierra automáticamente. Descartar una micropost como si está fuera del contorno celular dibujado (véase el paso 4.5) antes de continuar. </li><li> Encuentra la red micropost ideales mediante la activación de la función &quot;Generar cuadrícula&quot; con un clic del ratón. Asegúrese de que la posición se corresponde con la verdadera cabeza micropost, que se muestra por un anillo azul, adentro de la línea celular dibujado. </li><li> Corrija cualquier fabricante de rejilla fuera de lugar dentro del área de la celda donde sea necesario el uso de la función correspondiente &quot;Manuel Editar&quot; con un clic del ratón. Utilice la cruz para seleccionar el micropost en question haciendo clic y arrastrando al otro lado. Haga doble clic dentro del rectángulo que aparece y colocar el marcador azul perdido en la sección de imagen ampliada, que se cierra automáticamente. </li><li> Utilice el botón &quot;Calcular&quot; deflexiones por clic del ratón para obtener un histograma de los valores de deflexión estimado a partir de la diferencia entre la posición de un micropost dentro de la sección de imagen y la rejilla ideal generado. </li><li> Guarde el análisis completo que incluye las tablas de valores por un clic del ratón en &quot;Guardar&quot;. </li><li> Continuar con el análisis de la imagen, ya sea haciendo clic en &quot;Reset View&quot; y analizar otra sección de imagen o clic con el ratón en &quot;Siguiente Imagen&quot;, que convenientemente se puede hacer con la tecla de cursor derecha del teclado. </li></ol> 5. Análisis de Datos - Mechanoprofiling <ol><li> Abra el archivo &quot;Results.xls&quot; con un programa de hoja de la oficina de la carpeta con las imágenes analizadas. Contiene los datos con otrosl valores calculados incluyendo todos deflexiones micropost y medidas derivados estándar, tales como el trabajo (es decir, la energía de deformación del sustrato) por la célula analizada. </li></ol>

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The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

Este trabajo busca avanzar en el campo de la microscopía de fuerza de tracción al reducir sustancialmente los obstáculos técnicos y prácticos a la entrada. Estas barreras provienen de dos lados. En primer lugar están los numerosos desafíos técnicos no triviales que se deben superar para fabricar de forma reproducible y poner en marcha una serie micropost experimentalmente. En segundo lugar, es la necesidad de manera similar no trivial para un análisis semiautomatizado fiable de las fuerzas de células individua...

Ensayos basados ​​en células de mecanoterapia sensibles permiten investigar las células adherentes, con una amplia gama de aplicaciones que reflejan el papel central que la mecánica pueden desempeñar en la biología celular. Estas aplicaciones suelen centrarse en los mecanismos subyacentes que impulsan procesos subcelulares o el comportamiento de células enteras. Por un lado, los factores ambientales externos, tales como composición de la matriz extracelular o la rigidez de la matriz puede afectar dramáticamente la respuesta mecánica y biológica de una célula. 1 El mismo se puede observar después de su uso de muchas clases de compuestos farmacéuticamente activos, los efectos de los cuales son caracterizan a menudo el uso de modelos de cultivo celular. 2 En las otras propiedades genotípicas de mano, tales como las causadas por mutaciones genéticas espontáneas o inducidas experimentalmente, puede inducir cambios marcados en el fenotipo celular que están asociadas con alteraciones en la estructura y función del citoesqueleto. 3 Estos ejemplos son sólo algunos de los muchos posiblestemas para los que fenotipificación mecánica de las células es relevante, y todos ellos han sido útilmente investigado con matrices micropost. Al momento de escribir esto, alrededor de 200 artículos han sido publicados describiendo la interacción célula-micropost. Estas obras discuten aspectos teóricos de micropost principios de desviación, así como instrucciones prácticas sobre su fabricación. El primer artículo que describe la interacción de las células y matrices micropost flexibles fue publicado por Tan y sus colegas en 2003. 4 En contraste con la microscopía de fuerza de tracción clásica (TFM), donde se utilizan sustratos blandos continuos para estimar la contractilidad celular nanonewton escala, Tan et al. se describe un método que utiliza múltiples vigas verticales espaciados estrechamente hechos de elastómero de silicona. Las principales ventajas de esta técnica emergen de dos características principales. En primer lugar con el fin de cambiar la rigidez del sustrato de células aparente sólo se necesita cambiar las dimensiones micropost mientras se mantienela composición de otra manera constante y evitando de esta manera las diferencias en la topología de la superficie y la química del sustrato. Segundo microposts actúan como resortes individuales que se pueden analizar de forma discreta con la fuerza y ​​la resolución espacial del orden de adhesiones focales individuales y pueden reducir los desafíos analíticos que son inherentes al análisis análoga por la norma TFM. Hoy en día la gama de aplicaciones para las matrices micropost excede en gran medida sólo el mapeo de las fuerzas de unas pocas células individuales. Por ejemplo, Akiyama informa el uso de un aislado de tejido vaso dorsal a partir de una oruga de la polilla como un actuador para una matriz de micropost, con el fin de desarrollar un robot autónomo micro-músculo-accionado de insectos. 5 Sin embargo, las aplicaciones más publicadas de microposts se han centrado en los estudios de las condiciones médicas como infección o cáncer. Por ejemplo, las matrices micropost se han utilizado para estudiar la generación de la fuerza de liado IV pili tipo de Neisseria gonorrhOEA colonias que se asocia con la mejora de cascadas de señales infección. 6 Otros han utilizado microposts para estudiar las células de cáncer de mama tratados con compuestos farmacéuticos dirigidos a la citoesqueleto. 7 Desviación de un micropost se describe a menudo utilizando la teoría clásica de haz para un voladizo con una carga final asumiendo la célula se une sólo a la punta de la micropost. Aquí la fuerza aplicada F que provoca una deflexión δ depende de k &quot;rigidez a la flexión&quot; de la micropost y se calcula por: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) con E, I, L y siendo el módulo de Young, área de momento de inercia y haz de longitud respectivamente. Sin embargo, los resultados de esta ecuación sólo dan una aproximación general de las fuerzas en el trabajo ya esquila viga y flexión, así como la deformación del sustrato no se tienen en accontar. Teniendo en cuenta que microposts se hacen típicamente de materiales blandos como polidimetilsiloxano (PDMS) basado en caucho de silicona estos factores deben ser incluidos. . Schoen et al demostraron que existe un factor de corrección tales basada en la relación de aspecto de la micropost (L / D) y del polímero correspondiente relación de Poisson v 8 Lo administra.: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Con T de inclinación (v) un coeficiente de inclinación que incluye como se puede encontrar en el mismo artículo de ajuste de parámetros a = 1,3: <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Eso significa que la rigidez corregida de un micropost k corr es el producto de la rigidez a la flexión pura k = k se doblan y el factor de corrección corrdada por: <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Por lo tanto, los cálculos de fuerza células deben realizarse utilizando la variación más refinada de la ecuación (1) ya la lectura: <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) El impacto de la corrección se hace más evidente tan pronto como se utilizan los valores típicos para las dimensiones micropost. Por ejemplo, una larga micropost 15 micras con una sección transversal circular y un diámetro de 5 micras hecha de caucho de silicona a base de PDMS conduce a un factor de corrección de 0,77 y por lo tanto un cálculo no corregida sería sobreestimar las fuerzas de células ejercida por 23%. Esto se hace aún más grave para microposts con relaciones de aspecto más pequeños. Tradicionalmente, el análisis de imagen micropost también se ha basado en la viga idealizada teoría de la flexión. En 2005 el grupo que fue pionero en el uso de micrmatrices opost publicaron un software de análisis de imagen adecuado para el análisis micropost 9 El software requiere una licencia de software y el usuario debe tomar tres imágenes para cada posición.; uno de cada uno de los planos superior e inferior de la micropost en modo de transmisión y otro en modo de fluorescencia con la célula teñida. Después de comparar las posiciones superior e inferior para cada micropost el software determina un campo vector de fuerza y ​​calcula los parámetros relacionados como la fuerza por correo. Existen otros paquetes de software y sus principios de análisis se mencionan brevemente en los artículos correspondientes que los describen, pero estos paquetes de software de análisis generalmente no están disponibles al público. 10,11 Las matrices micropost diseñados para las fuerzas de células mapeo se pueden clasificar como estar en una disposición ortogonal micropost o un ser hexagonal, el último de los cuales tienen la ventaja de huecos equidistantes entre todos microposts vecinos. Microposts típicos jave una sección transversal circular y sus dimensiones varían desde 1.0 micras a 10 micras de diámetro y de 2 a 50 micras de longitud. 4 Sin embargo, microposts con sección transversal elíptica o cuadrada también se han reportado 12,13. El uso de mezclas de silicona a base de PDMS como material de micropost permite la adición de las nanopartículas en la mezcla. Por ejemplo la adición de cobalto nano-barras permite una activación magnética del micropost y por lo tanto da otro grado de libertad de los posibles diseños experimentales. 14 La mayoría de los grupos producen sus matrices micropost en sustratos rígidos planos como cubierta de vidrio o en el interior de una caja de Petri. Sin embargo, Mann y sus colaboradores informaron recientemente una serie micropost formado sobre una membrana elástica. 15 Esto permite que la aplicación de fuerzas de células estiramiento a células adherentes mientras estudiaba de células en vivo subcelular respuestas dinámicas en cuanto a la contractilidad celular. El estab y más ampliamente empleadocido proceso para la fabricación de matrices micropost se basa en litografía blanda como se describe en los protocolos de Sniadecki interesantes y sus colegas 16-18. En los procesos de sala limpia estándar cortos se utilizan para generar las microestructuras en la parte superior de una oblea de silicio usando fotorresistente SU8. Esto es seguido por un proceso de copiado en el que el caucho de silicona se proyecta sobre las estructuras de la transferencia de ellos en los moldes. En una segunda etapa estos moldes se usan para replicar la microestructura inicial usando caucho de silicona en la parte superior de un sustrato elegido. Sin embargo a pesar del número grande y creciente de publicaciones relacionadas con su aplicación, estableciendo un proceso de fabricación de microposts lleva una considerable cantidad de tiempo incluso para los expertos micro-ingeniería; hay muchos pasos de proceso que requieren la optimización y adaptación al entorno de laboratorio específica y el diseño micropost para producir un nivel de calidad aceptable. Matrices micropost comerciales están ahora disponibles en una lista-tformato o-uso (&quot;off-the-shelf&quot;) con una alta calidad constante. Como tales, son una alternativa al proceso de fabricación complejo y largo requerido para la producción in situ. En este trabajo se utilizó una matriz micropost disponible en el mercado para el mapeo de las fuerzas celulares utilizando imagen de microscopía un solo campo brillante. Más importante este artículo describe y documenta un software de código abierto completamente funcional llamado MechProfiler, que está disponible para su descarga como material complementario a este manuscrito. Una versión mantenido activamente del software también se puede encontrar en http://www.orthobiomech.ethz.ch. La combinación de un ensayo de &quot;off-the-shelf&quot; y un software de análisis de código abierto compatible reduce notablemente el obstáculo de entrada para lograr experimentos TFM precisos. Los investigadores no tienen acceso a cualquiera de las instalaciones de sala limpia o experiencia en el desarrollo de software pueden analizar las fuerzas celulares con éxito. Permite a un usuario a centrarse en los mechanossalida ensayo ensitivity en lugar de la tecnología en sí, y hace mediciones de fuerza de tracción a disposición de una comunidad más amplia. Además, este es un paso importante para allanar el camino hacia la detección completamente automática de matrices micropost. El software de análisis MechProfiler procesa imágenes en formato tiff archivo, png, bmp y gif. Las imágenes pueden ser tomadas usando la fluorescencia, contraste de fase o el microscopio óptico de campo claro. El programa independiente se ejecuta junto con el Compiler Runtime libre de Matlab (disponible en: Figura 12) y los algoritmos subyacentes permite el procesamiento de imágenes aerodinámico, que permite al usuario procesar las imágenes con células individuales o múltiples en aproximadamente 1 min. Además, estas células o bien pueden estar viviendo o &quot;fijos&quot;. El software MechProfiler es capaz de aumentar en gran medida el análisis de datos de rendimiento basándose en la reproducibilidad de arrays micropost calidad comercial, más específicamente, el valor predeterminado &amp; #8220; no desviada &quot;posición de cada mensaje en la matriz puede presumirse en contra de una rejilla ideales (desviaciones de fabricación de la red en las matrices utilizadas para este estudio tenían menos de 100 nm). En resumen se abre una selección de archivos de imágenes para el análisis, los cultivos de la región de interés, define los puestos de trabajo regulados por las células o que deben ser desechados, determina las posiciones de correos, calcula las desviaciones / fuerzas contra la red de ideales, y, finalmente, guarda todos los datos específicos de la célula con una posibilidad para la exportación, incluyendo a una hoja de cálculo estándar de oficina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS-buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropost array&#160;</td>
			<td rowspan="2">MicroDuits</td>
			<td rowspan="2">MPA-col1/FN</td>
			<td>Micropost dimensions:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td>
			<td>&#216;= 6.4 &#181;m, l=18.2 &#181;m; grid=&#160;13 &#181;m, kcorr= 2.87 nN/&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100.983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td>Coomassie blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol ACS p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>WillCo Wells BV</td>
			<td>GWSb-3522</td>
			<td>35 mm diameter, aperture 22&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-100 Eclipse</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3-L3</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Camera controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS Fi2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

La principal ventaja de la técnica descrita radica en su simplicidad y su potencial para la integración rápida y efectiva sobre el trabajo de laboratorio de rutina. La combinación de redes de sensores comerciales de alta calidad combinados con software de código abierto proporciona información acerca de mecano-sensibilidad que de otro modo requiere el acceso a las instalaciones de sala limpia y un profundo conocimiento de análisis de imagen y desarrollo de software. La figura 1 ilustra el flujo d...

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Fácil y Precisa mecanoterapia perfiles en micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.0K vistas.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

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Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

El estudio de las trayectorias celular Rolling en los patrones del receptor asimétrica

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Investigación

Bioingeniería

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., global gene expression, cell division) encountered within living cells. However, such systems, used in conventional macro-scale bulk reactors, often fail to exhibit the dynamic behaviors and efficiencies characteristic of their living micro-scale counterparts. Understanding the impact of internal cell structure and scale on reaction dynamics is crucial to understanding complex gene networks. Here we report a microfabricated device that confines cell-free reactions in cellular scale volumes while allowing flexible characterization of the enclosed molecular system. This multilayered poly(dimethylsiloxane) (PDMS) device contains femtoliter-scale reaction chambers on an elastomeric membrane which can be actuated (open and closed). When actuated, the chambers confine Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reactions expressing a fluorescent protein, allowing for the visualization of the reaction kinetics over time using time-lapse fluorescent microscopy. Here we demonstrate how this device may be used to measure the noise structure of CFPS reactions in a manner that is directly analogous to those used to characterize cellular systems, thereby enabling the use of noise biology techniques used in cellular systems to characterize CFPS gene circuits and their interactions with the cell-free environment.

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Arrays precintable Cámara femtoliter para Biología de Células gratis

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

Microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación Neuronal y Axonal señal propagación

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

Redes de cardiomiocitos derivados de iPSC humanos en matrices de microelectrodos multipolos para grabaciones potenciales de acción recurrente

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

Fabricación de ti3C2 Matrizs de Microelectrodos MXene para Grabación Neuronal In Vivo

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...