Este protocolo nos permite identificar las vías de guía del axón activas en el nervio oculomotor y evaluar sus funciones en diferentes puntos a lo largo de la trayectoria nerviosa en tiempo real. Esta técnica preserva los entornos locales a través de los cuales viajan los axones y sus objetivos finales. Los axones en crecimiento no se cortan, por lo que se puede evaluar el crecimiento inicial del axón, en lugar de la regeneración.
Este método proporciona información sobre la orientación del axón en el sistema motor ocular, pero podría adaptarse al estudio de la guía de axón de otros nervios. Esta técnica requiere práctica para dominar, y trabajar rápidamente es extremadamente importante. Al probarlo por primera vez, utilice sólo unos pocos embriones, en lugar de una camada entera.
Antes de comenzar el procedimiento, primero confirme el embarazo por ultrasonido en el día embrionario 10.5 de un apareamiento cronolagado. Cosecha los embriones, rocía el abdomen del ratón embarazada con 70%etanol y usa tijeras para abrir la cavidad abdominal para extraer el útero. Lave el útero en una placa Petri de HBSS helado antes de colocar el órgano en un segundo plato petri de HBSS fresco helado.
Bajo un alcance diseccionado, retire los embriones del cuerno uterino y sus sacos amnióticos individuales, colocando cada embrión en la parte inferior de la tapa de una placa de 12 pozos, sobre hielo, a medida que se cosechan. Utilice papel filtrante para eliminar cualquier líquido que rodea cada embrión, sin tocar los embriones ellos mismos, y sumerja los embriones en una agarosa líquida de baja fusión. Coloque la tapa de la placa sobre hielo para solidificar la agarosa.
Cuando la agarosa se haya endurecido, voltee los embriones y cubra el otro lado de cada muestra con agarosa adicional. Cuando el segundo volumen de agarosa se haya solidificado, utilice un microscopio de disección de fluorescencia para recortar la agarosa alrededor de cada embrión de modo que cada embrión se oriente correctamente en la etapa del vibratoma. Los núcleos oculomotores y los primeros crecimientos de axones deben ser fluorescentes.
Alinee cada embrión para que el núcleo, los axones que crecen y los ojos formen una línea, y utilice una cuchilla de afeitar para recortar la agarosa paralela a esta línea. A continuación, llene la cámara del vibratomo con el tampón de la rebanada helada, y supere el primer embrión a la etapa del vibratomo para que la hoja sea paralela con el núcleo oculomotor y los ojos. Cuando el superpegamento esté seco, sumerja la etapa del vibratoma para que el embrión esté orientado mirando hacia fuera de la hoja, y utilice una nueva hoja de vibratome para obtener rodajas de 400 a 450 micrómetros.
Utilice una pipeta de transferencia estéril para transferir cada rebanada al tampón de corte en frío a medida que se adquiere, y utilice el microscopio de disección de fluorescencia para seleccionar la rebanada que contiene los núcleos y ojos oculomotores. Usando una pipeta de transferencia estéril, transfiera la rebanada a un inserto de cultivo celular en una placa de seis pozos que contenga 1,5 mililitros de medio de cultivo por pozo, y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius. Retire la agarosa residual de la etapa del vibratoma, y supere el siguiente embrión al escenario, continuando recogiendo rodajas hasta que todos los embriones hayan sido seccionados y chapados.
A continuación, añadir la concentración adecuada del inhibidor o molécula recombinante de interés, diluido en un disolvente adecuado, al medio de cada pozo. Cree una curva de dosis-respuesta. Imagen de las rodajas cada 30 minutos por contraste de fase y microscopía de fluorescencia durante un máximo de 72 horas.
Durante el desarrollo normal en el útero, los primeros axones oculomotores de proteína fluorescente verde alcanzan la órbita por día embrionario 11.5 antes de ramificarse a sus objetivos finales, como se observa en este cultivo representativo de la rebanada. La orientación de la rebanada en la etapa del vibratoma es crucial, ya que las rebanadas no son interpretables si no están orientadas correctamente. Por ejemplo, si el embrión está inclinado hacia su lado, solo se observará un núcleo oculomotor dentro de la rebanada.
Si el embrión incrustado está inclinado demasiado hacia su espalda, los ojos no estarán presentes dentro de la rebanada, y en su lugar se puede incluir la extremidad superior y el cerebro trasero o la médula espinal. También es importante tener cuidado de que durante la colocación de la rebanada en la membrana de cultivo, que el tejido no se doble. Tenga cuidado al disolver los inhibidores y factores de crecimiento en disolventes orgánicos.
Por ejemplo, en este experimento, la rebanada murió después de la adición de etanol al medio. Recuerde mantener todo sobre hielo y minimizar el tiempo entre la extracción de los embriones y la colocación de las rodajas en la incubadora. Usando esta técnica, hemos comenzado a identificar mecanismos adicionales de guía de axón en el trabajo en el sistema motor ocular.
Recuerde tener cuidado al trabajar con cuchillas de afeitar y que algunos inhibidores pueden ser peligrosos y deben manipularse cuidadosamente de acuerdo con sus perfiles de seguridad.
