Este trabajo fue financiado por el Fondo Científico de Austria (FMF) conceder P18820-B13. Ética declaración: El estudio fue aprobado (PLUS_Ethik_090514) por el Comité Ético de Experimentación con seres humanos y / o animales en la Universidad de Salzburgo cumplir con los Declaraction Helsinki revisada en 1983 y todos los pacientes participantes dieron su consentimiento informado por escrito.

1. Preparación de los conjugados de las drogas <ol><li> Disolver 10 mg DF en 1 ml de dH 2 O en un tubo de 1,5 ml de reacción. En el procedimiento aún más el uso 95 l de esta solución DF. Conjugar PP para disolver 30,4 mg HSA derivado de PP (304 g / mol) en 500 l 0,3 M de hidróxido sódico (NaOH). </li><li> Añadir 430,6 l dH 2 O y 100 l 0,5 M 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES) buffer de pH 6,5 a 95 l de disolución DF. Añadir 33,1 l dH 2 O y 140 l de 2 M de tampón MES pH 2,9 a la muestra de PP. </li><li> Añadir 57,5 l de una solución recién preparada N-etil-N &#39;- (3-dimetilaminopropil) clorhidrato de carbodiimida (EDC) solución madre disuelto en dH 2 O con una concentración de 100 mg / ml de la muestra DF, a 10 l solución EDC la muestra de PP. Vortex las muestras durante 1 minuto. </li><li> Añadir 16,9 l de solución de HSA con una concentración de 118 mg / ml para cada muestra. </li><li> Incubar las muestras durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación a 300 revoluciones / min. </li><li> Diálisis del DF y las muestras de PP 3 veces contra 2 litros de tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 durante varias horas cada uno. Realizar todos los pasos de diálisis a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la muestra 10 minutos a 14.000 xg y recoger el sobrenadante que contiene DF o PP conjugado con HSA. </li><li> Compruebe sobrenadante de proteínas mediante la realización de un SDS-PAGE, utilizando geles de 12%. Carga de 12 mg de HSA conjugado en la ranura de un gel. </li></ol> 2. Determinar la tasa de acoplamiento de los conjugados de la droga (Figura 2) <ol><li> Para el análisis de la tasa de acoplamiento del DF y los conjugados de PP por utilizar una HPSEC sodio 100 mM fosfato pH 6,5 que contenía 150 mM NaCl y 0,05% de azida de sodio. Use un x 300 mm 7,8 TSK-Gel-G2000 columna SWXL. </li><li> Realizar la detección de señales mediante el uso de una línea de acoplamiento de RI y el sistema detector de UV. </li><li> Preparar una muestra de HSA estándar con una concentración de 1 mg / ml en dH 2 O. Para la calibración del detector de inyectar 50 l HSA solución estándar. </li><li> Calcular la RI RI k constante y la UV UV constante k para el detector. Utilice el área de fórmulas RI RI = k * [(dn / dc) * c HSA (HSA)] y la zona UV UV = k * [(dA / dc) * c HSA (HSA)] con (dn / dc) = HSA 0,185 y (dA / dc) HSA = 0,518 5. </li><li> Prepare DF y las normas derivadas de PP HPSEC que las cantidades de 5, 10 y 30 nmol de ambas normas pueden ser fácilmente inyectado. </li><li> Calcular los valores medios de (dn / dc) y de drogas (DA / CC) de medicamentos para ambos estándares. Por DF, a (dn / dc) de 0,235 ± 0,010 y un (DA / CC) de 39,000 ± 0,493 se determinó. Para el PP, un (dn / dc) de 0.328 ± 0.016 y una de (QA / dc) 53,155 ± 2,464 se determinó. </li><li> Inyectan drogas conjugados en HPSEC y determinar su RI y UV áreas de los picos. </li><li> Calcular la concentración de DF, derivado de PP, y HSA por la solución de los RI dos ecuaciones k = área RI * [(dn / dc) * c drogas (medicamentos) + (dn / dc) * c HSA (HSA)] y la zona UV UV = k * [(dA / dc) * c drogas (medicamentos) + (dA / dc) * c HSA (HSA)] para las incógnitas. </li></ol> 3. MTD con conjugados de drogas <ol><li> Prepare siete copas de la citometría de flujo y la etiqueta de ellos en función de su contenido: el control de mancha, el control negativo, control positivo, y los conjugados de las drogas. </li><li> Añadir 50 l de tampón de estimulación B-CCR-STB (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) en los viales reservados para el control de manchas y negativos. Como control positivo, use 50 l de una solución anti-FcεRI proporcionado por el kit CAST Flow2. Añadir la cantidad apropiada de solución de conjugado en los viales reservados para los conjugados de drogas mediante la creación de una serie de diluciones 1:10 de 0,02 -20 mg / ml DF conjugado y PP conjugado (concentraciones finales en un volumen de ensayo de 200 l). Estos experimentos de titulación se debe realizar para determinar la concentración de la activación de basófilos óptima para cada muestra. </li><li> Añadir 100 l de amortiguación estimulación a cada tubo y la sangre de 50 pacientes l de EDTA conjunto. Mezclar las muestras con cuidado. </li><li> Colocar 20 l Flow2 CAST reactivo de tinción con anticuerpos anti-CCR3 anticuerpos marcados con ficoeritrina (PE) y anti-CD63 anticuerpos marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) a cada tubo y mezclar de nuevo. No pipetear los reactivos de tinción en la muestra sin mancha! </li><li> Incubar las muestras durante 45 minutos en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Detener la reacción en hielo durante 5 minutos. </li><li> Lisis de los eritrocitos mediante la adición de 2,0 ml de reactivo CAST Flow2 lisis a cada vial y agitar suavemente. Incubar las muestras en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 500 xg y el sobrenadante decantar con precaución. </li><li> Resuspender las células en 500 l de tampón de lavado Flow2 CAST y almacenar en hielo hasta que la citometría de flujo. </li><li> Ajuste s del citómetro de flujo de voltajeCONFIGURACIÓN para dispersión frontal y lateral (FSC, SSC), mientras que la adquisición de la muestra sin teñir. </li><li> Puerta de las células como los linfocitos previsto de la parcela SSC-FSC a la trama SSC-PE. Los basófilos son identificados por un PE-etiquetados anti-CCR3 anticuerpos como CCR3 hi he SSC y la puerta que en la trama FITC-PE. El anticuerpo anti-CD63 para detectar basófilos activados está marcado con FITC. </li><li> Establecer el límite máximo de 2,5% de los basófilos como CD63 de alta en el control negativo. Una muestra se considera positiva para la activación de basófilos si basófilos&gt; 5% son CD63 de alta y el índice de fluorescencia media (MFI) de la muestra dividida por la IMF del control negativo superior a 2 (Figura 3). </li></ol> 4. Los resultados representativos: Este experimento evalúa las mejores técnicas disponibles como una herramienta útil para detectar IgE-dependiente de hipersensibilidad a la droga. Conjugados de los AINE se utilizan para la activación de basófilos. Por HPSEC con RI y detección UV estado de agregación, el grado de acoplamiento, y el rendimiento efectivo de los conjugados se determinan. Como muestra la Figura 4 muestra, el 43,5% de los conjugados DF quedó monomérica con un grado de acoplamiento de 5,0 DF / HSA. Para los agregados un grado de acoplamiento de 9,5 se determinó. El conjugado propifenazona se demostró que consisten en monómeros 68,5% con un grado de acoplamiento de 21,2. El grado de acoplamiento de los agregados fue de 27,9. En total, el grado de acoplamiento de los conjugados determina DF fue de 7,6 DF y de los conjugados de PP fue de 23,2. MTD realiza con conjugados de las condiciones más favorables (concentración de los conjugados, el tiempo de estimulación) permite la investigación de IgE-dependiente de las reacciones de hipersensibilidad en los AINE. Como se muestra en la Figura 5, sólo el conjugado PP fue capaz de desencadenar la activación de basófilos visualizado por una regulación al alza en la expresión de superficie CD63: 20,6% de los basófilos se activan caracteriza por un registro de desplazamiento en la intensidad de la fluorescencia. La IMF aumentó en un factor de 4.9 de 386 (control negativo) del año 1893. Por el contrario, con el conjugado DF sólo el 3,1% de los basófilos se activan lo que estaba por debajo del 5% de corte. Asimismo, la IMF aumentó sólo en un factor 1.1 (límite de 2.0) de 197 (control negativo) a 210. La validez del ensayo está dada por (i) &lt;5% de activación de basófilos en el control negativo, (ii) un registro de desplazamiento en la intensidad de la fluorescencia de una subpoblación de basófilos, y (iii)&gt; 50% de basófilos activados (control positivo). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" /> Figura 1. Acoplamiento de derivados DF y PP a la HSA. Después de disolver los medicamentos, agua, tampón MES, y EDC (reactivo de acoplamiento) se agregan. Las muestras se agitaron durante 1 minuto antes de HSA es una pipeta de las soluciones de drogas. Dentro de 2 horas con agitación a temperatura ambiente, las drogas se unen covalentemente a la HSA. Monómeros, así como los agregados puede dar lugar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" /> Figura 2. Cálculo de los grados de acoplamiento. En primer lugar, las constantes k RI y UV k se determinan. Por lo tanto, HSA estándar con concentración conocida se inyecta en el sistema HPSEC. (Dn / dc) y (DA / CC) de la HSA se dan los valores de 0,185 y 0,518, respectivamente 5. Las áreas de pico se utilizan para el cálculo de las constantes. En segundo lugar, para cada medicamento se inyecta tres normas para determinar las drogas y la concentración específica de RI y las áreas UV. Dado que la RI y las constantes k k UV son conocidos por los pasos anteriores, los derivados de las drogas específicas (dn / dc) y (dA / dc) se puede calcular. En tercer lugar, la droga-HSA conjugados se inyectan en HPSEC. El área del pico resultante se utiliza para calcular las concentraciones de la droga y HSA por pico por resolver las dos ecuaciones con dos incógnitas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" /> Figura 3. Gating basófilos. Las células como los linfocitos se predijo dispersión lateral cerrada frente a dispersión frontal (FSC-SSC parcela). Los basófilos son identificados como de alta CCR3 SSC Lo de los linfocitos cerrada (SSC-CCR3-PE parcela). Los basófilos son analizados para la activación (CD63 hi) en la trama CD63-FITC-CCR3-PE. El control negativo se utiliza para establecer el límite máximo de los basófilos 2,5% restante CD63 hi. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" /> Figura 4. Decidido grados de acoplamiento de los conjugados de las drogas. RI y las señales de UV muestran dos picos que representan los agregados (eluyendo con un volumen de retención bajo) y monómeros (eluyendo con un volumen de retención de alta) de la droga-HSA conjugados. Porcentajes de monómeros y agregados (determinado a partir de señales IR) y sus grados de acoplamiento se representan (n = 1). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" /> Figura 5. Basófilos Activatien la prueba. Resultados de la droga conjugada activado por las muestras, controles negativos y controles positivos se muestran en la CD63-FITC-CCR3-PE parcelas (n = 1).

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No hay conflictos de interés declarado.

MTD es una bien establecida, aunque todavía no se utilizan habitualmente método para el diagnóstico de la enfermedad mediada por IgE alérgica 6,7. De hipersensibilidad a la droga, sin embargo, su aplicabilidad es comprometido como compuestos de bajo peso molecular no son capaces de entrecruzar los receptores de IgE, un requisito previo para la activación de basófilos 8. Por lo tanto, los medicamentos en investigación deben ser covalentemente a las proteínas de soporte adecuado (por ejemplo, HSA). Es importante destacar que el grado de acoplamiento (es decir, número de moléculas de fármaco por proteína transportadora), debe ser controlada para garantizar la actividad inmunológica (es decir, receptores de IgE entrecruzamiento) de los conjugados. En teoría, dos haptenos por molécula portadora debe ser suficiente para el receptor de IgE entrecruzamiento y un mínimo de cinco moléculas DF por HSA se ha demostrado para activar la liberación de mediadores en un ensayo basado en células 4. Ambos conjugados, PP-HSA y HSA-DF, se ha determinado que muestran un grado de acoplamiento suficientemente alta (HPSEC) y que se inmunológicamente activas haciendo que los reactivos adecuados para su uso en las mejores técnicas disponibles. Otro problema puede ser que los metabolitos de las drogas puede jugar un papel, como un metabolito de la droga en lugar de los padres puede causar la reacción de hipersensibilidad. En el caso del DF, esta posibilidad ha sido evaluada en detalle con anterioridad utilizando cinco Fase I los principales metabolitos, y una variante de conexión 4. Entre los factores importantes para el dominio de la técnica descrita son la calidad de la muestra de sangre (&lt;12 horas desde la extracción de sangre, el número de basófilos detectado&gt; 500) y la optimización de las condiciones de estimulación (tiempo, dosis). Además, las llamadas no respondedores que ni siquiera reaccionan con el control positivo (anticuerpo dirigido contra el receptor de IgE) tienen que ser identificados. Por lo tanto, los criterios de validación que incluye un anticuerpo anti-FcεRI como control positivo. Una ventaja importante del uso de conjugados de drogas es el hecho de que parece no tóxico en contraste con las drogas puras, como se muestra para DF-HSA conjugado por la co-estimulación con anti-FcεRI de anticuerpos en las mejores técnicas disponibles 4. Pura DF, por el contrario, muestra efectos citotóxicos a una concentración de 1,25 mg / ml causando problemas con la interpretación de las mejores técnicas disponibles 9. En general, las pruebas de citotoxicidad potencial es altamente recomendable para todos los conjugados de las drogas de nueva producción. En este caso, hemos demostrado el potencial de la PP-HSA conjugado utilizado en las mejores técnicas disponibles para revelar hipersensibilidad mediada por IgE. Por el contrario, DF hipersensibilidad no está asociado con IgE demostrada por la falta de activación de basófilos en respuesta a DF-HSA conjugado. Es importante destacar que, en caso de duda respecto a un mecanismo mediado por IgE, conjugados tienen que ser evaluados para la actividad inmunológica de los sistemas de ensayo in vitro basados ​​en células como se ha demostrado para DF 4. Usando la configuración descrita de conjugar fármacos de bajo peso molecular de forma covalente a una proteína portadora moléculas adecuadas de una serie de reacciones de hipersensibilidad contra las drogas, incluidos los antibióticos, a otros AINEs, medios de contraste radiológico, relajantes musculares, anestésicos, etc puede ser investigado por una participación de un mediada por IgE mecanismo. Por lo tanto, las mejores técnicas disponibles pueden servir como una adición a los métodos existentes para el diagnóstico (pruebas cutáneas, pruebas de provocación oral).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / dispositivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> 2 - (N-morfolino) etanosulfónico </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7,8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL columna </td><td> Tosoh Bioscience </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrífuga de sobremesa </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Diclofenac sal de sodio </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 CAST Kit </td><td> Bühlmann Laboratorios </td><td> FK-CCR </td><td> Kit efectiva CAST 14 de junio 2011 Flow2 ahora es de lanzamiento de flujo </td></tr><tr><td> HP1100 HPLC sistema </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Albúmina de suero humano </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrífuga de laboratorio </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-etil-N&#39;-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida clorhidrato (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBS tabletas </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propifenazona derivados </td><td> Departamento de Biología Molecular de la Universidad de Salzburgo, Austria </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Agitador </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Azida de sodio </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> De bicarbonato sódico </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Matriz de detectores Triple </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> BioVortex personal V-1 más </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Agua de baño 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basophil activation test for investigation of ige-mediated mechanisms in drug hypersensitivity

Las reacciones de hipersensibilidad contra los no-esteroides anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) como propifenazona (PP) y diclofenaco (DF) se puede manifestar como Tipo I-reacciones alérgicas de tipo 1. En la práctica clínica, el diagnóstico de hipersensibilidad a la droga se lleva a cabo principalmente por la historia del paciente, como prueba de la piel no es fiable y las pruebas de provocación oral tiene riesgos que amenazan la vida para el paciente 2. Por lo tanto, la evidencia de un activo subyacente mediada por IgE mecanismo patógeno es difícil de obtener. A continuación, presentamos un método in vitro basado en el uso de los basófilos humanos derivados de la droga hipersensibles pacientes que imita la reacción alérgica efectoras en vivo. Como los basófilos de pacientes alérgicos a las drogas llevan moléculas de IgE específica para el medicamento culpable, que se activan al entrecruzamiento de los receptores de IgE y la liberación alérgica moléculas efectoras. La activación de basófilos puede ser controlada por la determinación de la regulación al alza de la expresión de superficie CD63 por citometría de flujo 3. En el caso de fármacos de bajo peso molecular, los conjugados están diseñados para permitir la reticulación IgE receptor en los basófilos. Como se muestra en la Figura 1, dos representantes de los AINE, PP y el DF, se unen covalentemente a la albúmina sérica humana (HSA) a través de un grupo carboxilo que reacciona con el grupo amino primario de los residuos de lisina. DF lleva un grupo carboxilo intrínseca y, por tanto, se puede utilizar directamente 4, mientras que uno que contiene un grupo carboxilo derivados del PP tuvo que ser organochemically sintetizado antes del estudio 1. El grado de acoplamiento de los compuestos de bajo peso molecular de la molécula de proteína transportadora y su distribución espacial es importante para garantizar la reticulación de dos moléculas del receptor IgE. El protocolo aquí descrito se aplica de alto rendimiento-tamaño de cromatografía de exclusión (HPSEC) equipado con un índice de refracción secuencial (RI) y ultravioleta (UV) del sistema de detección para la determinación del grado de acoplamiento. A medida que la metodología descrita se puede aplicar a otras drogas, la prueba de activación de basófilos (BAT) tiene el potencial de ser utilizado para la determinación de IgE-mediada por mecanismos de hipersensibilidad a la droga. En este sentido, determinar PP hipersensibilidad mediada por IgE y la hipersensibilidad DF como no-IgE-mediada por BAT.

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Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Prueba de activación de basófilos es una potente herramienta para la detección de IgE-dependiente de las alergias<em&gt; In vitro</em&gt;. En este caso, un protocolo optimizado para la prueba de activación de basófilos se utiliza para investigar hipersensibilidad a la droga. Un método para la producción eficiente de proteínas covalentes drogas conjugados y su caracterización físico-química se describe.

Test de activación de basófilos para la investigación de mecanismos IgE mediados de Hipersensibilidad a las Drogas

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Investigación

Inmunología e Infección

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo hipersensibilidad de tipo retardada Ensayo para Antigen Reglamento Específico

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.