وقد تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوية (FWF) منحة P18820 - B13. أخلاقيات البيان : تمت الموافقة على الدراسة (PLUS_Ethik_090514) من قبل لجنة أخلاقيات التجارب التي تجرى على البشر و / أو الحيوانات في جامعة سالزبورغ الامتثال للDeclaraction هلسنكي بصيغته المعدلة في عام 1983 ، وجميع المرضى المشاركين أعطت موافقتها على علم مكتوب.

1. إعداد تقارن المخدرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 10 مدافع ملغ في 1 مل O 2 درهم في أنبوب مل تفاعل 1.5. في المضي قدما 95 ميكرولتر من استخدام هذا الحل DF. لالمتقارن PP إلى حل HSA 30.4 المشتقة PP ملغ (304 غرام / مول) في 500 ميكرولتر هيدروكسيد الصوديوم 0.3 M (هيدروكسيد الصوديوم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر 430.6 درهم 2 O و 100 ميكرولتر 0.5 م 2 -- (N - morpholino) ethanesulfonic حمض (MES) درجة الحموضة عازلة 6،5-95 ميكرولتر من مدافع المنحل. إضافة ميكرولتر 33.1 درهم 2 O و 140 م 2 ميكرولتر من الحموضة عازلة MES 2.9 إلى نموذج PP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 57.5 ميكرولتر من &#39;N - N - إيثيل الطازجة -- (3 - dimethylaminopropyl) carbodiimide حل هيدروكلوريد الأسهم (EDC) الذائب في DH 2 O مع تركيز 100 ملغ / مل من العينة مدافع ، أو 10 ميكرولتر إلى حل EDC PP لعينة. دوامة العينات لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 16.9 ميكرولتر من حل مع تركيز هائل سعيد أنعم من 118 ملغ / مل لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، بينما تهتز في 300 طلقة / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze للمدافع وعينات PP 3 مرات مقابل 2 ليتر من الفوسفات مخزنة درجة الحموضة (PBS) المالحة 7.4 لعدة ساعات لكل منهما. تنفيذ كافة الخطوات dialyzing في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي للعينة 10 دقائق في 14000 XG وجمع مدافع طاف تحتوي على أو PP مترافق لهائل سعيد أنعم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار طاف للبروتينات عن طريق إجراء SDS - PAGE ، وذلك باستخدام المواد الهلامية 12 ٪. تحميل حوالي 12 ميكروغرام من المتقارن HSA في فتحة هلام واحد. </li></ol> 2. تحديد سعر اقتران تقارن المخدرات (الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل معدل اقتران مدافع وتقارن PP HPSEC بواسطة استخدام الفوسفات الصوديوم 100 ملم تحتوي على 6.5 درجة الحموضة عازلة 150 مم كلوريد الصوديوم و 0.05 ٪ أزيد الصوديوم. استخدام 7.8 X - 300 مم TSK - G2000 جل العمود SWXL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء الكشف عن إشارات باستخدام الإنترنت ، إلى جانب ري والأشعة فوق البنفسجية نظام كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينة HSA قياسية مع تركيز 1 ملغ / مل في DH 2 O. لمعايرة الكاشف بضخ 50 ميكرولتر حل HSA القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ري ري ك المستمر للأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية ك المستمر للكشف. استخدام الصيغ منطقة RI = ك ري * [(DN / DC) HSA * ج (HSA)] ومنطقة الأشعة فوق البنفسجية UV = ك * [(دا / DC) HSA * ج (HSA)] مع (DN / DC) HSA = 0،185 و (دا / DC) HSA = 0.518 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معايير ومدافع عن HPSEC PP المشتقة التي يمكن أن 5 ، 10 ، و 30 لكل من المبالغ nmol معايير حقن بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب متوسط ​​القيم (DN / DC) والمخدرات (دا / DC) المخدرات على حد سواء المعايير. لمدافع ، وهو (DN / DC) من 0.235 ± 0.010 تقرر و(دا / دي سي) من 39.000 ± 0.493. لمؤتمر المندوبين المفوضين ، وهو (DN / DC) من 0.328 ± 0.016 من و(دا / DC) 53.155 ± 2.464 تقرر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقارن حقن المخدرات على HPSEC وتحديد المناطق وRI ذروة فوق البنفسجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيز مدافع ، PP المشتقة ، وHSA من خلال حل معادلات المنطقة two RI RI = ك * [(DN / DC) * ج المخدرات (المخدرات) + (DN / DC) HSA * ج (HSA)] الأشعة فوق البنفسجية والمنطقة = ك للأشعة فوق البنفسجية * [(دا / DC) * ج المخدرات (المخدرات) + (دا / DC) HSA * ج (HSA)] لمجهولين. </li></ol> 3. BAT تقارن به المخدرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد seven قارورة التدفق الخلوي والتسمية لهم اعتمادا على محتواها : سيطرة غير ملوثين ، ومراقبة سلبية ، والتحكم إيجابية ، وتقارن المخدرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 ماصة ميكرولتر من التحفيز العازلة B - CCR - STB (CAST Flow2 ، بولمان مختبرات ، Schönenbuch ، CH) في قارورة محفوظة لمراقبة غير ملوثين والسلبية. كعنصر تحكم إيجابية ، استخدام 50 ميكرولتر من محلول مكافحة FcεRI التي قدمتها مجموعة CAST Flow2. إضافة كميات مناسبة من محلول المتقارن إلى قارورة محفوظة لتقارن المخدرات عن طريق خلق سلسلة من 0.02 التخفيف 1:10 -20 ميكروغرام / مل مدافع المتقارن والبولي بروبيلين المتقارن (تركيزات النهائي في حجم مقايسة من 200 ميكرولتر). يجب إجراء هذه التجارب المعايرة لتحديد تركيز التنشيط قعدة الأمثل لكل عينة مريض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر العازلة التحفيز لكل مريض أنبوب و 50 ميكرولتر من الدم EDTA كله. خلط العينات بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 20 ميكرولتر تلطيخ CAST Flow2 كاشف تحتوي على أجسام مضادة لمكافحة CCR3 المسمى مع فيكوإيريترين (PE) والمضادة للأضداد CD63 المسمى مع ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) لكل أنبوب ومزيج مرة أخرى. لا ماصة كاشف تلطيخ في العينة غير ملوثين! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات لمدة 45 دقيقة في حمام ماء C ° 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف رد الفعل على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز كريات الدم الحمراء عن طريق إضافة 2.0 مل CAST Flow2 كاشف lysing إلى كل قنينة ودوامة بلطف. احتضان العينات في الظلام لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق في 500 XG وطاف صب بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر Flow2 CAST العازلة يغسل وتخزينها على الجليد حتى التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط ق تدفق عداد الكريات والجهدettings لمبعثر إلى الأمام والجانب (FSC ، SSC) ، في حين الحصول على عينة غير ملوثين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتوقع بوابة الخلايا كما الخلايا الليمفاوية من مؤامرة SSC - FSC إلى مؤامرة SSC - PE. يتم تحديدها من قبل الأسسة الأضداد المضادة للCCR3 PE - SSC CCR3 صفت بأنها لو وبوابة مرحبا بهم في مؤامرة FITC - PE. هو المسمى الأضداد المضادة للكشف عن CD63 الأسسة تفعيلها مع FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط قطع إلى الحد الأقصى 2.5 ٪ من قعدات كما CD63 مرحبا في السيطرة السلبية. ويعتبر نموذج إيجابي لتفعيل قعدة إذا&gt; قعدات 5 ٪ هي CD63 مرحبا ومؤشر يعني مضان (MFI) من العينة مقسوما على مؤسسات التمويل الأصغر للسيطرة سلبية يتجاوز 2 (الشكل 3). </li></ol> 4. ممثل النتائج : تقيم هذه التجربة BAT كأداة مفيدة لاكتشاف فرط IgE والتي تعتمد على المخدرات. وتستخدم تقارن بروتين المسكنات لتفعيل الأسسة. بواسطة HPSEC مع RI تجميع الأشعة فوق البنفسجية والدولة الكشف ، ودرجة اقتران ، والعائد الفعلي للتقارن مصممون. كما يظهر الشكل رقم 4 ، ظلت 43.5 ٪ من مدافع موحودي تقارن مع درجة اقتران مدافع 5.0 / هائل سعيد أنعم. لمجاميع تم تحديد درجة اقتران 9.5. وقد أظهرت المتقارن propyphenazone تتألف من مونومرات 68.5 ٪ مع درجة اقتران 21.2. كانت درجة اقتران المجاميع 27.9. في المجموع ، وكانت درجة اقتران العزم من 7.6 تقارن مدافع مدافع وذلك من تقارن PP كان 23.2. BAT تنفيذ تقارن مع الظروف الأمثل (تركيز تقارن ، والوقت التحفيز) سمح التحقيق في IgE والتي تعتمد على ردود الفعل في فرط الحساسية والأدوية المضادة للالتهاب. لم يكن سوى المتقارن PP كما هو مبين في الشكل (5) ، قادرة على تحريك تفعيل قعدة تصور من قبل upregulation في التعبير سطح CD63 : تم تنشيط 20.6 ٪ من قعدات تتميز تحولا في الدخول في كثافة مضان. زادت مؤسسة التمويل الأصغر بمعامل قدره 4.9 من 386 (الرقابة السلبية) لعام 1893. في المقابل ، باستخدام مدافع المتقارن تم تنشيط فقط 3.1 ٪ من قعدات الذي كان أقل من 5 ٪ الانشطارية. كما زادت مؤسسة التمويل الأصغر فقط بعامل 1.1 (حد 2.0) من 197 (الرقابة السلبية) إلى 210. وتعطى صلاحية فحص من قبل (ط) &lt;التنشيط قعدة 5 ٪ في السيطرة السلبية ، (ب) سجل التحول في كثافة مضان بعض الفئات السكانية قعدة ، و (الثالث)&gt; 50 ٪ الأسسة تنشيط (مراقبة إيجابية). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" /> الشكل 1. مشتقة من توصيلات مدافع والبولي بروبيلين لهائل سعيد أنعم. بعد حل تضاف هذه العقاقير ، والمياه ، وزارة التربية والعلم العازلة ، وEDC (اقتران الكاشف). وvortexed العينات لمدة 1 دقيقة قبل pipetted هائل سعيد أنعم للحلول المخدرات. في غضون 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة تهتز المخدرات ربط تساهمي لهائل سعيد أنعم. قد مونومرات فضلا عن المجاميع النتيجة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" /> الشكل 2. حساب درجة اقتران. أولا ، تحدد الثوابت ك ك ري والأشعة فوق البنفسجية. لذلك ، يتم حقن HSA القياسية مع تركيز معروف في النظام HPSEC. (DN / العاصمة) ، وتعطى (دا / دي سي) لهائل سعيد أنعم وقيم 0.185 0.518 على التوالي 5. وتستخدم المناطق الذروة لحساب الثوابت. الثانية ، عن كل دواء يتم حقن ثلاثة معايير لتحديد المخدرات والتركيز RI محددة ومناطق الأشعة فوق البنفسجية. منذ معروفة والثوابت RI ك ك الأشعة فوق البنفسجية من الخطوات المذكورة أعلاه ، يمكن حساب المشتقات المخدرات محددة (DN / DC) و (دا / دي سي). يتم حقن الثالثة ، المخدرات HSA تقارن في HPSEC. وتستخدم المناطق الذروة مما أدى لحساب تركيزات المخدرات وHSA في الذروة من خلال حل المعادلات اثنين مع اثنين من المتغيرات غير معروف. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" /> الشكل 3. قعدة النابضة. وتوقع الخلايا الليمفاوية كما هي بوابات مبعثر الجانب مقابل مبعثر إلى الأمام (SSC - FSC المؤامرة). وحددت محكمة أمن الدولة CCR3 الأسسة كما لو مرحبا من الخلايا الليمفاوية بوابات (SSC - CCR3 مؤامرة - PE). ويتم تحليل قعدات للتنشيط (CD63 مرحبا) في المؤامرة - CD63 - FITC CCR3 - PE. يستخدم عنصر التحكم السلبي لضبط قطع من الحد الأقصى 2.5 ٪ المتبقية الأسسة CD63 مرحبا. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" /> الشكل 4. درجة اقتران تصميما من تقارن المخدرات. RI وإشارات الأشعة فوق البنفسجية تظهر ذروتين تمثل مجاميع (يبلغ حجمه حجم الاحتفاظ في منخفض) ومونومرات (يبلغ حجمه في حجم الاحتفاظ عالية) من المخدرات HSA تقارن. وصفت والنسب المئوية للمونومرات المجاميع (تحديدها من إشارات RI) وشهاداتهم اقتران (ن = 1). <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" /> الشكل 5. قعدة activatiعلى الاختبار. وتظهر نتائج العينات المتقارن تنشيط المخدرات ، وضوابط السلبية ، والضوابط الإيجابية في CD63 - FITC CCR3 - PE - المؤامرات (ن = 1).

<ol>
	<li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone.">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li><li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+questions+in+Allergy:+1--drug+allergy/hypersensitivity.">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li><li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils,+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy.">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li><li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diclofenac+hypersensitivity:+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites.">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li><li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering,+absorbance,+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions.">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li><li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+tests+based+on+human+basophils:+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues.">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li><li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-assisted+allergy+diagnosis:+current+applications+and+future+perspectives.">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li><li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions:+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils.">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory &#38; Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li><li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

BAT هي راسخة وإن لم يكن حتى الآن تستخدم بشكل روتيني طريقة لتشخيص المرض إيج بوساطة حساسية 6،7. فرط الحساسية للدواء ، ولكن ، للخطر انطباقها على المركبات منخفضة الوزن الجزيئي ليست قادرة على مستقبلات IgE وتشعبي ، وهو شرط أساسي لتفعيل قعدة 8. ولذلك ، والمخدرات ، قيد التحقيق ضرورة أن يقترن تساهميا الناقل مناسبة للبروتينات (مثل HSA). الأهم من ذلك ، لدرجة اقتران (أي عدد جزيئات الدواء في البروتين الناقل) يجب أن يكون للرقابة لضمان النشاط المناعي (IgE وأي مستقبلات عبر ربط) من تقارن. نظريا ، ينبغي أن اثنين من haptens في الجزيء الناقل تكون كافية لمستقبلات IgE وعبر ربط وثبت قليلة مثل الجزيئات مدافع خمسة في HSA لتحريك الافراج عن الوسيط في مقايسة الخلية المستندة إلى 4. وقد تم تحديد كلا تقارن ، PP - HSA وDF - HSA ، لعرض على درجة عالية بما فيه الكفاية اقتران (HPSEC) ، وتكون نشطة مناعيا الكواشف جعلها مناسبة للاستخدام في BAT. قد تكون قضية أخرى أن الأيضات المخدرات قد تلعب دورا ، وذلك بدلا من المستقلب المخدرات الأم قد يسبب رد فعل حساسية. في حالة وجود مدافع ، وقد تم تقييم هذا الاحتمال بالتفصيل به سابقا five المرحلة الرئيسية الأيضات أنا واحد مغاير الربط 4. عوامل هامة لاتقان تقنية صفها تشمل جودة عينة من الدم (&lt;12 ساعة منذ جمع الدم ، والكشف عن عدد من قعدات&gt; 500) وتحسين ظروف التحفيز (الوقت والجرعة). بالإضافة إلى ذلك ، ما يسمى غير المستجيبين الذين لا تتفاعل حتى مع السيطرة الايجابية (الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات إيج) يتعين تحديدها. ولذلك ، ومعايير يجب أن تتضمن التحقق من صحة جسم مكافحة FcεRI كما تحكم إيجابية. ميزة هامة من استخدام تقارن المخدرات هو حقيقة أنها غير سامة تظهر على النقيض من العقاقير نقية ، كما هو موضح لDF - HSA المتقارن بواسطة التحفيز بالتعاون مع المضادة للأجسام المضادة في FcεRI BAT 4. مدافع نقية ، في المقابل ، يعرض الآثار السامة للخلايا عند تركيز من 1.25 ملغ / مل يسبب مشاكل مع تفسيرها من BAT 9. عموما ، ينصح بشدة لاختبار السمية المحتملة لكل المتقارن المخدرات المنتجة حديثا. هنا ، لقد أظهرنا إمكانات PP - HSA المتقارن BAT المستخدمة في الكشف عن فريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة فرط الحساسية. في المقابل ، لا يرتبط مع مدافع فرط IgE وأثبت عدم وجود تفعيل قعدة ردا على DF - HSA المتقارن. الأهم من ذلك ، في حالة من عدم اليقين بشأن آلية إيج بوساطة ، تقارن يتعين تقييمها لنشاط المناعية التي كتبها في أنظمة الفحص المختبري خلية القاعدة كما تبين للمدافع 4. باستخدام الإعداد لوصف العقاقير التصريف منخفضة الوزن الجزيئي لتساهميا البروتين الناقل مناسبة جزيئات عددا من تفاعلات فرط الحساسية ضد الأدوية بما فيها المضادات الحيوية ، المسكنات الأخرى ، radiocontrast وسائل الإعلام ، مرخيات العضلات ، والتخدير ، قد يكون التحقيق وما إلى ذلك للحصول على اشتراك لفريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة الآلية. وبالتالي ، قد يكون بمثابة BAT بالإضافة إلى الأساليب الحالية لتشخيص (اختبار الجلد ، واختبار الاستفزاز عن طريق الفم).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف / الجهاز </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> 2 -- (N - Morpholino) ethanesulfonic حمض </td><td> سيغما </td><td> M3671 </td><td> -- </td></tr><tr><td> 7.8 × 300 مم جل TSK - G2000SWXL العمود </td><td> العلوم البيولوجية Tosoh </td><td> 08540 </td><td> -- </td></tr><tr><td> دينار بحريني FACSCanto الثاني </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 338962 </td><td> -- </td></tr><tr><td> الطرد المركزي مقاعد البدلاء الأعلى </td><td> سيغما </td><td> -- </td><td> -- </td></tr><tr><td> ديكلوفيناك الصوديوم الملح </td><td> سيغما </td><td> D6899 </td><td> -- </td></tr><tr><td> EDTA - Vacutainer </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 368589 </td><td> -- </td></tr><tr><td> Flow2 CAST كيت </td><td> بولمان مختبرات </td><td> FK - CCR </td><td> مجموعة فعالة CAST 14 يونيو 2011 Flow2 الآن CAST تدفق </td></tr><tr><td> HP1100 HPLC نظام </td><td> هيوليت باكارد </td><td> -- </td><td> -- </td></tr><tr><td> مصل الزلال البشري </td><td> سيغما </td><td> A9511 </td><td> -- </td></tr><tr><td> مختبر أجهزة الطرد المركزي </td><td> إيبندورف </td><td> -- </td><td> -- </td></tr><tr><td> N - الأثيل - N&#39; - (3 - dimethylaminopropyl) carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) </td><td> سيغما </td><td> E6383 </td><td> -- </td></tr><tr><td> أقراص PBS </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> -- </td></tr><tr><td> Propyphenazone المشتقة </td><td> قسم البيولوجيا الجزيئية ، جامعة سالزبورغ ، النمسا </td><td> -- </td><td> -- </td></tr><tr><td> شاكر </td><td> إيبندورف </td><td> -- </td><td> -- </td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S8032 </td><td> -- </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) </td><td> سيغما </td><td> S1679 </td><td> -- </td></tr><tr><td> كربونات الصوديوم الهيدروجينية </td><td> سيغما </td><td> 90421C </td><td> -- </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S5881 </td><td> -- </td></tr><tr><td> فوسفات الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> 342483 </td><td> -- </td></tr><tr><td> الثلاثي مجموعة كاشف </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> -- </td></tr><tr><td> الشخصية BioVortex V - 1 زائد </td><td> Peqlab </td><td> 90 - V - 1 </td><td> -- </td></tr><tr><td> حمام ماء 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> -- </td></tr></tbody></table>

basophil activation test for investigation of ige-mediated mechanisms in drug hypersensitivity

يمكن تفاعلات فرط الحساسية ضد الأدوية المضادة للالتهاب غير الستيرويدية (المسكنات) مثل propyphenazone (PP) وديكلوفيناك (مدافع) واضح ونوع I - 1 مثل الحساسية. في الممارسة السريرية ، يتم تنفيذ أساسا تشخيص فرط المخدرات عن طريق تاريخ المريض ، واختبار الجلد هو غير موثوق بها الاختبار الشفوي واستفزاز تتحمل المخاطر التي تهدد الحياة للمريض 2. وبالتالي ، فإن الأدلة لpathomechanism إيج بوساطة الكامنة من الصعب الحصول عليها. هنا ، ونحن في أسلوب تقديم المختبر على أساس استخدام الأسسة حقوق الإنسان مستمد من مرضى الحساسية للأدوية الذي يحاكي المستجيب الحساسية في الجسم الحي. وقعدات للأدوية المرضى بالحساسية تحمل جزيئات محددة لإيج المخدرات المذنب ، أصبح عليهم تنشيط مستقبلات IgE ويشابك وإطلاق الجزيئات المستجيب للحساسية. يمكن رصد تفعيل الأسسة من عزم upregulation من سطح CD63 التعبير باستخدام التدفق الخلوي 3. في حالة انخفاض الوزن الجزيئي المخدرات ، مصممة لتمكين تقارن إيج يشابك على مستقبلات الأسسة. كما هو مبين في الشكل (1) ، وممثلين اثنين من المسكنات وبولي بروبلين ومدافع ، لا بد أن تساهمي ألبومين المصل البشري (HSA) عن طريق مجموعة الكربوكسيل التفاعل مع المجموعة الأمينية الأساسية من بقايا يسين. مدافع يحمل مجموعة الكربوكسيل الجوهرية ، وبالتالي يمكن استخدامها مباشرة 4 ، في حين أن المجموعة التي تحتوي على مشتقات من الكربوكسيل PP كان لا بد من تجميع organochemically قبل الدراسة 1. درجة اقتران من المركبات ذات الوزن الجزيئي المنخفض على جزيء البروتين الناقل وتوزيعها المكاني مهم لضمان يشابك اثنين من جزيئات مستقبلات IgE و. بروتوكول الموصوفة هنا ينطبق عالية الأداء اللوني الاستبعاد الحجم (HPSEC) مجهزة الإنكسار المتسلسل (RI) وفوق البنفسجي (UV) نظام الكشف عن تحديد درجة اقتران. كما يمكن تطبيق هذه المنهجية لوصف عقاقير أخرى ، واختبار التنشيط قعدة (BAT) يحمل إمكانات ليتم استخدامها لتحديد IgE وبوساطة آليات فرط في المخدرات. هنا ، علينا أن نحدد PP فرط الحساسية وإيج بوساطة فرط الحساسية ، ومدافع عن عدم إيج بوساطة BAT.

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity at JoVE.com

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

قعدة اختبار التنشيط هو أداة فعالة للكشف عن الحساسية التي تعتمد على إيج<em&gt; في المختبر</em&gt;. هنا ، يتم استخدام بروتوكول الأمثل لاختبار التنشيط قعدة فرط الحساسية للتحقيق في المخدرات. تم وصف طريقة لإنتاج المخدرات تقارن كفاءة البروتين التساهمية وتكييفها الفيزيائية.

قعدة اختبار لتنشيط التحقيق في إيج بوساطة آليات في فرط الحساسية للمخدرات

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

basophil-activation-test-for-investigation-ige-mediated-mechanisms

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

Adverse Drug Effects and Chemical Toxicity

SCIENTISTS IN ACTION

33.3K Views.  University of Salzburg. قعدة اختبار التنشيط هو أداة فعالة للكشف عن الحساسية التي تعتمد على إيج في المختبر. هنا ، يتم استخدام بروتوكول الأمثل لاختبار التنشيط قعدة فرط الحساسية للتحقيق في المخدرات. تم وصف طريقة لإنتاج المخدرات تقارن كفاءة البروتين التساهمية وتكييفها الفيزيائية...

Video: Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

تسهيل اكتشاف المخدرات: مؤتمتة فحص التهاب عالية المحتوى في الزرد

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

عبر الجسم الحي فرط الحساسية النوع المتأخر الفحص ل Antigen تنظيم محدد

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

في فيفو التحقيق من مضادات الميكروبات العلاج الضوء الأزرق للمقاومة للأدوية المتعددة baumannii الراكدة حرق العدوى عن طريق تلألؤ بيولوجي التصوير

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

تحريض التهاب الكبد المناعي الذاتي الناجم عن الأدوية في الفئران BALB / c لدراسة آلياته المسببة للأمراض

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.