Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (subvención 08UDE017788-05). EBP también reconoce el apoyo de la Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT). Los autores agradecen a Shonda T. Gaylord y Pratyusha Mogalisetti para la lectura crítica del manuscrito.

<img alt="Figura 1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> Figura 1. . Flujo de trabajo para la aplicación de matriz de anticuerpos de microesferas de fibra óptica a la saliva de perfiles (1) Las microesferas se codifican internamente con dos colorantes fluorescentes; (2) las microesferas codificadas son modificados externamente con anticuerpos monoclonales específicos de proteínas; (3) las microesferas multiplexadas se mezclan, y (4) depositadas al azar en micropocillos grabadas en el extremo proximal de un haz de fibra óptica; (5) proteínas salivales son capturados por las microesferas a través de inmunoensayo de tipo sándwich, y (6) cuantificaron utilizando microscopía de fluorescencia. 1. Las microesferas de codificación <ol><li> Pesar europio sodio (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) en un vial de vidrio ámbar y preparar una solución de 200 mM en tetrahidrofurano (THF). Mezclar suavemente con la pipeta; verificar visualmenteel colorante se disuelve completamente. </li><li> Pesar cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) en un vial de vidrio ámbar y preparar una solución madre 12 mM en THF. Mezclar suavemente con la pipeta, verifique visualmente que el colorante se haya disuelto completamente. </li><li> Preparar 700 l de solución de trabajo para cada tipo de microesfera usando las soluciones madre y THF para alcanzar la concentración final de la lista en la Tabla 1. </li><li> Asegúrese de microesferas (10% w / v) son bien suspendidas mediante agitación con vórtex, y luego transferir 60 l de suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 600 l de PBS a la suspensión de microesferas y mezclar pipeteando 20x. Centrifugar el tubo a 10.000 rpm durante 3 min y retirar con cuidado el sobrenadante. Repita este proceso otra 2x para lavar las microesferas. </li><li> Lavar el sedimento de microesferas 3x con THF usando un procedimiento similar que en el paso 1.5. </li><li> Se centrifuga la suspensión de microesferas / THF a 10.000 rpm durante 3 min, separar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 600 lSolución de trabajo de la lista en la Tabla 1. Transferir la mezcla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Selle el tubo de microcentrífuga con Parafilm y colocarlo en un agitador. Agitar a 3.000 rpm y se incuba durante 24 horas, protegerlo de la luz cubriendo la configuración mediante el uso de una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Centrifugar la suspensión de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar un pellet. </li><li> Retire la solución de colorante líquido sobrenadante, lavar las microesferas 6X con 600 l de metanol y luego con 600 l de PBS que contenía 0,01% de Tween-20 6x otra, tal como se describe en el paso 1.5. </li><li> Guarde las microesferas codificadas en 600 l de PBS que contenía 0,01% de Tween-20 a 4 ° C hasta su uso, proteger de la luz. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del tipo de microesferas: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </strong&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Eu-TTA (mM) </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30 (mM) </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Las concentraciones de Eu-TTA y C30 soluciones de trabajo. 2. Preparación de Microesferas de Proteína de captura <ol><li> Preparar tampón MES [2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, SDS al 0,01%, pH 5,7] y tampón PBS / SDS (fosfato de sodio 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS al 0,01%, pH 7.4) con antelación a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 200 l codificado suspensión de microesferas (que contiene ~ 2 mg de microesferas) en un 1,5 ml tubo de microcentrífuga Safe-Lock. Es importante la utilización de este tipo de tubo de microcentrífuga para evitar derrames durante la incubación en el paso 2.6. </li> &lt;li&gt; Lavarse las microesferas con 600 mu l tampón MES 3x como se describe en el paso 1.5. Añadir 700 mu l MES al sedimento de microesferas y se mezcla bien con la pipeta. </li><li> Preparar 0.105 g / ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, PM = 191,7 g / mol) y 0,163 g / ml de sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluciones en tampón MES en tubos separados. </li><li> Añadir 150 l recién preparada EDC solución gota a gota a la suspensión de microesferas. La EDC hidroliza muy rápidamente, por lo que es imprescindible el uso de una solución recién hecha para asegurar la eficacia de la inmovilización. Inmediatamente después de la adición del EDC, añadir 150 l solución de sulfo-NHS para las microesferas, mezclar bien pipeteando y verifique la suspensión es homogénea. </li><li> Tapar el tubo, sellarlo con Parafilm, y colocarlo en un agitador. Agitar a 1.500 rpm durante 4 horas, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Centrifugar las suspens microesferasde iones a 10.000 rpm durante 3 min para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar las microesferas con 500 l de PBS / SDS 3x tampón como se ha descrito en el paso 1.5. </li><li> Añadir 200 l de tampón PBS / SDS al sedimento, mezclar bien las microesferas y pasar la solución a 300 l de tampón PBS / SDS que contiene 60 microgramos anticuerpos de captura. Es importante a suspender el sedimento de microesferas primero y luego añadir la suspensión de microesferas en la solución de anticuerpo. </li><li> Incubar la mezcla de anticuerpos-microesferas por agitación a 1500 rpm durante 4 horas en un agitador, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Centrifugar la suspensión de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar las microesferas con 500 l StartingBlock (TBS) el bloqueo de 3x tampón, como se describe en el paso 1.5. </li><li> Mezclar microesferas con 1 ml de TBS de tampón de bloqueo y se incuba microesferas a 1.500 rpm durante 1 hora en un agitador, protegerlo de la luz utilizando una cala cuadrorojo con papel de aluminio. </li><li> Centrifugar la suspensión de microesferas a 7.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar el pellet 3x con 500 l de TBS tampón de bloqueo, como se describe en el paso 1.5. </li><li> Centrifugar la solución de microesferas a 7.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Añadir 500 l tampón de bloqueo TBS y mezclar con la pipeta. </li><li> Guarde la suspensión de microesferas modificado a 4 ° C hasta su uso, proteger de la luz. </li><li> Repita este procedimiento para hacer otros tipos de microesferas utilizando anticuerpos correspondientes. </li></ol> 3. Asamblea de fibra óptica Microarray <ol><li> Mezclar 50 l de cada tipo de microesferas de proteína de captura en un nuevo tubo de microcentrífuga esterilizado en autoclave. Centrifugar las microesferas de valores en común a 7.000 rpm durante 3 min, y eliminar el sobrenadante de forma que el volumen restante es de aproximadamente 100 l. </li><li> Cortadas a mano manojos de fibra óptica a aproximadamente 5 cm de longitud ysecuencialmente pulir ambos extremos en una máquina de pulido utilizando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, y 0,05 m de diamante de tamaño lapeado películas. Sonicar el haz de pulido en agua desionizada durante 2 minutos para eliminar cualquier partícula. </li><li> Ponga una pequeña barra de agitación magnética en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, añadir 400 l de PBS libre de proteínas de amortiguación y revolver en una placa de agitación magnética durante 30 minutos para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Etch un extremo del haz de fibras pulido en una solución de HCl 0,025 N para 150 seg 10,16. Inmediatamente sumergirse y someter a ultrasonidos el final grabado al agua fuerte en agua desionizada durante 1 min. Secar los haces de fibras con aire comprimido. </li><li> Monte el haz de fibras en un soporte de fibra y el bloque final grabado en el tampón PBS libre de proteínas libre de burbujas durante 1 hora. </li><li> Depósito 1 l alícuota de la suspensión de microesferas almacenada en el extremo grabado al agua fuerte del haz de fibra óptica. Proteger la configuración de la luz con una caja con papel de aluminio, y esperar 15 min. El volumen de la suspensión sedisminuir por evaporación y obligar a las microesferas en los pocillos grabados. Repita este paso de carga una vez más. </li><li> Use un hisopo saturado con solución de muestra para eliminar las microesferas que no están atrapadas en los micropocillos. El microarray de proteínas ya está listo para usar. Vaya inmediatamente al paso 4.1 para el análisis de la saliva. </li></ol> 4. Análisis de la muestra de saliva, con microesferas de Microarray <ol><li> Añadir 200 l de solución de muestra (100 sobrenadante de saliva l diluyó con igual volumen de StartingBlock T20 (PBS) tampón de bloqueo. El protocolo de recogida de sobrenadante de la saliva ha sido publicado previamente 10). en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en autoclave. Sumerja el microarray proteína cargada en la fibra en la solución y se incuba en un agitador a 600 rpm durante 2 horas, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Preparar 20 ml de tampón de lavado mediante la adición de 200 l solución de BSA al 10% y 200 l 10% de Tween-20 en 19,6 ml de PBS, MIx bien agitando suavemente. </li><li> Sumerja los microarrays de proteínas en un nuevo tubo de microcentrífuga de autoclave que contiene 200 l de tampón de lavado y se agita a 600 rpm durante 2 min. Repita este 3x lavado. </li><li> Incubar la micromatriz en una solución de 100 l de un cóctel de anticuerpo de detección que contiene 5 g / ml de anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, anticuerpos de detección biotinilados de IL-1β en StartingBlock T20 (PBS) tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador a 600 rpm, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Lave el microarray 3x con tampón de lavado como se describe en el paso 4.3. </li><li> Incubar los microarrays en 200 l de 20 mg / ml de estreptavidina conjugada R-ficoeritrina (SAPE) solución en PBS a 600 rpm en el agitador durante 10 min, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Lave el microarray 5x con tampón de lavado como se describe en el paso 4.3. </li><li> Limpiar el extremo distal de la fibra (es decir, el extremo alejadoa partir de las microesferas) paquete con un hisopo saturado con etanol absoluto. </li><li> Secar ambos extremos de la fibra con aire comprimido. Montar la fibra en un microscopio de epifluorescencia y la imagen a través del extremo distal de la fibra. </li><li> Adquirir imágenes de microesferas que corresponden a Eu-TTA, C30 y SAPE intensidades de emisión de fluorescencia. Filtros ópticos configuración y los tiempos de exposición de imágenes de fluorescencia de Eu-TTA, C30 y SAPE se muestran en la Tabla 2. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Canal </td><td> Eu-TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td> Exciter </td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td> Beamsplitter </td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td> Emisor </td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td> Tiempo de exposición </td><td> 1 seg</td><td> 0.3 seg </td><td> 1 seg </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Parámetros para las tres imágenes fluorescentes de la micromatriz.

<ol>
	<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray.">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li><li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Microarray. , (2004).</li><li>Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+eight+human+Th1/Th2+cytokines+using+microarrays.">Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays.</a> J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).</li><li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines.">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li><li>de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li><li>Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+imaging+measurements+of+antibody+arrays+for+the+multiplexed+detection+of+low+molecular+weight+protein+biomarkers.">Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers.</a> Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).</li><li>Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+particle-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed particle-based flow cytometric assays.</a> J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).</li><li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations.">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li><li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis.">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li><li>Blicharz, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-Optic+Microsphere-Based+Antibody+Array+for+the+Analysis+of+Inflammatory+Cytokines+in+Saliva.">Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva.</a> Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).</li><li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+to+drool+for.">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li><li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies,+proteomics+and+genomics.">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li><li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+diagnostics:+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better.">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li><li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li><li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics.">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li><li>Pantano, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+nanowell+arrays.">Ordered nanowell arrays.</a> Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).</li><li>Schena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Microarrays. , (2005).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los investigadores deben prestar especial atención a los siguientes pasos: para una mayor precisión de decodificación, es necesario verificar que las microesferas fueron suspendidas de forma homogénea en toda la incubación y el lavado pasos durante el proceso de codificación de microesferas. Además, las microesferas codificadas necesitan ser protegidos de la luz a lo largo de todo el experimento. Siguiendo los procedimientos de codificación y de almacenamiento adecuadas, encontramos que la precisión global de d...

Desde la primera micromatriz reportado por Mark Schena y compañeros de trabajo a mediados de la década de 1990, esta potente herramienta se ha utilizado en muchos campos de la investigación biológica 1. Microarrays de anticuerpos capaces de detectar simultáneamente múltiples proteínas en los fluidos de diagnóstico, tales como la sangre, tienen aplicaciones importantes en el diagnóstico clínico y la detección de biomarcadores 2-10. La saliva, que contiene muchos de los mismos analitos como la sangre, ha sido considerada como una alternativa preferible a la sangre debido a la toma de saliva es segura, no invasiva, y puede ser llevado a cabo por el personal médico mínimamente entrenados 11-13. Actualmente, el análisis de proteínas multiplexada usando muestras de saliva está limitado por varios factores importantes, incluyendo la baja concentración de analito diana 14 y el amplio intervalo de concentración de diferentes biomarcadores 15. . En este documento, se demuestra el análisis de seis proteínas: factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), proteína inducida por gamma-interferón 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento epidérmico (EGF), metalopeptidasa matriz 9 (MMP-9), y la interleucina-1 beta (IL-1β) . El rendimiento del método se verificó inicialmente usando soluciones estándar que constituyen las proteínas recombinantes de analito y tampón de bloqueo. Muestras de saliva real obtenida de pacientes de diferentes enfermedades respiratorias crónicas, así como también controles sanos se probaron con un rendimiento satisfactorio. El protocolo debe ser aplicable a otros analitos de proteínas y otros ensayos basados ​​en microesferas. Esta plataforma ofrece ventajas considerables para el campo de la Química Analítica, ya que permite el análisis simultáneo rápido, preciso, y reproducible de bajas concentraciones de varias proteínas con un amplio rango dinámico, un mínimo de interacciones no específicas, la reducción del consumo de la muestra, y de bajo costo en comparación con un Ensayo inmunoenzimático análoga (ELISA).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eu-TTA dye</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC42319-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34865-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-23B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coumarin 30 dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspheres</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>PC05N/6698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tw-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BupH MES buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05030-500ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS256-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-lock microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR labshop</td>
			<td>53511-997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IP-10 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MMP-9 capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-1&#946; capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 isotype control antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StartingBlock (TBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard solution 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-free (PBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGF 165</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IP-10</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>266-IP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human MMP-9</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>911-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-1&#946;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>201-LB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StartingBlock T20 (PBS) buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker BSA in PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated VEGF detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IP-10 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IL-8 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated EGF detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated MMP-9 detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated IL-1&#946; detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-phycoerythrin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-21388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent microarray for human salivary protein analysis using polymer microspheres and fiber-optic bundles

En la presente memoria, se describe un protocolo para medir simultáneamente seis proteínas en la saliva utilizando una matriz de anticuerpos basados ​​en microesferas de fibra óptica. La tecnología de inmuno-matriz empleada combina las ventajas de la suspensión de microesferas a base de matriz de la fabricación con el uso de microscopía de fluorescencia. Como se describe en el protocolo de vídeo, comercialmente disponibles microesferas de polímero 4,5 micras fueron codificados en siete tipos diferentes, que se diferencian por la concentración de dos colorantes fluorescentes atrapados físicamente dentro de las microesferas. Las microesferas codificadas que contienen grupos carboxilo superficiales fueron modificados con anticuerpos de captura monoclonales través de la química de acoplamiento EDC / NHS. Para ensamblar el microarray de proteínas, los diferentes tipos de microesferas codificadas y funcionalizados se mezclaron y se depositan aleatoriamente en 4,5 micras micropocillos, que fueron grabadas químicamente en el extremo proximal de un haz de fibra óptica. El haz de fibra óptica se utiliza como un portador y para obtener imágenes de la microspheres. Una vez montado, se utilizó el microarray para capturar las proteínas en el sobrenadante de la saliva obtenida de la clínica. La detección se basa en un inmunoensayo de tipo sándwich usando una mezcla de anticuerpos de detección biotinilados para diferentes analitos con una sonda fluorescente conjugada con estreptavidina, R-ficoeritrina. La micromatriz Se obtuvieron imágenes por microscopía de fluorescencia en tres canales diferentes, dos para el registro de microesferas y uno para la señal de ensayo. Las micrografías de fluorescencia se descodifican y se analizaron usando un algoritmo de hecho en casa en MATLAB.

Las imágenes de fluorescencia de tres canales que muestran una pequeña sección del haz de fibra óptica se muestran en las Figuras 2A-C. Estas imágenes se analizaron utilizando un algoritmo escrito en MATLAB (como se describe en más detalle en la sección Discusión). El análisis utiliza tanto la información de la imagen de codificación de Eu-TTA (Figura 2A) y la imagen de codificación de C30 (Figura 2B) para decodificar las microesferas, y se calcularon las in...

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Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados ​​en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.

Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

11.6K vistas.  Tufts University.  Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados ​​en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo s?...

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Gyroid Nickel Nanostructures from Diblock Copolymer Supramolecules

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, have high porosity, high surface-to-volume and strength-to-weight ratio. Unfortunately, common approaches for preparation of metallic nanostructures render materials with highly disordered architecture, which might have an adverse effect on their mechanical properties. Block copolymers have the ability to self-assemble into ordered nanostructures and can be applied as templates for the preparation of well-ordered metal nanofoams. Here we describe the application of a block copolymer-based supramolecular complex - polystyrene-block-poly(4-vinylpyridine)(pentadecylphenol) PS-b-P4VP(PDP) - as a precursor for well-ordered nickel nanofoam. The supramolecular complexes exhibit a phase behavior similar to conventional block copolymers and can self-assemble into the bicontinuous gyroid morphology with two PS networks placed in a P4VP(PDP) matrix. PDP can be dissolved in ethanol leading to the formation of a porous structure that can be backfilled with metal. Using electroless plating technique, nickel can be inserted into the template&#39;s channels. Finally, the remaining polymer can be removed via pyrolysis from the polymer/inorganic nanohybrid resulting in nanoporous nickel foam with inverse gyroid morphology.

This article describes the preparation of well-ordered nickel nanofoams via electroless metal deposition onto nanoporous templates obtained from self-assembled diblock copolymer based supramolecules.

Gyroid Níquel Nanoestructuras de copolímero de dibloques supramoléculas

Nanoporous metal foams possess a unique combination of properties - they are catalytically active, thermally and electrically conductive, and furthermore, ...

Investigación

Química

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous polymer monoliths. The developed approach is based on the preparation of a macroporous polymer containing carboxylic acid functional groups and the subsequent step-by-step solution-based controlled growth of a layer of a porous coordination polymer on the surface of the pores of the polymer monolith. The prepared metal-organic polymer hybrid has a high specific micropore surface area. The amount of iron(III) sites is enhanced through metal-organic coordination on the surface of the pores of the functional polymer support. The increase of metal sites is related to the number of iterations of the coating process.
The developed preparation scheme is easily adapted to a capillary column format. The functional porous polymer is prepared as a self-contained single-block porous monolith within the capillary, yielding a flow-through separation device with excellent flow permeability and modest back-pressure. The metal-organic polymer hybrid column showed excellent performance for the enrichment of phosphopeptides from digested proteins and their subsequent detection using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The presented experimental protocol is highly versatile, and can be easily implemented to different organic polymer supports and coatings with a plethora of porous coordination polymers and metal-organic frameworks for multiple purification and/or separation applications.

A procedure for the preparation of porous hybrid separation media composed of a macroporous polymer monolith internally coated by a high surface area microporous coordination polymer is presented.

Preparación de altamente poroso Coordinación Polymer Coatings en macroporosas Polymer Monolitos de Enriquecimiento mejorada de Phosphopeptides

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous solution. In a carbon nanotube/PEO105-PPO70-PEO105 (poloxamer 407) aqueous solution, the amphiphilic poloxamer 407 adsorbs onto the carbon nanotube surfaces and self-assembles into continuous layers, driven by intermolecular interactions between constituent molecules. The addition of 5-methylsalicylic acid changes the self-assembled structure from spherical-micellar to a cylindrical morphology. The fabricated poloxamer 407/carbon nanotube hybrid particles exhibit thermo-responsive structural features so that the density and thickness of poloxamer 407 layers are also reversibly controllable by varying temperature. The detailed structural properties of the poloxamer 407/carbon nanotube particles in suspension can be characterized by small-angle neutron scattering experiments and model fit analyses. The distinct curve shapes of the scattering intensities depending on temperature control or addition of aromatic additives are well described by a modified core-shell cylinder model consisting of a carbon nanotube core cylinder, a hydrophobic shell, and a hydrated polymer layer. This method can provide a simple but efficient way for the fabrication and in-situ characterization of carbon nanotube-based nano particles with a structure-tunable encapsulation.

A method for the functionalization of carbon nanotubes with structure-tunable polymeric encapsulation layers and structural characterization using small-angle neutron scattering is presented.

Funcionalización de pared simple nanotubos de carbono con Thermo-reversibles copolímeros de bloque y Caracterización de ángulo pequeño dispersión de neutrones

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

The Preparation and Properties of Thermo-reversibly Cross-linked Rubber Via Diels-Alder Chemistry

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ethylene-propylene rubber, grafted with maleic anhydride, is thermo-reversibly cross-linked in two steps. The pending anhydride moieties are first modified with furfurylamine to graft furan groups to the rubber backbone. These pendant furan groups are then cross-linked with a bis-maleimide via a Diels-Alder coupling reaction. Both reactions can be performed under a broad range of experimental conditions and can easily be applied on a large scale. The material properties of the resulting Diels-Alder cross-linked rubbers are similar to a peroxide-cured ethylene/propylene/diene rubber (EPDM) reference. The cross-links break at elevated temperatures (&#62; 150 &#176;C) via the retro-Diels-Alder reaction and can be reformed by thermal annealing at lower temperatures (50-70 &#176;C). Reversibility of the system was proven with infrared spectroscopy, solubility tests and mechanical properties. Recyclability of the material was also shown in a practical way, i.e., by cutting a cross-linked sample into small parts and compression molding them into new samples displaying comparable mechanical properties, which is not possible for conventionally cross-linked rubbers.

A simple two-step approach involving rubber modification and cross-linking yields fully reworkable, elastic rubber products.

La preparación y propiedades de termo-reversible reticulado Química Caucho Vía de Diels-Alder

A method for using Diels Alder thermo-reversible chemistry as cross-linking tool for rubber products is demonstrated. In this work, a commercial ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semillas

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

Seco de microfluidos-spinning y caracterización de las fibras regeneradas fibroína de seda

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

Espectroscopia de impedancia electroquímica como herramienta para la valoración constante de tipo electroquímico

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

Tiempo-resolved fotofísicas caracterización de trío cosecha compuestos orgánicos en un libre de oxígeno ambiente usando un iCCD cámara

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

Using Cyclic Voltammetry, UV-Vis-NIR, and EPR Spectroelectrochemistry to Analyze Organic Compounds

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance (EPR) or ultraviolet-visible and near-infrared (UV-Vis-NIR) spectroscopies, we obtain useful information such as electron affinity, ionization potential, band-gap energies, the type of charge carriers, and degradation information that can be used to synthesize stable organic electronic devices. In this study, we present electrochemical and spectroelectrochemical methods to analyze the processes occurring in active layers of an organic device as well as the generated charge carriers.

In this article, we describe electrochemical, electron paramagnetic resonance, and ultraviolet-visible and near-infrared spectroelectrochemical methods to analyze organic compounds for application in organic electronics.

Usando voltametría cíclica, UV-Vis-NIR y EPR Spectroelectrochemistry para analizar compuestos orgánicos

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance ...

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of the data and determines which properties of the film can be quantified. The quartz crystal microbalance offers a uniquely sensitive platform for measuring fine changes in mass and/or mechanical properties of an applied film by observing the changes in mechanical resonance of a quartz crystal oscillating at high frequency. The advantages of this approach include its experimental versatility, ability to study changes in properties over a wide range of experimental time lengths, and the use of small sample sizes. We demonstrate that, based on the thickness and shear modulus of the layer deposited on the sensor, we can acquire different information from the material. Here, this concept is specifically exploited to display experimental parameters resulting in mass and viscoelastic calculations of adsorbed collagen on gold and polyelectrolyte complexes during swelling as a function of salt concentration.

The quartz crystal microbalance can provide accurate mass and viscoelastic properties for films in the micron or submicron range, which is relevant for investigations in biomedical and environmental sensing, coatings, and polymer science. The sample thickness influences which information can be obtained from the material in contact with the sensor.

Preparación de muestras en Mediciones de microbalance de cristal de cuarzo de adsorción de proteínas y mecánica de polímeros

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...