실리콘 마스터 몰드 제작 리소그래피 자료 : <ul><li> 75mm 실리콘 웨이퍼 </li><li> SU - 8 2 마이너스 포토 레지스트 (Microchem, 보스톤, MA) </li><li> N2 </li></ul> 방법 : <ol><li> 2 시간 동안 120 ° C에서시 웨이퍼를 탈수. </li><li> 7분에 대한 UV 오존 처리의 표면은 유기물을 제거합니다. </li><li> N2 블로우 표면은 입자를 제거합니다. </li><li> 적용 SU - 8을 표면의 70 % (75mm 웨이퍼를위한 ~ 10 ML) 커버 2. </li><li> 300 RPM / s의 가속도와 함께 20 초 동안 2,000 rpm으로 회전. </li><li> 95 ° C.에 실온에서 열판과 진입로에있는 웨이퍼 플레이스 </li><li> 95 15 분 동안 포토 레지스트를 Softbake ° C. </li><li> 홍수가 20 웨이퍼를 노출 - 25 mJ/cm2 복용량을 365 nm의 (I - 라인) 하단에 레이어를 형성합니다. </li><li> 적용 SU를 8초 포토 레지스트 레이어 2. </li><li> 약 11 μm의 두께 필름 300 RPM / s의 가속도와 함께 20 초 동안 550 rpm으로 회전. </li><li> 65 ° C.에 실온에서 열판과 진입로에있는 웨이퍼 플레이스 </li><li> ° C 5 분 65 웨이퍼를 Softbake. </li><li> 65에서 열판 램프 ° C 95 ° C. </li><li> 95에서 55분 위해 웨이퍼를 Softbake ° C. </li><li> 20 분 상온에 쿨 웨이퍼. </li><li> 웨이퍼에 mPAD 마스크를 정렬 및 95에 대한 노출 - (I - 라인) 365 nm의 100 mJ/cm2 복용량. </li><li> 95 ° C.에 실온에서 열판과 진입로에있는 웨이퍼 플레이스 </li><li> 포스트 - 노출 95 25 분 동안 포토 레지스트를 구워 ° C. </li></ol> 개발 자료 : <ul><li> 100mm 유리 요리 (5) </li><li> 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA) </li><li> 이소프로판올 (IPA) </li><li> N2 </li></ul> 방법 : <ol><li> 화학 후드에서 PGMEA (2), IPA, 그리고 헥산 (2) 5 개 요리를 입력합니다. </li><li> 10 초 첫번째 PGMEA에서 웨이퍼를 개최 </li><li> 50 초만 웨이퍼 선동 </li><li> PGMEA의 초승달 모양과 둘째 PGMEA에 웨이퍼를 전송합니다. </li><li> 5 초 동안 선동. </li><li> PGMEA의 초승달 모양과 IPA에 웨이퍼를 전송합니다. </li><li> 20 초 동안 선동. </li><li> 첫째 IPA에 웨이퍼를 전송합니다. </li><li> 5 초 동안 선동. </li><li> 둘째 IPA에 웨이퍼를 전송합니다. </li><li> 5 초 동안 선동. </li><li> 신속 IPA의 초승달 모양과 둘째 IPA에서 웨이퍼를 제거하고 N2와 건조 </li><li> 패턴을 검사합니다. </li><li> 120 ° C 14~20시간시키기위한 상호 연결 SU - 8에서 편도를 넣은 설탕 과자 웨이퍼. </li><li> 다이아몬드 커터로 웨이퍼를 다이스 </li><li> 에폭시를 사용하여 유리 슬라이드에 웨이퍼 마운트 </li><li> (복제 성형의 지침을 참조) 웨이퍼를 Fluorosilanize </li></ol> mPADS의 복제 성형 마이너스 몰드 자료 : <ul><li> 보트 무게 일회용 알루미늄 </li><li> Polydimethylsiloxane (PDMS) 기본 및 치료 에이전트 (다우, 미들랜드, MI) </li><li> Razorblade </li><li> 실란 (tridecafluoro - 1 ,1,2,2 - tetrahyrooctyl) - 1 - trichlorosilane </li><li> 유리 슬라이드 </li><li> 유리 파스퇴르 피펫 </li></ul> 방법 : <ol><li> 거품을 제거하는 1 시간 진공 미만의 무게와 데가스하여 PDMS 10시 1분를 섞습니다. </li><li> 알루미늄 보트에 넣어 실리콘 마스터 금형. </li><li> 50 붓고 - 알루미늄 보트 마스터 몰드를 통해 PDMS의 60g 있습니다. </li><li> 거품을 제거하는 30 분 진공하에 데가스. </li><li> N2의 빠른 폭발과 PDMS의 표면 갇힌 기포를 날려. </li><li> 110 대류 오븐에 넣어 보트는 ° C 15 분 동안 PDMS는 기업 때까지. </li><li> 알루미늄 보트를 버려야. </li><li> razorblade로 실리콘 마스터 아래 PDMS 멀리 트림. </li><li> 멀리 실리콘 마스터에서 필 PDMS는 천천히 한 방향으로 지속적인 운동과 함께 마스터를 파괴하지 않도록합니다. </li><li> 손해에 대한 실리콘 마스터를 검사합니다. </li><li> 네 조각으로 부정적인 금형 컷. </li><li> 부정적인 금형의 대규모 배치에 대한 1-10 단계를 반복합니다. </li><li> 산소 플라즈마 표면을 활성화 1.5 분 동안 부정적인 금형을 치료하거나, </li><li> 오존은 표면을 활성화하기 위해 10 분 동안 부정적인 금형을 처리합니다. </li><li> 노출 mPAD 기능 dessicator에 부정적인 금형을 놓으십시오. </li><li> dessicator의 중심에 유리 슬라이드에 실란의 250-500 μL을 확산 </li><li> dessicator 안쪽 끝에서 실란의 150-200 μL와 플레이스 유리 파스투레 피펫. </li><li> 진공 챔버&gt; 14 시간 동안 실란 및 외투 부정적인 금형을 증발합니다. </li></ol> mPADS 자료 : <ul><li> Polydimethylsiloxane (PDMS) 기본 및 치료 에이전트 (다우, 미들랜드, MI) </li><li> 와이드 - 입 일회용 전송 pipettes </li><li> 2 &quot;X 3&quot;유리 슬라이드 </li><li> 유리 스크 라이브 </li><li> N2 </li></ul> 방법 : <ol><li> 거품을 제거하는 1 시간 진공 미만의 무게와 데가스하여 PDMS 10시 1분를 섞습니다. </li><li> &#39;교차&#39;에 silanized 부정적인 금형을 레이스 </li><li> 피펫 PDMS은 부정적인 금형에 기능이 완전히 1mm 두께로 덮여되도록. </li><li> 표면에 상승하는 PDMS에 공기 방울 30 분 동안 기다리십시오. &lt;/ 리&gt; <li> N2의 흐름 30 &#39;다운 타임에, 먼지 22x22mm (제 2) 유리 coverslips. </li><li> 산소 플라즈마 처리 유리 슬라이드 유리를 청소하고 활성화 1.5 분 반쪽 </li><li> N2의 빠른 폭발과 PDMS의 표면 갇힌 기포를 날려. </li><li> 부드럽게 PDMS 직면 플라즈마 청소 면을 PDMS에 유리 coverslip의 가장자리를하다. 천천히 유리 슬라이드를 낮출 수 있도록 PDMS 완전히는 연락처 전체 유리 표면을 것을하고 유리 슬라이드 아래에 갇혀 점점 공기 방울을 피하십시오. </li><li> 장소는 20 시간 동안 ° C가 완전히 치료 110 대류 오븐에서 금형을 조립. </li><li> 오븐에서 금형을 제거하고 RT에이 식지. </li><li> 한 위에 손을 천천히 부정 벗겨 버릴 mPAD 발표 바닥에서 부정적인 금형과 유리 슬라이드를 잡아. </li><li> 붕괴 게시물에 대한 현미경 mPAD을 검사합니다. </li><li> 플라즈마와 실란 매 4 주물을 통해 다시 silanize 곰팡이. 좋은 복제에 대한 부정적인 금형 수명은 약 60-20 캐스트입니다. </li></ol> mPADS에 심는 세포 스탬핑 자료 : <ul><li> uCP에 대한 PDMS 스탬프 (조직 공학의 방법에 티엔, J &amp; 첸, CS, 2001 논문집, pp 113-120을 참조하십시오.) </li><li> 에탄올 (100 % 및 70 %) </li><li> 살균 탈이온수 </li><li> 무균 탈이온수 50 UG / ML 인간 Fibronectin (BD Biosciences) </li><li> 5 UG / ML DiI 솔루션은 0.2 μm의 막 (D - 3886, 분자 프로브, OR)와 필터링 </li><li> 2퍼센트 Pluronics F127 (BASF, 마운트 올리브, NJ) </li><li> 1X 인산 버퍼 솔루션입니다. </li><li> 100mm X 25mm 페트리 접시 (4) </li><li> 150mm X 25mm 페트리 접시 (2) </li><li> 알루미늄 호일 </li><li> N2 </li><li> 족집게 </li><li> 무균 후드 </li></ul> 방법 : <ol><li> mPADs에서 트림 초과 PDMS </li><li> PDMS 스탬프는 이전에 다음 ID로 사용되고있다면, 오염 단백질을 멀리 스크럽 5 분 100 % 에탄올에 우표를 sonicate. </li><li> 무균 모자, 신선한 100 %의 에탄올과 멸균 물의 우표를 수영 후 핀셋과 N2와 건조 자신의 양쪽에 우표를 개최 </li><li> 측면을 작업과 함께 150mm 배양 접시에 놓습니다. </li><li> 나누어지는 각 우표에 fibronectin 솔루션 방울. 다음 우표의 각 모서리, 가장자리, 그리고 마지막으로 내부 지역과 함께 시작합니다. 우표의 처음 PDMS의 표면은 소수성이지만, 단백질이 adsorbed와 같이 친수성이된다. 작업 &quot;으로 외부 내부&quot;변경 fibronectin 솔루션의 낮은 볼륨을 완전히 코팅 도장을 필요되도록 PDMS의 접촉 각도. </li><li> 단백질 흡착을위한 후드 1 시간 동안 앉아 보자. </li><li> 접시에 쏟아져 및 수위는 우표를 통해 상승시키는 의해 DI 워터와 함께 우표를 씻으십시오. </li><li> DI 워터 가득 100mm 배양 접시에있는 우표를 씻으십시오. </li><li> 제거하고 N2와 건조. </li><li> 오존 처리의 mPADS 7 분 동안 스탬프에 대한 표면을 활성화합니다. </li><li> 후드에서 mPAD에 스탬프 우위를 넣어 부드럽게 모든 연락처를 만들기 위해 낮추어 mPADS를 도장. 살짝 모든 분야 좋은 접촉을 보장하기 위해 족집게로 우표 상단 탭하지만 게시물을 붕괴하지 않도록주의합니다. </li><li> 조심스럽게 핀셋와 우표를 제거합니다. </li><li> ~ 15 초 동안 100 % 에탄올로 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. 요리 사이에 빠르게 전송하여 전송 중에 dewetting에서 microneedles 보관하십시오. </li><li> ~ 15 초 동안 70 %의 에탄올과 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> ~ 15 초 동안 DI 워터와 함께 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> ~ 15 초 동안 DI 워터와 두번째 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> DI 워터와 함께 150mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> DiI 솔루션의 100 ML와 150mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> 알루미늄 호일로 뚜껑을 덮고 1 시간 만끽해보세요. </li><li> ~ 15 초 동안 DI 워터와 함께 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> 2 % Pluronics 10 ML 및 0.2 % Pluronics 총 농도에 대한 PBS의 90 ML과 150mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> 커버 1 시간 동안 만끽해보세요. </li><li> ~ 15 초 동안 DI 워터와 함께 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> ~ 15 초 동안 DI 워터와 두번째 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li><li> ~ 15 초 동안 PBS하게 제 3 100mm 배양 접시에있는 잠수함의 mPADS. </li></ol> 시딩 자료 : <ul><li> 선택한 셀 라인 </li><li> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) • 4Na, Gibco 고양이와 0.25 %의 트립신. 번호 25200-056) </li><li> 성장 매체 </li><li> 1X 인산 버퍼 솔루션입니다. </li></ul> 방법 : <ol><li> 무균 후드, 100mm 배양 접시에있는 장소 mPADS 및 17 ML 매체로 기입하십시오. </li><li> 인큐베이터에 넣어 배양 접시 37을 따뜻하게 ° C </li><li> 트립신을 통해 세포를 일시 중지 </li><li> 셀 클러스터를 깨고 반복 대기음. </li><li> mPADS와 페트리 접시에 Pipet 세포 현탁액. 그들이 분석의 시간에 하나의 세포 (세포 세포 접촉없이) 상태로 유지됩니다 이러한 세포를 추가합니다. 추가 세포의 정확한 양은 셀 타입의 특정하고세포 확산 영역과 성장 속도에 따라 다릅니다. </li><li> 부드럽게 천천히 pippetting와 배양 접시에있는 세포를 해산. </li><li> 인큐베이터에 넣어 2 시간 동안 세포가 microneedles에 정착하고 준수하도록. </li><li> 세포가 확산있다면 볼 수 mPADS을 검사합니다. 세포는 평평 보이는 여섯 개 이상의 게시물을 걸쳐 것입니다. </li><li> 세포가 확산있다면, 신선한 중간 21 ML 새로운 100mm 페트리 접시에 mPADS를 전송할 수 있습니다. </li><li> mPADS는 실험을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> mPADS 스테 이닝 및 장착 고정 자료 : <ul><li> 탈이온수 </li><li> Paraformeldahyde (16 %) 유리병 </li><li> 10X 프로스 페이트 버퍼 솔루션입니다. </li><li> 1X 인산 버퍼 솔루션입니다. </li></ul> 방법 : <ol><li> 50mL 원심 분리기 튜브에서 DI 30 ML, paraformeldahyde 10 ML (전체 유리병) 및 고정 솔루션 10X PBS 4.5 ML를 추가합니다. </li><li> 100mm 페트리 접시에 솔루션을 고칠 수있는 ~ 25 ML을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 잠수함은 접시를 고정으로 전지와 mPAD 20 분 동안 품어하자. </li><li> 1X PBS로 100mm 그릇에 세 번 잠수함의 mPADS. </li><li> immunostaining 및 장착을위한 준비. </li></ol> mPADS에 세포 힘을 분석 공촛점 이미징 자료 : <ul><li> 공촛점 현미경 </li><li> 63X 목표 </li><li> 차 항체에 대한 필터 큐브 </li><li> microneedles의 DiI 이미징을위한 그린 필터 큐브 (Rhodamine). </li></ul> 방법 : <ol><li> 플레이스 무대에서 mPADs 및 300 MS 노출, 안돼 비닝 단일 세포를 찾으십시오. </li><li> TOP 이미지 microneedles의 이미지 꼭대기. </li><li> Z - 제어 기록을 사용하여, 하단 이미지 microneedles의 이미지를 캡처합니다. </li><li> 이미지가에 얼룩을 (Hoechst, phalloidin 등)이 다른 채널을 </li></ol> 이미지 분석 자료 : <ul><li> 이미지 처리 도구와 MATLAB </li></ul> 방법 : <ol><li> 상단과 하단 이미지를 회전하여 등록 </li><li> 측정 하단의 centroids (undeflected)과 최고 (편향) 위치 </li><li> 변위를 계산 </li><li> 게시물 (알려진 게시물 기하학에 따라)에 대한 지속적인 스프링을 사용하여 각 게시물에 힘을 벡터를 계산 </li><li> 오류 분석은 군대를 해결하는 능력에 기반하고 이미지 해상도와 중심 감지 해상도에 따라 달라집니다입니다 </li><li> 다른 조건 등에 걸쳐 예를 들어, 힘 magnitudes 및 / 또는 방향, 시간 과정으로, 많은 측정 - 사용자 정의 필요에 따라 같은 데이터를 정렬 </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li><li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S., Wang, Y. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Silicone+Elastomeric+Post+Arrays+for+Measuring+Traction+Forces+of+Adherent+Cells.">Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells.</a> Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. 83, 313-328 (2007).</li><li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics &amp; Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li></ol>

microfabricated post-array-detectors (mpads): an approach to isolate mechanical forces

이 비디오에서는, 우리는 게시물 microfabricated 배열을 사용하는 셀룰러 견인 세력을 측정하는 접근을 제시합니다. 견인 세력은 마이 오신 - 굴지의 상호 작용을 통해 생성 및 생리학에 중요한 역할을하고 있습니다. 개발하는 동안, 그들은 세포 조직의 초기 구조를 형성 한 위치에서 순서대로 다음으로 이동할 수 있습니다. 견인 세력은 치유 과정에 도움이됩니다. 그들은 상처의 적절한 폐쇄 또는 신체를 통해 마이 그 레이션 및 leukocytes의 크롤 링을 위해 필요합니다. 이 같은 군대는 암 전이 또는 종양으로 혈관 성장의 경우 우리의 건강에 해로운 수 있습니다. 체외에서 세포를 공부하는 가장 일반적인 방법은 유리 또는 폴리스티렌 접시를 사용하도록되었습니다. 그러나 기판의 강성은 불가능 물리적 셀 견인 세력을 측정하게하고, 견인 세력을 연구하기 위해 상대적으로 몇 가지 방법이 있습니다. 우리 연구실은 이러한 한계를 극복하기 위해 기술을 개발했습니다. 방법은 각 세포가 여러 cantilevers 전역과 그 과정에서 그들을 비켜 이러한되어있는 유연한 cantilevers, 강성과 크기 규모의 수직 배열을 기반으로합니다. 우리가 사용하는 기둥은 10 μm의 높이 직경 3 μm의, 있으며, 9 μm의 중심 - 투 - 중심 간격과 일반 배열에 구성됩니다. 하지만 이러한 물리적 치수는 쉽게 연구의 다양한 수용 다양한 수 있습니다. 우리는 실리콘 마스터로 시작하지만, 최종 게시물은 실리콘 고무 (디메틸 실록산) 폴리, 또는 PDMS라는 밖으로 만들어집니다. 우리는 현미경 deflections을 측정하고 관찰 deflections를 생성하는 데 필요한 견인 세력의 크기와 방향을 계산할 수 있습니다. 우리는이 기판은 이후 배열 탐지기, 또는 mPADs을 microfabricated 전화. 여기, 우리는 세포의 수축성 modulations을 평가할 수 mPADs를 조작하고 사용하는 방법을 보여줍니다.

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Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

이 비디오에서는, 우리는 세포의 수축성 modulations을 평가하기 microfabricated 게시 배열 검출기를 (mPADs) 조작하고 활용하는 방법을 보여줍니다.

Microfabricated 포스트 - 배열 감지기 (mPADs) : 기계적 힘을 분리하는 접근

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

12.4K 조회수.  University of Pennsylvania. 이 비디오에서는, 우리는 세포의 수축성 modulations을 평가하기 microfabricated 게시 배열 검출기를 (mPADs) 조작하고 활용하는 방법을 보여줍니다.

비디오: Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

진단 도구를 개발하기 위해 마이크로 전자 기계 시스템 (MEMS)를 사용

연구

생물학

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

전 비켜</em이미징 및 미세 애플 리케이션에 적합> 치킨의 배아 문화 시스템

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

마우스에서 대뇌 골후혈구를 분리하는 고출력 방법

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...