El protocolo demuestra un método confiable y reproducible para aislar y cultivar células endoteliales de alta pureza de ratones que podrían tener múltiples aplicaciones. Esta técnica es un método más sencillo que preserva el rendimiento y la pureza de las células endoteliales. Demostrando el procedimiento estará Nina Nguyen, una investigadora asociada de mi laboratorio.
Para comenzar, vórtice las cuentas magnéticas durante unos segundos. Pipetear 50 microlitros de las perlas en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para CD31 y CD102. Agregue un mililitro de tampón de lavado de perlas y mezcle bien.
Coloque los tubos en un separador magnético y retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur. Vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón de lavado de perlas. Luego agregue cinco microlitros o 2.5 microgramos de anticuerpos CD31 o CD102 a cada 50 microlitros de perlas.
Incubar la suspensión de perlas con una rotación suave en un rotador de extremo a extremo durante la noche a cuatro grados centígrados o durante tres horas a temperatura ambiente. Lave las inmunoperlas cuatro veces y luego vuelva a suspender las inmunoperlas en 50 microlitros de tampón de lavado de perlas. En el día del aislamiento, agregue 25 mililitros de HBSS a 25 miligramos de colagenasa tipo uno e incube con una rotación suave.
Luego filtre usando un filtro de 22 micrómetros. Después de sacrificar a un cachorro de ratón de cinco a siete días de edad, rocíe el cadáver con etanol al 70%. A continuación, corte el diafragma superiormente hacia arriba a lo largo de todas las paredes laterales del tórax para exponer la cavidad torácica.
Inyecte cinco mililitros de DMEM frío en el ventrículo derecho del corazón hasta que los pulmones se vuelvan blancos. Luego corte los lóbulos distales a los bronquios correspondientes uno por uno para extirpar los pulmones. Tire de los lóbulos pulmonares en un tubo cónico de 50 mililitros precargado con 20 mililitros de medio basal helado.
Agite suavemente el tubo con la mano durante 10 a 15 segundos para lavar cualquier exceso de glóbulos rojos. Retire los pulmones de los medios con un colador de células y pique con tijeras esterilizadas. Transfiera el tejido picado al tubo cónico de 50 mililitros con 25 mililitros de solución de colagenasa precalentada.
Agitar suavemente en una batidora giratoria. Conecte una jeringa de 20 mililitros a una cánula roma de calibre 15 y triture la suspensión vigorosamente sin espumar de 10 a 15 veces en una suspensión celular. Filtre la suspensión a través de un filtro de celda de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.
Luego enjuague el tubo cónico utilizado para la digestión y el colador celular con 15 mililitros de medio basal. Centrifugar la suspensión celular a 400 veces G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Resuspender el pellet en dos mililitros de medio completo.
Añadir ocho mililitros de medio completo e incubarlo. Al día siguiente, lavar los frascos dos veces con 10 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio y añadir 10 mililitros de medio completo. Una vez que las células son 90 a 95% confluentes, están listas para el aislamiento primario de inmunoperlas.
Lave las células endoteliales adherentes dos veces con 10 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio. Añadir dos mililitros de solución de desprendimiento celular libre de tripsina e incubarla para asegurar la elevación de todas las células del matraz. Añadir ocho mililitros de medio basal.
A continuación, gire las células a 400 veces G durante cuatro minutos a temperatura ambiente y vuelva a suspenderlas en dos mililitros del medio basal. Perlas recubiertas anti-CD31 Vortex durante unos segundos para resuspender las perlas. Agregue 30 microlitros de perlas por cada dos mililitros de suspensión celular y asegure la tapa.
Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotador de extremo sobre extremo. Luego coloque los tubos en un separador magnético durante dos minutos. Aspire el sobrenadante y retire el tubo del imán.
Vuelva a suspender el pellet de células de perla agregando tres mililitros de medio basal al tubo y pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Reemplace el tubo del separador magnético durante dos minutos. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.
Después del lavado final, cuando el sobrenadante se vuelva claro, resuspender el pellet de células de perla en tres mililitros de medio de crecimiento completo y transferirlo a un matraz T75. Agregue siete mililitros del medio de crecimiento completo e incubarlo. Al día siguiente, vuelva a lavar las células con HBSS sin calcio ni magnesio.
Luego agregue 10 mililitros de medio completo. Una vez que las células son 90 a 95% confluentes, están listas para el aislamiento secundario de inmunoperlas. La primera selección de inmunoperlas identifica las células CD31 positivas, que crecen en una formación de adoquines.
Una segunda selección de inmunoperlas con perlas recubiertas anti-CD102 aumenta la pureza de las células endoteliales y se utiliza la clasificación celular activada por fluorescencia para confirmar que la población celular es CD31 positiva y CD102 positiva. Para estudiar las vías inflamatorias endoteliales y la función de barrera endotelial, se utilizó el tratamiento con Cytomix murino para inducir una producción significativa de IL-6 por parte de las células endoteliales con un valor de p inferior a 0,01. Además, la resistencia transendotelial disminuyó mostrando una mayor permeabilidad endotelial.
Las células endoteliales aisladas se pueden utilizar en estimulaciones de células endoteliales o ensayos de función de barrera para descubrir objetivos terapéuticos basados en el endotelio para los trastornos de disfunción endotelial.
