עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF) מענק P18820-B13. אתיקה הצהרה: המחקר אושר (PLUS_Ethik_090514) על ידי ועדת האתיקה לניסויים עירוב בני אדם ו / או בעלי חיים באוניברסיטת זלצבורג ציות Declaraction הלסינקי כמו מתוקנת בשנת 1983, כל החולים שהשתתפו נתן הסכמה מדעת בכתב שלהם.

1. הכנת conjugates סמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס 10 מ&quot;ג DF ב 1 מ&quot;ל DH 2 O ב צינור 1.5 תגובה מ&quot;ל. בהליך נוסף להשתמש 95 μl של פתרון זה DF. כדי המצומד PP כדי לפזר HSA 30.4 מ&quot;ג נגזרות PP (304 g / mol) ב 500 μl הידרוקסיד M 0.3 נתרן (NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 430.6 DH 2 O ו - 100 μl 0.5 מ &#39;2 - (N-morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES) pH חיץ 6.5-95 μl של DF מומס. הוסף μl 33.1 DH 2 O ו - 140 μl של 2 M MES חיץ pH 2.9 המדגם PP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl של 57.5 שהוכן זה עתה N-ethyl-N &quot;- (3-dimethylaminopropyl) hydrochloride carbodiimide (EDC) מניות פתרון מומס DH 2 O עם ריכוז של 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל מדגם DF, או 10 μl פתרון EDC אל המדגם PP. וורטקס דגימות דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 16.9 μl של פתרון HSA עם ריכוז של 118 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ל מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הדגימות למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר תוך רועד ב 300 סיבובים / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze DF דגימות PP 3 פעמים נגד 2 ליטרים של בופר פוספט pH (PBS) מלוחים 7.4 במשך כמה שעות כל אחד. ביצוע כל הצעדים dialyzing ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם 10 דקות XG 14,000 לאסוף את DF המכיל supernatant או PP מצומדות כדי HSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק supernatant עבור חלבונים ידי ביצוע SDS-PAGE, באמצעות ג&#39;לים 12%. עומס על 12 מיקרוגרם של HSA המצומד לתוך משבצת ריקה באחת ג&#39;ל. </li></ol> 2. קביעת שיעור צימוד של conjugates התרופה (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של שיעור צימוד של DF ו PP conjugates ידי HPSEC להשתמש נתרן 100 mM פוספט pH 6.5 חיץ המכיל 150 mM NaCl ו אזיד הנתרן 0.05%. השתמש 7.8 x 300 מ&quot;מ טפו-Gel-G2000 טור SWXL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זיהוי של אותות באמצעות RI באינטרנט מצמידים ו גלאי מערכת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם HSA סטנדרטי עם ריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב DH 2 O. עבור כיול גלאי להזריק 50 μl פתרון HSA סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את k קבוע RI RI ואת UV UV k קבוע הגלאי. השתמש בנוסחאות שטח = RI RI k * [(dn / DC) HSA * ג (HSA)] אזור UV UV = k * [(DA / DC) HSA * ג (HSA)] עם (dn / DC) = HSA 0.185 ו (DA / DC) HSA = 0.518 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DF סטנדרטים PP נגזרת עבור HPSEC כי 5, 10 ו 30 nmol כמויות של סטנדרטים שניהם ניתן להזריק בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ממוצע ערכי (dn / DC) סמים (DA / DC) תרופה סטנדרטים שניהם. עבור DF, (dn / DC) של 0.235 ± 0.010 ו (DA / DC) של 39.000 ± 0.493 נקבע. עבור PP, (dn / DC) של 0.328 ± 0.016 ו (DA / DC) של 53.155 ± 2.464 נקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Conjugates להזריק סמים על HPSEC ולקבוע RI שלהם באזורים שיא UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הריכוז של DF, נגזרת PP, ו HSA על ידי פתרון שתי המשוואות RI RI = שטח k * [(dn / DC) סמים * ג (תרופה) + (dn / DC) HSA * ג (HSA)] ו-UV שטח UV = k * [(DA / DC) סמים * ג (תרופה) + (DA / DC) HSA * ג (HSA)] עבור נעלמים. </li></ol> 3. BAT conjugates שימוש בסמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן seven cytometry צלוחיות זרימה תווית אותם, בהתאם לתוכן שלהם: שליטה בלא כתם, שליטה שלילית, שליטה חיובית, conjugates סמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של חיץ B-CCR-STB גירוי (Flow2 יצוק, Bühlmann מעבדות, Schönenbuch, CH) לתוך צלוחיות שמורות לשלוט בלא כתם ושליליים. כביקורת חיובית, להשתמש 50 μl של פתרון אנטי FcεRI המסופקים על ידי ערכת Flow2 יצוק. הוסף את הסכומים המתאימים לפתרון המצומד של צלוחיות שמורה conjugates התרופה על ידי יצירת סדרה דילול 1:10 מ -20 מיקרוגרם 0.02 / ml DF המצומד ו PP המצומד (ריכוז סופי בנפח assay של μl 200). ניסויים אלה טיטרציה יש לבצע כדי לקבוע את הריכוז של הפעלת basophil אופטימלית למדגם לכל מטופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl חיץ גירוי אל צינור כל EDTA 50 החולה μl הדם כולו. מערבבים את דגימות בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 מכתים μl Flow2 שחקנים מגיב המכיל נוגדנים נגד CCR3 שכותרתו עם phycoerythrin (PE) ואנטי CD63 נוגדנים שכותרתו עם isothiocyanate והעמסת (FITC) על צינור אחד ומערבבים שוב. אל פיפטה מגיב מכתים לתוך המדגם בלא כתם! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות במשך 45 דקות בתוך אמבטיה במים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור תגובה על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse אריתרוציטים ידי הוספת 2.0 מ&quot;ל ריאגנט Flow2 שחקנים lysing אל הבקבוקון כל מערבולת בעדינות. דגירה דגימות בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות על XG 500 ו supernatant למזוג בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים 500 μl חיץ Flow2 שחקנים לשטוף ולאחסן על הקרח עד cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם של מתח cytometer של זרימהettings עבור פיזור קדימה לוואי (FSC, SSC) בזמן רכישת מדגם בלא כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער התאים כצפוי לימפוציטים מתוך העלילה SSC-FSC אל חלקת SSC-PE. בזופילים מזוהים על ידי נוגדן אנטי CCR3 PE-שכותרתו CCR3 היי SSC והפלא השער אותם לתוך עלילה FITC-PE. נוגדן נגד CD63 גילוי בזופילים מופעל התווית FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את חתוכים למקסימום 2.5% בזופילים כמו CD63 היי בבקרה שלילית. מדגם נחשבת חיובית עבור הפעלת basophil אם&gt; בזופילים 5% הם CD63 היי ומדד הקרינה אומר (MFI) של המדגם מחולק MFI שליטה השלילית עולה על 2 (איור 3). </li></ol> 4. נציג תוצאות: ניסוי זה מעריכה BAT ככלי מועיל לזהות IgE תלויי רגישות יתר בסמים. Conjugates חלבון של NSAIDs משמשים ההפעלה של בזופילים. עד HPSEC עם RI וזיהוי UV צבירה המדינה, תואר צימוד, ואת התשואה האפקטיבית של conjugates נקבעים. כמו איור 4 מראה, 43.5% מכלל conjugates DF נשאר monomeric עם תואר צימוד של 5.0 DF / HSA. עבור אגרגטים מידת צימוד של 9.5 נקבע. המצומד propyphenazone הוצגה מורכב מונומרים 68.5% עם תואר צימוד של 21.2. מידת הצימוד של אגרגטים היה 27.9. בסך הכל, מידת צימוד נחוש של conjugates DF היה 7.6 DF ושל conjugates PP היה 23.2. BAT הופיע עם conjugates בתנאים אופטימיזציה (הריכוז של conjugates, זמן גירוי) אפשרה חקירה של IgE תלויי ותגובות רגישות יתר NSAID. כפי שניתן לראות בתרשים 5, רק המצומד PP מסוגל להפעיל הפעלה basophil דמיינו ידי upregulation בביטוי CD63 פני השטח: 20.6% של בזופילים הופעלו מאופיין Shift-יומן בעוצמת הקרינה. MFI גדל בפקטור של 4.9 מתוך 386 (בקרה שלילית) ל 1893. לעומת זאת, באמצעות המצומד DF רק 3.1% מכלל בזופילים הופעלו שהיה מתחת 5% חתוכים. גם MFI גדל רק פי 1.1 (גבול 2.0) מתוך 197 (בקרה שלילית) עד 210. תוקף Assay ניתנת על ידי (i) &lt;הפעלה basophil 5% שליטה שלילי, (ii) log-שינוי עוצמת הקרינה של subpopulation basophil, וכן (iii)&gt; בזופילים מופעל 50% (בקרה חיובית). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" /> באיור 1. צימוד של נגזרות DF ו PP כדי HSA. לאחר המסת התרופות, המים, MES חיץ, ו EDC (מגיב צימוד) מתווספים. דגימות הן vortexed לרגע לפני 1 HSA הוא pipetted לפתרונות סמים. תוך 2 שעות בטמפרטורת החדר רעד התרופות להיקשר קוולנטית HSA. מונומרים כמו גם אגרגטים עלול לגרום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" /> איור 2. חישוב מעלות צימוד. ראשית, קבועים k RI ו UV k נחושים. לכן, HSA רגיל עם ריכוז ידוע מוזרק לתוך מערכת HPSEC. (Dn / DC) ו (DA / DC) של HSA מקבלים ערכים של 0.185 ו - 0.518, בהתאמה 5. אזורים השיא משמשים לחישוב קבועים. שנית, לכל תרופה שלושה תקנים מוזרקים לקבוע סמים וריכוז ספציפי RI ושטחים UV. מאז RI k ו-UV קבועים k ידועים מן השלבים שלעיל, נגזרים התרופה הספציפית (dn / DC) ו (DA / DC) ניתן לחשב. שלישית, סמים HSA conjugates מוזרקים HPSEC. אזורי שיא וכתוצאה מכך משמשים כדי לחשב את ריכוזי התרופה HSA לכל שיא על ידי פתרון שתי משוואות עם שני משתנים בלתי ידועים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" /> איור 3. Gating Basophil. תאים כצפוי לימפוציטים הם מתפזרים בצד מגודרת לעומת פיזור קדימה (SSC-FSC העלילה). בזופילים מזוהים CCR3 היי SSC והנה מן לימפוציטים מגודרת (SSC-CCR3-PE העלילה). בזופילים הם ניתחו עבור הפעלה (CD63 היי) בעלילה CD63-FITC-CCR3-PE. בקרה שלילית משמש כדי להגדיר את חתך של בזופילים 2.5% לכל היותר שנותרו CD63 היי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" /> איור 4. מעלות צימוד נחושה של conjugates סמים. RI אותות UV להראות שתי פסגות המייצג אגרגטים (משחררי בווליום נמוך השמירה) ו מונומרים (משחררי בהיקף שימור גבוהה) של סמים HSA conjugates. אחוזי מונומרים אגרגטים (נקבע אותות RI) ותואר צימוד שלהם מתוארים (n = 1). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" /> איור 5. Basophil activatiעל הבדיקה. תוצאות המצומד המופעל דגימות סמים, שולטת שלילי, חיובי שולטת מוצגים CD63-FITC-CCR3-PE חלקות (n = 1).

<ol>
	<li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone.">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li><li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Important+questions+in+Allergy:+1--drug+allergy/hypersensitivity.">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li><li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils,+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy.">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li><li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diclofenac+hypersensitivity:+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites.">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li><li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering,+absorbance,+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions.">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li><li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+tests+based+on+human+basophils:+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues.">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li><li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-assisted+allergy+diagnosis:+current+applications+and+future+perspectives.">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li><li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions:+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils.">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory &#38; Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li><li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

BAT היא מבוססת היטב אף שעדיין לא בשימוש שגרתי שיטה לאבחון של מחלות אלרגיות בתיווך IgE 6,7. עבור רגישות יתר בסמים, עם זאת, ישימותה נפגעת כמו תרכובות משקל מולקולרי נמוך אינם מסוגלים קולטנים crosslink IgE, תנאי מוקדם להפעלת basophil 8. לכן, תרופות תחת חקירה צריך להיות יחד קוולנטית לחלבונים מנשא מתאים (למשל HSA). חשוב לציין, מידת צימוד (כלומר מספר של מולקולות התרופה לכל חלבון המוביל) צריך להיות בשליטה כדי להבטיח את פעילות מערכת החיסון (כלומר, הקולטן IgE cross-linking) של conjugates. באופן תיאורטי, שני haptens לכל מולקולה הספק צריך להיות מספיק עבור קולטן IgE cross-linking ומעטים כמו חמש מולקולות DF לכל HSA הוכחו ההדק לשחרר המתווך assay מבוססי תאים 4. Conjugates שני, PP-HSA ו DF-HSA, נקבעו כדי להציג תואר צימוד גבוה מספיק (HPSEC) ולהיות פעיל immunologically שהופך אותם ריאגנטים מתאים לשימוש BAT. בעיה נוספת עשויה להיות כי מטבוליטים התרופה עשויה לשחק תפקיד, כמו המטבוליט במקום סמים ההורה עלול לגרום תגובת רגישות יתר. במקרה של DF, אפשרות זו נבדקה בהרחבה בעבר באמצעות five שלב חשוב אני מטבוליטים ואחד גרסה הצמדה 4. גורמים חשובים עבור Mastering את הטכניקה המתוארת כוללים איכות דגימת דם (&lt;12 שעות מאז איסוף דם, מספר בזופילים זוהה&gt; 500) ואופטימיזציה של תנאים גירוי (מנה זמן). בנוסף, מה שנקרא לא מגיבים שאפילו לא מגיבים עם שליטה חיובית (נוגדנים כנגד הקולטן IgE) צריך להיות מזוהה. לכן, קריטריון האימות חייב לכלול נוגדן אנטי FcεRI כביקורת חיובית. יתרון חשוב של השימוש בסמים conjugates היא העובדה שהן מופיעות רעיל בניגוד סמים טהור, כפי שמוצג על ידי גירוי בשיתוף עם נוגדן אנטי FcεRI בבת 4 עבור DF-HSA המצומד. Pure DF, לעומת זאת, מציגה השפעות ציטוטוקסיות בריכוז של 1.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל גורם לבעיות עם interpretability של בת 9. בדרך כלל, בדיקות רעילות פוטנציאלית מומלץ מאוד עבור המצומד כל סם הפיק החדש. הנה, הראינו את הפוטנציאל של PP-HSA המצומד בשימוש BAT לחשוף IgE בתיווך רגישות יתר. לעומת זאת, DF רגישות יתר אינה קשורה IgE שמפגינים חוסר הפעלת basophil בתגובה DF-HSA המצומד. חשוב לציין, במקרה של חוסר ודאות לגבי מנגנון IgE בתיווך, conjugates צריך להיות מוערך על פעילות מערכת החיסון על ידי במערכות assay במבחנה מבוססי תאים כפי שהוכח על DF 4. באמצעות התקנה של תיאר conjugating תרופות משקל מולקולרי נמוך קוולנטית למוביל מולקולות חלבון מתאים מספר של תגובות רגישות יתר כנגד תרופות כולל אנטיביוטיקה, NSAIDs אחרים, radiocontrast התקשורת, מרפי שרירים, הרדמה וכו &#39;עלול להיחקר על מעורבותם של IgE בתיווך מנגנון. לפיכך, BAT עשוי לשמש בנוסף את השיטות הקיימות לאבחון (מבחן עור, פרובוקציה אוראלי בדיקות).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / מכשיר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 2 - (N-Morpholino) ethanesulfonic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7.8 x 300 מ&quot;מ טפו ג&#39;ל -G2000SWXL עמודה </td><td> Bioscience Tosoh </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> ספסל העליון צנטריפוגות </td><td> סיגמא </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> דיקלופנק מלח נתרן </td><td> סיגמא </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA-Vacutainer </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 שחקנים Kit </td><td> Bühlmann מעבדות </td><td> FK-CCR </td><td> הערכה אפקטיבית 14 יוני 2011 Flow2 שחקנים עכשיו שחקנים Flow </td></tr><tr><td> מערכת HPLC HP1100 </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> האדם סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> מעבדה צנטריפוגות </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-אתיל-N&#39;-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) </td><td> סיגמא </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBS טבליות </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propyphenazone נגזרת </td><td> המחלקה לביולוגיה מולקולרית, אוניברסיטת זלצבורג, אוסטריה </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> מטרף </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> סיגמא </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> נתרן כלורי (NaCl) </td><td> סיגמא </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> מימן סודיום קרבונט </td><td> סיגמא </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> נתרן hydroxid </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> סודיום פוספט </td><td> סיגמא </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> גלאי טריפל מערך </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> BioVortex אישי V-1 פלוס </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> המים באמבט 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basophil activation test for investigation of ige-mediated mechanisms in drug hypersensitivity

תגובות רגישות יתר כנגד סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) כמו propyphenazone (PP) ו - diclofenac (DF) יכול להתבטא סוג אני כמו תגובות אלרגיות 1. בפועל קליני, אבחון של רגישות יתר בסמים מתבצע בעיקר על ידי ההיסטוריה המטופל, כמו בדיקות העור אינו אמין בדיקות פרובוקציה אוראלי דובים מסכני חיים סיכונים עבור 2 המטופל. לפיכך, עדות pathomechanism IgE בתיווך הבסיסית קשה להשיג. כאן, אנו מציגים שיטה חוץ גופית מבוסס על שימוש של בזופילים האדם הנגזרות סמים רגישות יתר המטופלים המחקה את התגובה האלרגית מפעיל in vivo. כפי בזופילים של סמים אלרגית חולים לשאת מולקולות IgE ספציפי לתרופה האשם, הם הופכים להיות מופעל על crosslinking קולטן IgE ולשחרר מולקולות מפעיל אלרגית. הפעלה של בזופילים יכול להיות פיקוח על ידי קביעת upregulation הביטוי CD63 פני השטח באמצעות זרימת cytometry 3. במקרה של תרופות נמוך משקל מולקולרי, conjugates נועדו לאפשר crosslinking IgE קולטן על בזופילים. כמתואר באיור 1, שני נציגים של NSAIDs, PP ו DF, מחויבים קוולנטית אל אלבומין בסרום אדם (HSA) באמצעות קבוצת carboxyl מגיבים עם קבוצת אמינו ראשונית של שאריות ליזין. DF נושאת קבוצה carboxyl מהותי, ולכן ניתן להשתמש ישירות 4, בעוד קבוצה המכילים carboxyl נגזרת של PP חייב להיות מסונתז organochemically לפני המחקר 1. מידת הצימוד של תרכובות נמוך משקל מולקולרי על מולקולת חלבון המוביל הפריסה המרחבית שלהם חשוב להבטיח crosslinking של שתי מולקולות IgE הקולטן. פרוטוקול המתואר כאן חל כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים בגודל הרחקה (HPSEC) מצויד עם מקדם שבירה רציפים (RI) אולטרה סגול (UV) מערכת זיהוי לקביעת מידת צימוד. כפי המתודולוגיה המתוארת ניתן להחיל על תרופות אחרות, המבחן ההפעלה basophil (BAT) נושא את פוטנציאל לשמש לקביעת IgE בתיווך מנגנונים רגישות יתר בסמים. כאן, אנו קובעים PP רגישות כמו בתיווך IgE ו רגישות יתר DF כלא IgE מתווכת על ידי BAT.

Watch this Scientific Journal Video about Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity at JoVE.com

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

מבחן Basophil ההפעלה הוא כלי רב עוצמה לצורך זיהוי של IgE תלויי אלרגיות<em&gt; במבחנה</em&gt;. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה עבור מבחן ההפעלה basophil משמש לחקור רגישות יתר בסמים. שיטה לייצור יעיל של סמים חלבון conjugates קוולנטיים ואפיון physicochemical שלהם מתואר.

Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

basophil-activation-test-for-investigation-ige-mediated-mechanisms

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

Adverse Drug Effects and Chemical Toxicity

SCIENTISTS IN ACTION

33.3K Views.  University of Salzburg. מבחן Basophil ההפעלה הוא כלי רב עוצמה לצורך זיהוי של IgE תלויי אלרגיות במבחנה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה עבור מבחן ההפעלה basophil משמש לחקור רגישות יתר בסמים. שיטה לייצור יעיל של סמים חלבון conjugates קוולנטיים ואפיון physicochemical שלהם מתואר.

Video: Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In vivo חקירת טיפול באור כחול אנטימיקרוביים multidrug עמידים baumannii Acinetobacter צרוב דלקות באמצעות הדמיה פליטת אור

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.