Damos las gracias a Liu Xia (Regeneron Pharmaceuticals) para inicialmente nos enseña la técnica de DAG y el Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) por su orientación continua en diversos aspectos de la tecnología. Este trabajo fue financiado por el Hunter College, CUNY puesta en marcha de fondos y adjudicación NSF Pan IOS-1249166. Damos las gracias a la subvención de apoyo NYULMC Histopatología Core NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 para la histología en el hígado del ratón.

Todos los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Hunter College Institutional Animal Care y Uso de la City University de Nueva York. 1. Preparación de ADN de plásmido libre de endotoxinas <ol><li> Elige una sola colonia de bacterias que contienen el gen de interés en un vector de expresión de mamífero a partir de una placa selectiva recién rayada. </li><li> Siga las recomendaciones que se encuentran en el manual de un kit disponible en el mercado de purificación de plásmido libre de endotoxina para el cultivo y la cosecha de las bacterias. </li><li> Se purifica el plásmido de ADN libre de endotoxina a partir de células bacterianas siguiendo el protocolo de un kit de purificación de plásmido libre de endotoxina comercialmente disponible. </li><li> Utilice artículos de plástico libre de endotoxinas y manejar ADN con cuidado para garantizar que la endotoxina no se vuelve a introducir en la muestra de ADN después de la etapa de eliminación. </li><li> Medir la concentración de ADN de plásmido libre de endotoxinas mediante la determinación de su absorbancia a 260 nm utilizando un MICRespectrofotómetro o-volumen de UV como se describe a continuación o un estándar, basado en la cubeta de espectrofotómetro. <ol><li> Limpiar las superficies ópticas inferior y superior del sistema de retención de la muestra espectrofotómetro micro de la siguiente manera. Pipetear 1 l de agua desionizada limpia en el sistema óptico más bajo. Cierre el brazo de palanca y toque un par de veces para bañar al sistema óptico superior, entonces la palanca de apertura y limpie con un pañuelo de papel. </li><li> Abra el software del espectrofotómetro micro y seleccionar el módulo de ácidos nucleicos. </li><li> Coloque 1 l de agua desionizada limpia en el sistema óptico inferior, baje el brazo de palanca y seleccione &quot;initialize&quot; en el software del programa. Una vez que la inicialización es superficies completas, limpias, tanto ópticos con un pañuelo de papel .. </li><li> Realizar la medición en blanco mediante la carga de 1 l de-endotoxina libre de tampón TE (10 mM de Tris-Cl, pH 8,0; EDTA 1 mM) y seleccionando &quot;en blanco&quot; desde el software de programa. Una vez que la medición se realiza en blanco, limpie las superficies ópticas con un tantotejido. </li><li> Lleve a cabo la medición de la muestra mediante la carga de 1 l de muestra de ADN libre de endotoxinas y seleccionando &quot;medida&quot; en el software del programa. Se registrará la concentración de ADN. Evaluar la pureza del ADN mediante el registro de la relación de absorbancia 260/280 nm que aparece en la pantalla. Dado que el uso de ADN puro (260/280 proporción de 1,8) para DAG es muy deseable, evitar el uso de una muestra de ADN con una relación de 260/280 por debajo de 1,7. Una vez que la medición se hace, limpie ambas superficies ópticas con un pañuelo de papel. </li></ol></li></ol> 2. Con un peso de los ratones <ol><li> Marcar los ratones de una manera apropiada para la cepa. Nota: el marcado de la cola, no se recomienda para este procedimiento. <ol><li> Especies ratón Marcar que tienen la piel blanca (por ejemplo, Suiza Webster) en la espalda con un marcador negro. Vuelva a aplicar marcas en el tiempo que sea necesario. </li><li> Especies Marcos ratón que tienen pelaje negro (por ejemplo C57BL / 6) por el oído perforación de varios días de antelación. </li></ol></li><li> Pesar individua ratoneslly colocando suavemente en una sartén pesada de animales o un cubo colocado en una balanza de laboratorio digital. Registrar el peso de cada ratón utilizado en el experimento, en el día del experimento. </li></ol> 3. Preparación de jeringas <ol><li> Preparación de la mezcla de inyección <ol><li> Calcular la cantidad de ADN necesaria asumiendo 5-50 g de ADN de plásmido libre de endotoxinas para la inyección de cada ratón. <ol><li> Determinar la cantidad óptima de ADN de plásmido experimentalmente. </li><li> Al determinar la cantidad de ADN necesario, asumir la inyección de un ratón adicional por grupo, como la carga adecuada de las jeringas requerirá cierta mezcla de inyección extra. Para ayudar a los cálculos, considere el siguiente ejemplo: inyectar 4 ratones experimentales y 4 de control, cada una pesa 25 g, con 50 microgramos de ADN plásmido por ratón. Para determinar la cantidad de ADN necesaria en este caso, calcular con 5 ratones por grupo: 5 x 50 g = 250 g de ADN necesaria para cada grupo. </li></ol></li><li> Determinar la cantidad de solución salina (cloruro de sodio 0,9%) necesaria asumiendo 10% de peso corporal para la inyección de cada ratón. <ol><li> De acuerdo con el ejemplo anterior, inyectar cada 25 g de ratón con 50 g de ADN plasmídico en 2,5 ml de solución salina (2,5 g de líquido). </li><li> Cuando la determinación de la cantidad de solución salina necesaria para todo un grupo de ratones, asumir la inyección de un ratón adicional por grupo para permitir la carga apropiada de las jeringas. Considerando el experimento dado, calcular la cantidad de solución salina necesaria para 5 ratones en cada grupo: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml de solución salina para cada grupo (o 25 ml en total). Nota: Si los ratones de un mismo grupo no son el mismo peso (diferencia de más de 10% en el peso corporal), preparar la inyección se mezcla por separado. </li></ol></li><li> Utilice solución salina sin conservantes y sin endotoxina, estéril, que ha sido aprobado para uso humano, en 10 ml, viales de múltiples usos. </li><li> Usando una aguja de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm) unido a una punta de cierre luer de una jeringa de 20 ml,retirar el líquido de los viales de solución salina y vaciar las jeringas en un tubo cónico de 50 ml. Para ayudar a pipeteado preciso de solución salina durante la preparación de las mezclas de inyección de ADN solución salina, solución salina recoger más de lo necesario para la inyección de todos los ratones en el experimento. Para el experimento anterior, retirar la solución salina de 3, 10 ml viales (un total de aproximadamente 30 ml), incluso si la cantidad calculada de solución salina necesaria para el experimento es de sólo 25 ml. </li><li> Pipetear la cantidad calculada de ADN en un tubo cónico de 50 ml diferente. Tenga cuidado de no tocar el lado del tubo con el cuerpo de la pipeta para evitar la introducción de la endotoxina. De acuerdo con el ejemplo, pipetear 250 g de control y 250 g de plásmido de ADN experimental en tubos cónicos separados. </li><li> Añadir la cantidad requerida de solución salina para el ADN usando una pipeta serológica. Considerando el experimento de la muestra, pipeta 12,5 ml de solución salina a cada una de las mezclas de reacción (experimental y de control). </li><li> Permitir que todas las soluciones para llegar atemperatura ambiente antes de la inyección. </li></ol></li><li> Preparación de las jeringas <ol><li> Para cada ratón, llenar una, 3 ml, jeringa luer-lock estéril con la mezcla de ADN-solución salina usando una aguja estéril de calibre 20-(0,9 mm x 25 mm). Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire. Evitar el uso de jeringas de mayor volumen como la velocidad de flujo de inyección no se puede controlar muy bien, y es difícil de manipular jeringas más grandes en una mano. Expulsar el exceso de cualquier mezcla de ADN-salina en el tubo cónico, ya que puede ser reutilizado. </li><li> Cambie la aguja para una aguja de calibre 27 estéril. Llenar la aguja con el líquido por completo sin introducir burbujas de aire. Ajustar el volumen de la mezcla de ADN-solución salina tal como se calcula en base al peso del ratón. </li><li> No permita que la aguja no tapada toque ninguna superficie no estéril. Si es necesario, las agujas pueden volver a tope con la técnica de una sola mano: coloque la tapa en una superficie plana, inserte la aguja sin agarrarse de la tapa con la otra mano y presione la aguja tapadacontra un objeto firme para asegurar la tapa sobre la aguja. Las jeringas están ahora listos para inyecciones de cola-vena. </li></ol></li></ol> 4. Entrega de ADN hidrodinámica <ol><li> Tenga en cuenta que los ratones anestésicos pueden reducir la viabilidad. Evite realizar DAG en una habitación que es demasiado frío, ya que esto también reducirá la viabilidad. Si la habitación tiene una temperatura ambiente de 20 ° C o si se utiliza anestesia, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica a 37 ° C después del procedimiento para evitar la pérdida de los animales. Si se utiliza anestesia, asegúrese de que la boca y hocico del ratón mientras están sin obstáculos en la pista de calor y observar el ratón hasta que se recupere por completo. No retener el alimento o el agua de los ratones antes de la DAG. </li><li> Calentar los ratones para dilatar los vasos sanguíneos. <ol><li> Coloque la jaula del ratón (con ropa de cama incluida) en una almohadilla de calor durante 5 minutos para que la temperatura de la ropa de cama es de aproximadamente 38 a 39 ° C. La temperatura debe ser suficientemente baja para mantener a los ratones en la almohadilla de calor para unperíodo extendido. </li><li> Como alternativa, coloque el ratón en una inmovilización acceso dorsal con moderación mínima. Se calienta la cola del ratón durante 1 min suavemente sujetándolo con un trozo de gasa humedecida en agua tibia. Permitir ratón para volver a la posición, si es necesario. Limpie la cola con un pañuelo de papel para secarse. </li><li> Alternativamente, ratón caliente mediante la colocación de la jaula bajo una lámpara de calor durante no más de 2 min. Si se utiliza una lámpara de calor, tenga cuidado para evitar el sobrecalentamiento del ratón. </li></ol></li><li> A gran volumen de inyección en la vena de la cola <ol><li> Inmovilizar un acceso restrainer dorsal sobre una superficie plana con cinta de laboratorio. </li><li> La celebración por la cola, coloque el ratón suavemente en la inmovilización e inserte el conector. Utilizar la menor restricción como sea necesario para mantener la cola inmovilizada. Asegúrese de que el ratón está respirando libremente. </li><li> Si el ratón está en peligro grave en cualquier momento durante el procedimiento, retire el ratón desde la inmovilización de inmediato y deje reposar. </li><li> Pasa el raton por louna de las venas caudales lateral es visible. Localice las venas caudales laterales mirando hacia abajo en la parte posterior del ratón: la línea roja que se ejecuta en el medio de la cola es una arteria, mientras que las líneas azules en ambos lados de la cola son las venas caudales laterales. </li><li> Limpie la cola del ratón con una toallita de alcohol. </li><li> Con la mano que no se inyectan, sostenga la cola con fuerza entre los dedos índice y medio para que la cola pasa por debajo del dedo índice, más de la mitad y la tercera los dedos y debajo del dedo meñique. Deje que el dedo pulgar se mantenga libre de moverse. (Figura 1A) </li><li> Con la otra mano, limpie el área a inyectar de nuevo con un algodón empapado en alcohol. Permita que el área se seque. </li><li> Tome la jeringa cargada con la inyección a mano y sujételo por barril entre el pulgar y los otros cuatro dígitos. No retener el émbolo. </li><li> Coloque la jeringa paralela a la cola con la aguja apuntando hacia el cuerpo del ratón yel bisel (borde oblicuo) de la aguja hacia arriba. </li><li> Inserte la aguja en la vena de la cola. Proceder con la inyección sólo si la vena está situado correctamente, lo que es evidente a partir de la aguja deslizante en sin resistencia. Tenga en cuenta que la profundidad de inserción de la aguja es una cuestión de preferencia personal, sin embargo, la inserción completa no se recomienda debido a un aumento del riesgo de corte de la vena. Evitar mover la aguja. </li><li> Usando el dedo pulgar de la mano de la cola de retención, cierre en el cubo de la aguja y presione buje contra la cola para mantener la aguja en su posición. No aplique una presión extrema y no te detengas en el eje de la aguja, ya que impide el flujo de líquido en la vena. Sostenga la cola con el dedo índice ligeramente en este punto a fin de no obstaculizar la inyección (Figura 1A). </li><li> Vuelva a colocar la mano jeringa sosteniendo de manera que el dedo índice y el dedo medio se están aferrando a la brida y el pulgar está en el extremo del émbolo (Figure 1A). </li><li> Presione hacia abajo el émbolo en un movimiento continuo e inyectar el volumen total de líquido en 6-8 segundos. </li><li> Retire la aguja de la vena y detener la hemorragia aplicando presión suave en la cola con un pañuelo de papel. </li><li> Retire del ratón de la inmovilización y el lugar del ratón en una jaula de recuperación colocado encima de una almohadilla eléctrica (ropa de cama debe ser de 37-38 ° C). Si la sala de inyección es frío, este paso es fundamental para la supervivencia de los ratones. Apóyese en la cola del ratón hasta que el sangrado se detiene por completo. </li><li> Observar el ratón durante 1 hora después de la entrega de ADN hidrodinámico. Un período inicial de jadeos y la inmovilidad es normal debido a la arritmia temporal causada por DAG, pero asegúrese de que el ratón muestra señales de recuperación en aproximadamente 5 min. Si la respiración del ratón llega a estar muy bajo, masajear suavemente el abdomen del ratón para facilitar la respiración. Tenga en cuenta que la tasa de recuperación puede ser un poco influenciado por la cepa de ratón utilizada. </li><li> Ratón Retornoenjaular a la vivienda y garantizar que el ratón tiene un abundante suministro de alimentos y agua. </li></ol></li><li> A gran volumen de inyección en la vena de la cola usando una posición alternativa mano <ol><li> Coloque ratón en la inmovilización y prepararse para la inyección siguiendo los pasos 4.3.1 a través de 4.3.5, tal como se describe anteriormente. </li><li> Descanse la mano que no se inyectan en una superficie plana con cuatro dedos doblados en un ángulo de noventa grados. Los dedos (excepto el pulgar) todos deben descansar en la parte superior de uno al otro, la creación de una plataforma. Sostenga la cola del ratón entre el pulgar y el dedo que señala (fig. 1B). </li><li> Con la otra mano, limpie el área a inyectar de nuevo con un algodón empapado en alcohol. Permita que el área se seque. </li><li> Coge jeringa con la inyección a mano y mantenerla por la brida y el extremo del émbolo, lista para la inyección. </li><li> Complete el procedimiento siguiendo este protocolo desde el paso 4.3.9 al paso 4.3.17, como se describió anteriormente. </li></ol></li></ol>

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R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors.">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li><li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trypanolytic+factor+of+human+serum.">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li><li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum.">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li><li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum.">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li><li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein.">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li><li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosome+lytic+factor,+a+subclass+of+high-density+lipoprotein,+forms+cation-selective+pores+in+membranes.">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li><li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes.">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li><li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model.">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li><li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei.">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li><li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes.">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans.">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li><li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene.">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li><li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver.">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Cuando se realiza correctamente, DAG es un medio muy seguro y eficaz de la prestación de los transgenes. Los pasos críticos para el éxito de DAG son: 1) la entrega de la cantidad correcta de ADN en un gran volumen de vehículo de solución salina 2) en la vena de la cola del ratón 3) en menos de 8 segundos. Aunque el proceso de inyección en sí requiere sin duda alguna destreza manual, el éxito de este seis segundos procedimiento a menudo se encuentra en una cuidadosa preparación del ...

Desde su primera descripción por Liu et al. Y Zhang et al., La entrega de genes hidrodinámico (DAG) se ha convertido en una herramienta muy valiosa para el estudio de la función génica en sistemas de modelos de roedores 1, 2. La técnica consiste en la inyección rápida (5-7 segundos) de un volumen grande (8-12% de peso corporal) de solución en la vena de la cola de los ratones para facilitar la captación de ADN plásmido por las células de órganos diana 1, 2. Estas condiciones conducen a robusto expresión génica en el hígado y menos la expresión de genes en el riñón, bazo, pulmón y corazón. La inyección de 10 mg plásmido pCMV-lacZ puede transfectar tanto como 40% de los hepatocitos, lo que hace HGD el método más eficiente, no viral, en la entrega de genes in vivo hasta la fecha 1. A diferencia de los portadores virales, pDNA es fácil de preparar, no provocar una respuesta inmune en el huésped roedor 3 y que no constituya un riesgo para la salud mediante la recombinación con el extremovirus exógenas. Además, ya que las moléculas de ADN entregadas por DAG no necesitan envasado, este método es adecuado para la entrega de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) tan grandes como 150 kb 4. Otros tipos de moléculas que han sido entregados por un método hidrodinámico incluyen ARN 5-10, morfolinos 11, proteínas de 12, 13 y otras moléculas pequeñas 12, 14. Las ventajas y desventajas de DAG con respecto a otros métodos de entrega se han discutido en las excelentes críticas en la literatura 15-20 y un número de autores han proporcionado una descripción detallada del procedimiento 21-23. La introducción de transgenes en ratones por DAG es seguro y eficaz 1-3, 24 y el método se ha usado en ratas con éxito comparable 25. Con algunas modificaciones, los experimentos de prueba de concepto se han llevado a cabo en pollos 26, rablos bits 27 y 28 cerdos, aunque, la aplicación in vivo de esta técnica en animales más grandes sigue siendo un reto. Cuando se utiliza este método, otra limitación común es que muchos de los vectores de expresión de mamíferos disponibles carecen de los componentes para lograr una, persistente alto nivel de la expresión génica. El uso de un plásmido, la expresión génica pCMV-Luc en los órganos diana es evidente tan pronto como diez minutos después de la DAG, sin embargo, el nivel de expresión inicial, alta cae bruscamente en la primera semana después de la inyección 1. Expresión de los transgenes a largo plazo es posible, dependiendo del promotor y el intrón utilizado en el diseño de plásmido 3, 24 inyecciones sin embargo, el mantenimiento de la expresión génica de alto nivel a menudo requiere repetidas. Por esta razón, HGD puede ser menos adecuado para estudiar enfermedades crónicas que son un resultado de la exposición a largo plazo a las proteínas perjudiciales o productos de la proteína. Con estas limitaciones, DAG es una herramienta excepcionalmente poderosa para el estudio de la popapel potencial de un gen y el efecto de que los mutantes in vivo, así como los efectos terapéuticos y la regulación de proteínas y para el establecimiento de modelos animales de la enfermedad (para una revisión, ver 15). Por ejemplo, HGD puede utilizarse para asignar la función a los dominios y aminoácidos de las proteínas mediante la introducción de forma individual diferentes construcciones de genes en ratones que tienen los respectivos genes noqueado. Además, esta técnica puede ser utilizado en cualquier cepa de ratón. Este protocolo describe HGD en ratones con un enfoque en los aspectos técnicos necesarios para lograr la transfección exitosa: la inserción correcta de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. La aplicación de este método se demostró en un modelo de ratón de la tripanosomiasis africana, una enfermedad mortal de los humanos y el ganado 29 de 30. Aunque varias especies de tripanosomas causan enfermedades en el ganado, la mayoría no puede causar enfermedad en seres humanos debido a los complejos inmunes innatas en blood llamadas factores líticos tripanosoma (Tlfs) 29, 31, 32. Estos, lipoproteínas de alta densidad de formación de poros (HDL) contienen dos proteínas únicas, primates específica:. HPR, el ligando, lo que facilita la absorción de Tlfs en tripanosomas, y apoL-I, el componente lítico 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense es capaz de infectar a los humanos debido a la expresión de una proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) que se une y neutraliza humana apoL-I 34, 39. Baboon TLF no es neutralizada por SRA por su divergente proteína apoL-I 40. Como se informó anteriormente, el uso de un vector de expresión de mamíferos (pRG977), la expresión transgénica de componentes TLF babuino en ratones confiere protección contra los tripanosomas humanos infecciosa 40. Los datos representativos presentados aquí demuestran cómo se puede aplicar la entrega de genes hidrodinámico para estudiar los efectos terapéuticos de una proteína.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Prep Wipe</td>
			<td style="width:113px;">Webcol</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6818</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AST kit, Amplite Colorimetric</td>
			<td style="width:113px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical Tube, 50 ml</td>
			<td style="width:113px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:113px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:113px;">KIMTECH</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse Tail Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MTI RST</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pRG977 (mammalian expression vector)</td>
			<td style="width:113px;">Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">NC9054335</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:167px;">Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice

La expresión eficiente de los transgenes in vivo es de importancia crítica en el estudio de la función génica y el desarrollo de tratamientos para las enfermedades. En los últimos años, la entrega de genes hidrodinámico (DAG) ha emergido como un método sencillo, rápido, seguro y eficaz para la entrega de transgenes en roedores. Esta técnica se basa en la fuerza generada por la inyección rápida de un gran volumen de solución fisiológica para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares de órganos perfundidos y por lo tanto introducir ADN en las células. Una de las principales ventajas de DAG es la capacidad de introducir transgenes en células de mamífero utilizando el ADN plásmido desnudo (pADN). La introducción de un gen exógeno utilizando un plásmido que es mínimamente laborioso, altamente eficiente y, en contra de los transportistas virales, muy segura. DAG se utilizó inicialmente para suministrar genes en ratones, que se utiliza ahora para ofrecer una amplia gama de sustancias, incluyendo oligonucleótidos, cromosomas artificiales, ARN, proteínas y pequeñas moléculas en ratones, ratasy, en un grado limitado, otros animales. Este protocolo describe HGD en ratones y se centra en tres aspectos claves del método que son fundamentales para realizar el procedimiento con éxito: la correcta inserción de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. Se dan ejemplos para mostrar la aplicación de este método para la expresión transitoria de dos genes que codifican proteínas secretadas, primates específica, la apolipoproteína LI (apoL-I) y la proteína relacionada con haptoglobina-(HPR).

La colocación correcta de la aguja en la vena de la cola del ratón (como se ilustra en la Figura 1) es un requisito previo para el éxito la entrega de un transgén por transfección basado hidrodinámica-. A menudo la parte más difícil de la técnica, sin embargo, es la retención de la aguja dentro de la vena de la cola y sin movimiento para que todo el volumen de la inyección puede ser entregado en un plazo de 6-8 s. Los errores menores durante el proceso de inyección pueden resultar en muy red...

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Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

En la transfección in vivo de ADN desnudo por la entrega de genes hidrodinámico introduce genes en el tejido de un animal con una respuesta inflamatoria mínima. Cantidades suficientes de producto génico se generan de tal manera que la función y regulación, así como la estructura y la función de la proteína del gen pueden ser analizados.

Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.3K vistas.  Hunter College, CUNY.  En la transfección in vivo de ADN desnudo por la entrega de genes hidrodinámico introduce genes en el tejido de un animal con una respuesta inflamatoria mínima. Cantidades suficientes de producto génico se generan de tal manera que la función y regulación, así como la estructura y la función de la proteína del gen pueden ser analizados. 

Video: Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.