Los autores desean agradecer a Tiffany de la cereza en su ayuda en la optimización de este protocolo. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Envejecimiento (AG032320), así como el avance de una mejor salud de Wisconsin.

Refiérase a la Figura 1 para un esquema básico de principios procedimiento con el homogeneizado. Tiempo estimado de preparación de extractos celulares de elución de la CAM con destino proteínas es de aproximadamente seis a siete horas. 1. Preparación de tejidos <ol><li> Inyectar organotípicos rodajas de hipocampo con un virus que contiene un plásmido que expresa la proteína recombinante de interés (en este ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados Ng) y permitir que el tejido que expresan la proteína durante la noche. </li><li> Aproximadamente 12 a 18 horas después de la inyección viral (dependiendo de la época la expresión viral), se preparan para recoger el tejido. Añadir 1 ml de buffer de la disección (glucosa 10 mM, 4 mM KCl, 26 mm de NaHCO3, 233mM sacarosa, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2, y el 0,1% de fenol-rojo, cámaras de gas con 5% de CO 2 95% O 2) a una placa de Petri. Transferencia de cultivo de tejidos / inserción de placa de Petri y añadir 2 ml de búfer disección de la inserción a sumergir el tejido. </li><li> Recolecciónt organotípicos tejido del hipocampo (entre 5 y rodajas de 10), raspando suavemente en el tejido libre de la membrana insertar utilizando un bisturí. En concreto la eliminación de una determinada región de interés (por ejemplo, CA1) es también una opción. Transferir el tejido suspendido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con una pipeta Pasteur invertida. </li><li> Centrifugar las muestras a 1.500 rcf durante 1 min para separar el tejido de la memoria intermedia de disección. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no perturbar el sedimento. </li><li> Para cada sector utiliza, agregar 30 a 60 l de tampón de homogeneización (150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, DTT 1 mM, leupeptina 1μg/mL, chemostatin 1μg/mL, antipain 1μg/mL, pepstatina 1μg/mL, y el 1% Triton X -100) a los tejidos y homogeneizar completamente con mortero. </li><li> Con el fin de eliminar los desechos celulares, centrifugar el homogenado restantes a 1.100 rcf durante 10 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración y evitando la contaminación del sedimento. </li><li> Tomar el 10% del sobrenadante como una muestra de la entrada (muestra 1). Guarde el resto de sobrenadante en hielo durante la preparación de las cuentas de la CaM-sefarosa para su uso en el paso 3. </li></ol> Nota: El tejido utilizado aquí son organotípicos rodajas de hipocampo. Sin embargo, se podría utilizar las neuronas disociadas o cualquier sistema de cultivo de células. En tal caso, comience por el paso 1.4 después de recoger el tejido de la manera adecuada. 2. Preparación de cuentas de pull-down En el manejo de las cuentas, es importante para salvar las cuentas y maximizar la eficiencia de las reacciones mediante la prevención de los granos se sequen en los lados del tubo. Para ello, lo mejor es rotar los tubos de su lado, permitiendo que la solución para humedecer los granos en las paredes del tubo, inmediatamente antes de la centrifugación. <ol><li> Para cada pull-down, una pipeta 400 l de suspensión Sepharose calmodulina cuentas en un tubo de microcentrífuga de 2 ml con un fla relativamentet-fondo para maximizar el área superficial y la interacción de sus soluciones con las cuentas durante su incubación. </li><li> Centrífuga cuentas en 21.000 rcf durante 30 segundos y retirar con cuidado el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de no molestar a las cuentas. </li><li> Para lavar los granos, añadir 100 ml de tampón de homogeneización respectivos que contienen 2 mM CaCl 2 a las que se utilizan para tirar hacia abajo de Ca 2 +-CAM proteínas de unión y 2 mM EDTA (un quelante conocido Ca 2 +) para los granos tirando hacia abajo ApoCaM proteínas de unión. Golpee suavemente el tubo para volver a suspender cuentas y centrifugar a 1.500 rcf durante 1 min. Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración, asegurándose de no molestar a las cuentas. </li></ol> Nota: Para todos los pasos de aspiración, se recomienda utilizar una pipeta de punta que tiene una abertura muy bien (por ejemplo, puntas de carga de gel) para permitir la remoción de la solución sin necesidad de retirar cuentas. 3. CAM-sefarosa unión de las proteínas <ol><li> Dividir en dos el sobrenadante que contiene las condiciones de un volumen igual. Dependiendo de su estado, agregar la cantidad adecuada de CaCl 2 o EDTA para su sobrenadante hasta una concentración de 2 mM de cada uno. </li><li> Añadir sobrenadante del paso de 1,7 a cuentas de lavado en tampón de homogeneización correspondientes. Golpee suavemente el tubo para mezclar. </li><li> Incubar las muestras a 4 ° C durante 3 horas en un agitador. Vuelva a suspender cuentas cada 30 minutos o más para aumentar la eficiencia de la unión. </li><li> Tubo de centrífuga que contienen las muestras y los granos en 1500 rcf durante 3 min. </li><li> Tome 50μL del sobrenadante como una muestra de la proteína unida (muestra 2) y retirar con cuidado el resto de sobrenadante por aspiración y descarte. </li><li> Lávese las cuentas tres veces como se describe en el paso 2.3 con 100μL de tampón de homogeneización respectivos. </li></ol> 4. Elución <ol><li> Añadir 50μL de tampón de elución (50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM y) con la condición opuesta (10 mM Cacl 2 o EDTA 10 mM) a las perlas. Por ejemplo, las muestras que se homogeneizaron y encuadernado en un tampón que contiene Ca 2 + se eluyen en el tampón de elución que contiene EDTA y viceversa. </li></ol> Opcional: Calentamiento del tampón de elución de 37 ° C antes de añadir a los granos pueden mejorar el rendimiento. <ol start="2"><li> Incubar solución con los granos a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador. Mezclar el golpeando suavemente el tubo de aproximadamente cada 5 minutos. </li><li> Centrífuga cuentas en 1500 rcf durante 3 minutos y retirar con cuidado el sobrenadante de 50μL para la unión a proteínas (muestra 3) por aspiración. Asegúrese de no molestar a las cuentas. </li><li> Añadir buffer de proteína de carga para todas las muestras (es decir, proteínas homogeneizado, no consolidados y consolidados, así como los que siguen vinculados a las cuentas). </li></ol> Nota: Para maximizar la elución (especialmente en el caso de elución ineficiente), añadir 50μL de tampón de elución correspondiente (por ejemplo, agregar buf contiene EDTAfer de cuentas vinculado en CaCl 2) a las cuentas antes de calentar las muestras para ayudar a eluir cualquier proteína restante atado y repita los pasos descritos en el apartado 4.3 para quitar restantes proteínas unidas. 5. SDS-PAGE y Western Blot Conducta SDS-PAGE y análisis mediante Western blot de sondeo para la proteína de interés y la sonda de una proteína conocida por obligar a CAM en la condición opuesta, como control positivo. 6. Resultados representante La Figura 2b muestra un ejemplo de un ensayo CAM-pull-down de pruebas de la unión CAM de GFP-etiquetados en comparación con Ng Ng endógeno. Para ello, las buenas prácticas agrarias-Ng se sobreexpresa en nuestras secciones de hipocampo organotípicos noche a la mañana y el tejido homogeneizado fue. El homogeneizado se incubó con Cam-sepharose bolas en presencia de cualquiera de Ca 2 + o EDTA. Homogeneizado de entrada muestra que la GFP-Ng se expresó además endógeno Ng y Ca 2 + / CaM-quinasa dependiente de II(CaMKII). Como era de esperar sobre la base de la unión conocida de Ng endógena (que se ilustra en la fig. 2A), GFP-etiquetados Ng se eluyó en ausencia de Ca 2 + (proteína EDTA unido) y no consolidados en la presencia de Ca 2 + (Fig. 2B) . En cambio, el control, CaMKII, se eluyó sólo en la presencia de Ca 2 + (proteínas) y fue sin enlazar en su ausencia (EDTA). Esto demuestra que las cuentas de CAM están funcionando correctamente y el eluciones eran eficientes. Lo más importante, esto demuestra que las buenas prácticas agrarias-Ng se une a ApoCaM de una manera similar a la forma endógena, lo que sugiere que la etiqueta de las buenas prácticas agrarias no alteren el funcionamiento de nuestra proteína recombinante. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema de la CAM pull-down de ensayo (A) homogeneizado de tejido se centrifuga para eliminar los restos celulares. Aproximadamente el 10% del sobrenadante se toma como una muestra de la entrada (1). El sobrenadante restante se divide por igual para los diferentescondiciones y los reactivos adecuados (CaCl 2 o EDTA) se añaden a la prueba obligatoria en esas condiciones. Cada sobrenadante (que contiene cualquiera de CaCl2 o EDTA) se carga en el preparado, respectivamente CAM-sepharose bolas y (B) se incuban para permitir la unión. Proteínas no unidos son eliminados (2) y (C) las proteínas unidas (3) se eluyen fuera de las cuentas con tampón de elución (EB), que contiene la condición opuesta a la unión. La composición de proteínas de estas tres muestras de la proteína puede ser analizada mediante SDS-PAGE y Western blot. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A) Esquema de Ca 2 +-dependiente vinculante CAM y elución en los ejemplos de ensayo de pull-down se dan de dos tipos de proteínas que se unen a una webcam en una Ca 2 +-dependiente. Neurogranina (Ng) representa proteínas que se unen apo-CAM y CaMKII representa las proteínas que se unen al Ca 2 +-ricosCaM. CAM se muestra en su estado disociado antes de la incubación con las proteínas de homogeneizado. Una vez que se incuba en condiciones de alta concentración de Ca 2 + (2 mM) o en presencia de un quelante de Ca 2 +, EDTA (2 mM), las proteínas se unen a CAM en consecuencia. Ng se une CAM en la condición de EDTA, ya que es poco o nada de Ca 2 + presentes, y se eluyó de las perlas de la CaM-sefarosa en presencia de Ca 2 +. CaMKII, sin embargo, se unen a CAM en la presencia de altas cantidades de Ca 2 + y se disocia una vez que el Ca 2 + se quelados. B) Los resultados de CAM ejemplo desplegable ensayo. Esta cifra demuestra el resultado final previsto de una cam-sefarosa desplegable con las muestras probaron para Ng y CaMKII. Tanto el Ng endógeno y las buenas prácticas agrarias Ng-están presentes en las calles de proteínas unidas a la CAM en la presencia de EDTA. No Ng está obligado cuando las muestras se incuban con la CAM en la presencia de Ca 2 +, lo que demuestra que Ng sólo obliga a apo-CAM. Nuestro control positivo, CaMKII, por el contrario, se une a la CaM en presencia de Ca 2 +.

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo al que se utiliza CAM-sepharose bolas para investigar la Ca 2 +-dependencia de la CAM-proteínas de unión. Muchas proteínas se unen una webcam en una Ca 2 +-dependiente. Estas interacciones son de gran importancia dada la cantidad de proteínas de unión a CaM y su papel fundamental en muchas vías de señalización. En este protocolo, la CAM-sepharose bolas se utilizan para separar la CaM proteínas de unión a partir de tejido homogeneizado en la presencia o ausencia de Ca 2 +...

<table border="1"><tr><td> Producto </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Calmodulina-Sepharosa cuentas </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-alfa CamKII </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranina </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Consejos Cargando Pipet </td><td> Pescador </td><td> 02-707-138 </td><td> El uso de la aspiración de sobrenadantes </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga (2,0 ml) </td><td> Pescador </td><td> 05-408-146 </td><td> Uso de todos los pasos que involucran la calmodulina-sefarosa cuentas </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Calcio (Ca 2 +) es un ion fundamental en la regulación de la función celular a través de una variedad de mecanismos. Gran parte de Ca 2 + señalización está mediada por la proteína de unión a calcio se conoce como la calmodulina (CaM) 1,2. CAM está involucrado en múltiples niveles en casi todos los procesos celulares, incluyendo la apoptosis, el metabolismo, la contracción del músculo liso, la plasticidad sináptica, el crecimiento del nervio, la inflamación y la respuesta inmune. Una serie de proteínas ayudan a regular estas vías a través de su interacción con la CAM. Muchas de estas interacciones dependen de la conformación del CAM, que es muy diferente cuando se une a Ca 2 + (Ca 2 +-CaM) en oposición a su Ca 2 +-estado libre (ApoCaM) 3. Aunque la mayoría de las proteínas diana se unen Ca 2 +-CAM, sólo ciertas proteínas se unen a ApoCaM. Algunos CAM se unen a través de su coeficiente intelectual es de dominio, incluyendo neuromodulin 4, neurogranina (Ng) 5, y algunas miosinas <sup&gt; 6. Estas proteínas se ha demostrado que juegan un papel importante en la función presináptica 7, la función postsináptica 8, 9 y la contracción muscular, respectivamente. Su capacidad para unirse y liberación de CAM en la ausencia o presencia de Ca 2 + es fundamental en su función. Por el contrario, muchas proteínas sólo se unen Ca 2 +-CAM y requieren este enlace para su activación. Los ejemplos incluyen la cinasa de la cadena ligera de miosina 10, Ca 2 + / CaM-quinasas dependientes (CaMK) 11 y fosfatasas (por ejemplo, la calcineurina) 12, y espectrina quinasa 13, que tienen una variedad de efectos directos y aguas abajo 14. Los efectos de estas proteínas en la función celular a menudo dependen de su capacidad para unirse a la CAM en una Ca 2 +-dependiente. Por ejemplo, hemos probado la relevancia de Ng-CAM vinculante en la función sináptica y cómo las diferentes mutaciones afectan a esta unión. Hemos generado una estafa GFP-etiquetados Ngestructura con mutaciones específicas en el CI en el dominio que iba a cambiar la capacidad de Ng a unirse una webcam en una Ca 2 +-dependiente. El estudio de estas mutaciones diferentes nos dio una gran comprensión de los procesos importantes que intervienen en la función sináptica 8,15. Sin embargo, en estos estudios, es esencial para demostrar que las proteínas mutadas se espera que la unión a CaM alterado. A continuación, presentamos un método para probar la capacidad de las proteínas que se unen a CAM en la presencia o ausencia de Ca 2 +, con CaMKII y Ng como ejemplos. Este método es una forma de cromatografía de afinidad a que se refiere como una cámara desplegable ensayo. Utiliza CAM-Sepharosa cuentas para poner a prueba las proteínas que se unen a la leva y la influencia de Ca 2 + en este enlace. Es un tiempo considerablemente más eficiente y requiere menos proteína en relación con la cromatografía de columna y otros ensayos. En conjunto, esto proporciona una valiosa herramienta para explorar Ca 2 + / CAM y señalización de las proteínas que, encontrarrestar con la CAM.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulina (CaM) pull-down de ensayo es una forma efectiva para investigar la interacción de la CAM con varias proteínas. Este método utiliza CAM-sepharose bolas para el análisis eficiente y específica de la CAM-proteínas de unión. Esta es una importante herramienta para explorar la señalización CAM en la función celular.

Desplegable de proteínas de unión a calmodulina

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K vistas.  Medical College of Wisconsin. Calmodulina (CaM) pull-down de ensayo es una forma efectiva para investigar la interacción de la CAM con varias proteínas. Este método utiliza CAM-sepharose bolas para el análisis eficiente y específica de la CAM-proteínas de unión. Esta es una importante herramienta para explorar la señalización CAM en la función celular.

Video: Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separación electroforética de las proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Investigación

Biología

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Tinción de proteínas en geles de

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).