Nous remercions Martine Emond et Isabel Brachmann pour leur aide dans l&#39;établissement du système de tranches organotypiques culture et Wolfgang Hübner et Liviu Gabriel Bodea pour la lecture critique du manuscrit. Nous tenons à remercier Frank Costantini pour le R26 souris Cliff Tabin journaliste et pour les souris CREER Shh. Cette étude a été financée par une bourse de recherche du ministère de la Science et la Recherche de la Rhénanie du Nord Westphalie (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen aus dem Ausland Spitzennachwuchses).

Certaines parties du présent protocole sont modifiées de Daza et al., 2007 7. 1. Préparatifs <ol><li> Peut être préparé un jour à l&#39;avance <ol><li> Préparer 1X tampon de Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 11 mM de glucose, 25 mM NaHCO 3; ajuster le pH à 7,4. Stériliser par filtration (0,22 um taille des pores) et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer le milieu de culture (20 ml): 5 ml de HBSS, 9 ml de DMEM glucose élevé, 850 ul de glucose à 30%, 5 ml de sérum de cheval (25%). Ajouter 200 uL Penicllin 100X / streptomycine. Conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparer avant de commencer la dissection <ol><li> Préparer 100 ml de 4% de fusion bas agarose (agarose LMP) en 1X tampon de Krebs: micro-ondes la solution jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est complètement dissous, puis placer l&#39;agarose dans un bain d&#39;eau à 45 ° C. </li><li> Remplissez le vibreurBac tampon Tomé avec tampon glacé 1X Krebs et commencer à l&#39;élément de refroidissement (conserver à 4 ° C). Fixer une lame de rasoir dans le porte-lame et mettre en place la zone vibratome avec un scalpel, un pinceau fin et une cuillère perforée mini de ramasser les morceaux. Préparer des boîtes de Petri stériles (35 x 10 mm) avec 1x tampon de Krebs pour la collecte des tranches. Restez sur la glace. </li><li> Mise en place de la zone de dissection avec des plats de Pétri (100 x 15 mm) pour la dissection et les petits boîtes de Petri stériles (35 x 10 mm) pour l&#39;intégration, de petits ciseaux, deux pinces fines (Dumont 5), une cuillère perforée mini, un verre pipette Pasteur polies au feu avec une ronde fermée pointe et 1 L de 1X tampon de Krebs sur la glace. Essuyez tous les outils de dissection à l&#39;éthanol 70%. </li><li> Ajouter milieu de culture pour les puits d&#39;une plaque de six puits (1,5 ml / puits) et le placer dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Préparer une plaque de six puits avec 1,5 ml / puits stériles 1X tampon de Krebs et 15 uL Penicillium / streptomycine (100X) / puits. Dans des conditions stériles, placer Milinserts de culture cellulaire licell dans les puits. Placer la plaque de six puits à côté de la vibratome afin que les tranches de cerveau peuvent être transférées sur des membranes de filtre immédiatement après la coupe. </li></ol></li></ol> 2. Dissection et enrobage de cerveaux d&#39;embryons <ol><li> Anesthetize une souris femelles gravides en utilisant l&#39;isoflurane et le sacrifice de la souris par dislocation cervicale (embryons doivent être au stade E12.5). Disséquer l&#39;utérus de la souris en tirant vers le haut de l&#39;utérus avec une pince. Utilisez une pince d&#39;autres pour séparer les mésométrium loin de l&#39;utérus. Placez l&#39;utérus dans glacée 1X tampon de Krebs. Utilisez une pince fine pour séparer la paroi musculaire de l&#39;utérus, de la membrane de Reichert et le viscéral du sac vitellin de l&#39;embryon. Retirez les embryons dans l&#39;utérus. Placer les embryons disséqué dans un plat séparé de Petri avec tampons stériles 1X Krebs. </li><li> Disséquer le cerveau sous un stéréomicroscope. Pour disséquer le cerveau, d&#39;abord couper la tête de l&#39;embryon. Fixez la têteen perçant une pince fine à travers la tête (au niveau des yeux). Utilisez une autre paire de pinces pour enlever soigneusement la peau et le crâne. Utilisez une pince pour soulever délicatement la cervelle et le transférer dans une boîte de Pétri stériles avec tampon 1X Krebs. Il est très important que l&#39;intégrité de l&#39;ensemble du cerveau est maintenu lors de la dissection, puisque les dommages aux tissus du cerveau va créer des problèmes (comme le déchiquetage des tissus) pendant la coupe sur le vibratome. </li><li> Laver le cerveau une fois dans 4% à faible point de fusion (LMP) agarose. Intégrer 2-3 cerveaux à un moment dans l&#39;eau douce de 4% d&#39;agarose LMP. Placez les plats intégrant sur la glace aussi uniforme que possible. Utiliser une pipette Pasteur avec une pointe polie au feu rond pour soulever le cerveau jusqu&#39;à ce que le fond de l&#39;agarose est solidifié. Le cerveau doit s&#39;installer dans une position horizontale plane au fond du bloc d&#39;agarose. </li><li> Après l&#39;agarose a entièrement solidifié (après environ 3 min), coupez l&#39;agarose entourant le cerveau et de la colle le bloc d&#39;agarose sur la scène éprouvettede l&#39;vibratome. Lorsque le collage des blocs, assurez-vous que la face ventrale du cerveau est parallèle à la plate-forme, puisque le cerveau doit être coupé dans un plan de coupe horizontale. </li></ol> 3. Sectionnement Vibratome <ol><li> Utilisez une lame de rasoir pour la coupe. Pour obtenir des tranches intactes, il est très important de maintenir la température à 4 ° C pendant la coupe. </li><li> L&#39;article 300 um d&#39;épaisseur des tranches horizontales à une fréquence de 50 Hz, amplitude de lame de 1,1 mm et une vitesse de 25 mm / sec. </li><li> Utilisez le pinceau fin pour pousser la tranche dans une cuillère perforée mini pour recueillir les tranches de cerveau et de les transférer dans un plat avec le tampon glacée stériles 1X Krebs. Choisissez la tranche qui contient le tissu du mésencéphale ventral (voir Figure 1). Dans un cerveau de souris E12.5 il ya juste une tranche de 300 um horizontale qui contient des tissus du mésencéphale ventral, y compris les neurones dopaminergiques. </li></ol> 4. Trancher la culture Étapes 4.2 à 4.5 doit être effectuée dans des conditions stériles. <ol><li> Transférer les tranches de cerveau sur un insert de cellules Millicell la membrane de la culture dans une plaque de six puits avec 1x tampon Krebs (voir point 1.2.5). Pour transférer la tranche utiliser la cuillère mini perforé (Fine Science Tools) et un pinceau fin. Jusqu&#39;à 3 tranches peut être placé sur une membrane. </li><li> Transférer la membrane avec la tranche de la plaque de six puits de milieu de culture (voir point 1.2.5). Le sommet de la membrane ne doit pas être couvert par médium. La tranche de cerveau reçoit moyennes de l&#39;air par le bas et en haut. </li><li> Placer la plaque de six puits dans un incubateur avec 5% de CO 2 à 37 ° C. Il est très important que les tranches sont placées dans l&#39;incubateur dans les 2 heures après l&#39;étape initiale de la dissection. Un temps de préparation plus étendue peut entraîner une faible survie des tranches. </li><li> Tranches peuvent être maintenues in vitro jusqu&#39;à 3 jours. Changement de 50% du milieu de culture sur le 2 ème jour. </li></ol><ol><li> Laissez les tranches de récupérer dans l&#39;incubateur pendant 4-5 heures avant de commencer imagerie time-lapse. </li><li> Pour imagerie time-lapse, garder les tranches sur l&#39;insert membrane et le transfert de l&#39;insérer dans un 35 mm ibidi μ-vaisselle (le fond du plat se compose du matériel avec une qualité optique de haut). </li><li> Ajouter 1 mL de milieu de culture, plus 1,5 uL d&#39;acide ascorbique (200 mM) pour le plat. L&#39;acide ascorbique protège les tranches contre la phototoxicité. </li><li> Incuber tranches dans un caisson climatique à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant imagerie time-lapse. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs La figure 1 illustre la préparation de cultures organotypique de E12.5 cerveau de souris. La figure 2 montre les tranches organotypiques horizontale (aiguë et après plusieurs jours de culture) a obtenu le cerveau de souris sous forme E12.5. A titre de comparaison, des sections de cerveau congelé à des étapes équivalentes de développementsont affichés. Neurones dopaminergiques du mésencéphale sont visualisées par immunohistochimie de la tyrosine hydroxylase (TH). Mésencéphale projet dopaminergiques neurones cibles dans le cerveau antérieur. Ces projections commencent à se former à E12.5 et s&#39;étendent vers le prosencéphale pendant les jours suivants. Nous considérons que le développement des projections du cerveau antérieur comme une bonne indication pour le développement normal des neurones dopaminergiques dans la culture. Dans le mésencéphale horizontale tranches neurones dopaminergiques d&#39;étendre les projections vers leur zone de prosencéphale cible appropriée. Après 3 DIV (jours in vitro) ou lorsque les zones cibles du cerveau antérieur sont endommagés, des projections aberrantes s&#39;étendent vers le mésencéphale dorsal. Exemples de coupes coronales du mésencéphale E12.5 sont présentés dans la figure 3. Les neurones dopaminergiques visualisées avec immunomarquage pour TH prolonger les projections aberrantes à l&#39;mésencéphale dorsal. La figure 4 montre une analyse de la prolifération, les cellules nécrotiques et apoptotiques dans les cultures organotypique. BrdU immunostaining de visualiser les cellules en prolifération démontre que les cellules prolifèrent dans des conditions de culture après une DIV. La prolifération est réduite après 4 DIV. Après 3 DIV, de nombreuses cellules dans le mésencéphale ventral subissent une nécrose (coloration iodure de propidium) et apoptose (immunomarquage de la caspase-3 clivée). La figure 5 montre les chemins de migration des neurones marqués YFP surveillée dans une expérience d&#39;imagerie time-lapse dans une tranche aiguë . <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma illustrant la préparation de cultures organotypique. 300 um tranches de cerveau horizontale sont préparés par sectionnement d&#39;un cerveau en utilisant un vibratome E12.5. (A) vue sagittale schématique d&#39;un cerveau de souris E12.5. Niveaux des sections sont indiquées. La zone contenant les neurones dopaminergiques est représenté en rose, les projections sont indiquées en bleu. (B) Schémas des trois tranches qui peuvent être obtenus à partir de dorsal à ventral et that contenir à la fois du cerveau antérieur (Fb) et le mésencéphale (Mo). Notez que seule une tranche contient les neurones dopaminergiques (b tranche). La tranche appropriée peuvent être identifiés en fonction de la position des ventricules et la continuité du tissu mésencéphale et du cerveau antérieur (flèches, comparer la section B de l&#39;article a et c). La zone contenant les neurones dopaminergiques est indiqué en rose, la zone contenant des précurseurs dopaminergiques est représenté en vert, les flèches bleues indiquent les projections de développement. (C) La tranche contenant les neurones dopaminergiques est cultivé sur des inserts membrane. Abréviations: VMB, mésencéphale ventral; DMB, du mésencéphale dorsal; Hyp, l&#39;hypothalamus; Hb, rhombencéphale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" /> Figure 2. Projections des neurones dopaminergiques du mésencéphale dans les cultures organotypique sont dépendants de l&#39;intégrité du cerveau antérieur. L&#39;immunohistochimie de la tyrosine hydroxylase (TH) pour étiqueter les neurones dopaminergiques. (A) tranche aiguë (0 DIV)indiquant l&#39;emplacement normal des neurones dopaminergiques dans le mésencéphale ventral. La flèche blanche indique la zone qui est montré dans un plus fort grossissement dans l&#39;encart. Projections à l&#39;prosencéphale n&#39;ont pas encore développé. Après une DIV, les projections à l&#39;prosencéphale commencent à se former. Projections s&#39;étendre dans le cerveau antérieur à 2-3 DIV. Flèches blanches indiquent l&#39;emplacement des corps cellulaires indiqué dans un plus fort grossissement dans les encarts (cadre blanc). Les flèches jaunes soulignent les projections normales en tranches intactes indiqué dans un plus fort grossissement dans les encarts (cadre jaune). Aberrant projections se développer en tranches avec du prosencéphale endommagé. Les flèches rouges indiquent les projections aberrantes de la dorsale du mésencéphale indiqué dans un plus fort grossissement dans les encarts (cadre rouge). Les dommages sont indiquées par des astérisques rouges. Après 3 DIV, la plupart des tranches (n = 5 / 7) avaient des projections aberrantes vers le mésencéphale dorsal. (B) immunomarquage TH sur l&#39;horizontale des sections de cerveau congelé à différents stades de développement de montrer le développementdes projections dopaminergiques in vivo. Flèches blanches indiquent l&#39;emplacement des corps cellulaires indiqué dans un plus fort grossissement dans les encarts (cadre blanc). Les flèches jaunes soulignent la position de la projections du plus fort grossissement dans les encarts (cadre jaune). Le niveau des sections gelées a été choisi pour se rapprocher du niveau de la tranche de cultures organotypiques. Notez qu&#39;un sections congelées (12 um) ne représente pas toute la tranche organotypique (300 um). Par conséquent, les projections montré à E13.5 E14.5 et ont été observés sur les articles 120 um plus ventral que la section contenant les corps cellulaires (astérisques jaune). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" /> Figure 3. Mésencéphale cultures tranche coronale colorées pour la tyrosine hydroxylase (TH) comme un marqueur des neurones dopaminergiques. (AC) Tranches après DIV 1, 2 ou 3. Les neurones dopaminergiques développent des projections vers le mésencéphale aberrante dorsale (rflèches éd.) Pointes de flèches montrent l&#39;emplacement des corps cellulaires dopaminergiques. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" /> Figure 4. Prolifération cellulaire et la viabilité des cellules en culture organotypique mésencéphale. (A) Les cellules en prolifération ont été marqués par l&#39;ajout de BrdU (50 ng / mL, Sigma) au milieu de culture pendant 18 h. Les tranches ont été par la suite immunocolorées pour BrdU. Après une DIV, les cellules BrdU marqués sont situés dans les zones ventriculaires (flèches rouges). Après 4 DIV, les cellules proliférantes sont plus dispersés et une zone ventriculaire distinctes n&#39;est plus maintenu. (B) Les cellules nécrotiques ont été marqués par addition d&#39;iodure de propidium (1μg/μL, Sigma) au milieu de culture pendant 2 heures et visualisé par microscopie à fluorescence. Après une DIV, le mésencéphale ventral (vmb) n&#39;est pas nécrosée, mais de nombreuses cellules d&#39;iodure de propidium marqué peut être vu dans le mésencéphale dorsal et du cerveau antérieur. Après 3 DIV de la viabilité cellulaire diminue dans le midbra ventralepo Barre d&#39;échelle: 500 um (C) Immunostaing pour la caspase-3 clivée de visualiser les cellules apoptotiques. A 1 ou 2 DIV, seuls quelques neurones dopaminergiques (TH) sont apoptotiques. Après 3 DIV, les neurones dopaminergiques de commencer à entrer en apoptose. Panneaux au milieu et à droite sont forts grossissements de la zone encadrée dans les panneaux de gauche. Les images sont forts grossissements projections d&#39;intensité maximale de z-stacks de 14-16 frames. Les images ont été prises toutes les 0,5 um avec un Zeiss Apotome set-up. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" /> Figure 5. Route migratoire des YFP neurones marqués dans une tranche aiguë. (A) Tranche horizontale utilisé pour l&#39;imagerie laps de temps de YFP neurones marqués. La tranche a été incubé pendant 5 heures avant l&#39;imagerie. Les cellules ont été marquées en utilisant une inductible Cre / loxP système 6. Shh souris CREER 8 et souris ROSA journaliste loxP-STOP-loxP-EYFP 9, nousre utilisé. La recombinaison de l&#39;allèle journaliste ROSA (et d&#39;expression EYFP) est induite dans les cellules qui expriment CREER (Shh cellules exprimant), mais seulement sur l&#39;administration de tamoxifène (Sigma). Dans cet exemple, le tamoxifène (3 mg/40 g de poids corporel) a été administré à des souris gravides à E8.5. Ce dispositif expérimental est principalement attribuable à l&#39;étiquetage des précurseurs des neurones dopaminergiques et leurs descendants dans le mésencéphale ventral 10,11. Barre d&#39;échelle: 500 um. (B) traçage de la route migratoire de la YFP neurones marqués dans une tranche aiguë. Time-lapse images de YFP neurones marqués destin tracé ont été acquises toutes les 30 min pour un temps total de 5 h 30 min sur un Zeiss Axio Observer-microscope (objectif CE PlnN 10x / 0,3). Les tranches ont été incubées dans une chambre environnementale (incubateur XLS1 Pecon) à 37 ° C et fourni avec 5% de CO 2 au cours de l&#39;imagerie. La position initiale des cellules est marqué par des flèches rouges, les positions de migration sont marqués d&#39;un astérisque rouge.

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	<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).</li><li>Martini, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136 (1), 41-41 (2009).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834-a001834 (2010).</li><li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trekking+across+the+brain:+the+journey+of+neuronal+migration.">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-29 (2007).</li><li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron.">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21-21 (2007).</li><li>Legue, E., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+using+site-specific+recombinases.">Genetic fate mapping using site-specific recombinases.</a> Methods. Enzymol. 477, 153-153 (2010).</li><li>Daza, R. A., Englund, C., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+embryonic+brain+tissue.">Organotypic slice culture of embryonic brain tissue.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Harfe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+expansion-based+temporal+Shh+gradient+in+specifying+vertebrate+digit+identities.">Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities.</a> Cell. 118 (4), 517-517 (2004).</li><li>Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev. Biol. 1, 4-4 (2001).</li><li>Joksimovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+separable+Shh+domains+in+the+midbrain+define+distinct+dopaminergic+progenitor+pools.">Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185-19185 (2009).</li><li>Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-spatial+changes+in+Sonic+Hedgehog+expression+and+signaling+reveal+different+potentials+of+ventral+mesencephalic+progenitors+to+populate+distinct+ventral+midbrain+nuclei.">Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei.</a> Neural. Dev. 6 (1), 29-29 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3 (5), e159-e159 (2005).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La méthode organotypique culture présentées ici fournit un système pour le court terme dans l&#39;analyse in vitro des neurones dopaminergiques de développement et de leurs routes migratoires et de projection dans le mésencéphale embryonnaire ventrale. Nous avons trouvé qu&#39;il ya un certain nombre d&#39;étapes critiques dans le protocole qui doit être soignée afin d&#39;obtenir des tranches qui permettent le développement normal des neurones dopaminergiques du mésencéphale ventral. L&#39;étape...

Table des réactifs spécifiques et des équipements <table border="1"><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose 30% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L Glc., Avec L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429-500 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine 100x </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333-20 </td><td></td></tr><tr><td> Acide L-ascorbique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4403 </td><td> Préparez le bouillon 200mm et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> UltraPure agarose LMP </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Insère Millicel </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> μ-plat de 35 mm, faible </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> Lame de rasoir </td><td> Plano GmbH </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl colle </td><td> BRAU9381104 </td><td> Braun Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> Dia cuillère perforée diamètre 15 mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> Pince 5 Dumoxel </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr></table> Anticorps utilisés pour immunomarquages: <table border="1"><tr><td&gt; Nom de l&#39;anticorps </td><td> Société </td><td > Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Lapin anti-tyrosine hydroxylase </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> Dilution 1:500 </td></tr><tr><td> Souris anti-tyrosine hydroxylase </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> Dilution 1:500 </td></tr><tr><td> Souris anti-BrdU </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555627 </td><td> Dilution 1:200 </td></tr><tr><td> Lapin anti-caspase 3 clivée </td><td> Technologie signalisation cellulaire </td><td> 9661 </td><td> Dilution 1:200 </td></tr><tr><td> D&#39;âne anti-IgG de lapin-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> Dilution 1:500 </td></tr><tr><td> D&#39;âne anti-IgG de souris-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-165-150 </td><td> Dilution 1:200 </td></tr></table>

organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro

La souris est un organisme excellent modèle pour étudier le développement du cerveau des mammifères en raison de l&#39;abondance de données moléculaires et génétiques. Toutefois, le cerveau de souris en développement n&#39;est pas adapté pour la manipulation facile et d&#39;imagerie in vivo, depuis l&#39;embryon de souris est inaccessible et opaque. Cultures organotypique de cerveaux embryonnaires sont donc largement utilisées pour étudier le développement du cerveau murin in vitro. Ex-vivo la manipulation ou l&#39;utilisation de souris transgéniques permet la modification de l&#39;expression génique afin que les sous-populations de cellules neuronales ou gliales peuvent être étiquetés avec des protéines fluorescentes. Le comportement des cellules marquées peuvent alors être observés à l&#39;aide imagerie time-lapse. Time-lapse d&#39;imagerie a été particulièrement fructueuse pour l&#39;étude des comportements cellulaires qui sous-tendent le développement du cortex cérébral à la fin des stades embryonnaires 1-2. Embryonnaire des systèmes de culture organotypiques de tranches dans les régions du cerveau en dehors du cerveau antérieur sont establis moins bienhed. Par conséquent, la richesse des données d&#39;imagerie time-lapse décrivant la migration des cellules neuronales est limitée à 3,4 le prosencéphale. Il n&#39;est pas encore connu, si les principes découverts par le cerveau dorsale vrai pour les zones du cerveau ventral. Dans le cerveau ventrale, les neurones sont organisés en grappes neuronale plutôt que des couches et ils ont souvent à subir les trajectoires migratoires complexes pour atteindre leur position finale. Le mésencéphale ventral est non seulement un bon modèle pour le développement du cerveau ventral, mais contient aussi des populations neuronales comme les neurones dopaminergiques qui sont pertinentes dans les processus de la maladie. Alors que la fonction et la dégénérescence des neurones dopaminergiques a été étudiée en détail chez l&#39;adulte et le vieillissement du cerveau, on connaît peu le comportement de ces neurones au cours de leur différenciation et 5 phase de migration. Nous décrivons ici la génération des cultures tranche du jour embryonnaire (E) 12,5 mésencéphale ventral de la souris. Ces cultes trancheres sont potentiellement adaptés à la surveillance développement des neurones dopaminergiques sur plusieurs jours in vitro. Nous mettons en évidence les étapes critiques dans la génération des tranches de cerveau à ces stades précoces du développement embryonnaire et de discuter les conditions nécessaires pour maintenir un développement normal des neurones dopaminergiques in vitro. Nous avons également présenter les résultats des expériences d&#39;imagerie time lapse. Dans ces expériences, les précurseurs du mésencéphale ventral (y compris les précurseurs dopaminergiques) et leurs descendants ont été étiquetés de manière à l&#39;aide d&#39;une mosaïque de Cre / loxP système de cartographie basée sur le destin inductible 6.

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Une méthode pour générer des tranches organotypiques de l&#39;embryon murin E12.5 mésencéphale est décrite. Les cultures organotypique peut être utilisé pour observer le comportement des neurones dopaminergiques du mésencéphale ou d&#39;autres neurones ventraux.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

17.8K vues.  University of Bonn. Une méthode pour générer des tranches organotypiques de l'embryon murin E12.5 mésencéphale est décrite. Les cultures organotypique peut être utilisé pour observer le comportement des neurones dopaminergiques du mésencéphale ou d'autres neurones ventraux.

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Le modèle organotypiques d&#39;hippocampe Culture Slice d&#39;examen des lésions neuronales

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Recherche

Neurosciences

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

En électroporation in ovo dans Mésencéphale Poussin pour étudier la fonction des gènes dans le développement neurone dopaminergique

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle expérimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l&#39;ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...