Nos gustaría agradecer al Dr. Garry Nolan de la Universidad de Stanford para proporcionar la línea celular de empaquetamiento Phoenix GP para la producción de partículas retrovirales. Agradecemos al Dr. Roger Tsien de la Universidad de California en San Diego para proporcionar td tomate. También nos gustaría dar las gracias al Fondo para San Diego de la Universidad Estatal de Citometría de Flujo por su servicio y ayuda.

1. Preparación de células de mamíferos, la producción viral y Transducción de códigos de barras genético <ol><li> Placa de 2,5 x 10 6 células adherentes en una placa de 10 cm (o alrededor de 50-60% de confluencia) un día antes de la transfección en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Para retroviral uso de producción de envases línea celular de elección, como Phoenix-GP (una especie de regalo de Gary Nolan, la Universidad de Stanford). NOTA: La línea celular de empaquetamiento expresa de forma estable las proteínas Gag y Pol para la formación de partículas retrovirales en trans. Hacer que las células estén sanas y adherido a la placa en una monocapa, antes de la transfección. </li><li> 24 horas más tarde, preparar la mezcla de transfección de ADN. <ol><li> Para 125 l de DMEM libre de suero añadir 3 g de la estomatitis vesicular envoltura del virus vector glicoproteína (PCI-VSVG) y 3 g de vector de transferencia que lleva el gen de la proteína fluorescente de interés. Mezclar y añadir 15 l de polietilimina (2 mg / ml). </li><li> Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min y añadir a las células gota a gota. NOTA: polietilimina se añade a la mezcla de ADN homogéneo como reactivo de transfección para la formación de poliplejos. Con el fin de obtener partículas virales que llevan diferentes marcadores de proteínas fluorescentes, realice cada transfección independiente con el marcador de elección. Recuerde que el vector de transferencia retroviral es de alrededor de 7 kb de longitud y no puede ser empaquetado si es superior a 10 kb. </li></ol></li><li> Incubar las placas a 37 ° C. Con el fin de aumentar la producción de placas virales lugar a 30 ° C o 32 ° C en lugar. NOTA: 24 el medio de transfección enviar hr pueden ser reemplazados con 7 ml de medio fresco, y aunque esto puede mejorar la salud de las células que pueden disminuir la carga viral en el sobrenadante. </li><li> Después de la transfección de 48 horas a recoger las partículas virales que contiene sobrenadante y filtrar con un filtro de 0,45 mM politetrafluoroetileno. Utilice sobrenadante viral recién recogida para la transducción. OthDe otro mantener sobrenadante en alícuotas a -80 ° C y evitar la congelación-descongelación. Recuerde que el título viral disminuirá probablemente hasta un 50% con cada ciclo de congelación-descongelación. </li><li> Línea celular Placa de elección 24 horas antes de la transducción si adherente, o inmediatamente antes de la transducción si no adherente. Semillas 2,0 x 10 5 a 3,0 x 10 5 células adherentes (aquí Eh 7.5.1 y HEK 293T) o 5.0 x 10 5 a 1 x 10 6 células no adherentes (aquí SupT1) por pocillo en una placa de 6 pocillos. NOTA: Asegúrese de calibrar el número de células que se sembró antes de la transducción, especialmente para las células adherentes, por lo que las células alcanzan una confluencia del 60% en el momento de la transducción. </li><li> Añadir 5 g / ml polibreno (bromuro de hexadimethrene) a las células sembradas y luego añadir sobrenadante viral recogido previamente para obtener alrededor de 20-40% de infección (en este caso 2 ml). NOTA: El MOI o porcentaje de infección es principalmente arbitraria, como la clasificación permitirá amplificar cualquier subpopulation de las células. Obviamente, una mayor tasa de infección facilita y acelera el proceso de amplificación. </li><li> Transducir células por centrifugación en un rotor de cubo colgante en 1500 xg durante 120 min a 32 ° C. Resuspender las células no adherentes con medio fresco antes de la incubación. Para células adherentes, reemplazar con fresco medios 24 horas después de la transducción. NOTA: Se recomienda sellar las placas antes de la centrifugación con parafilm para evitar que se derrame más. Para aumentar la diversidad de células genéticamente con código de barras, transducir las células con partículas virales que llevan diferentes proteínas fluorescentes (obtenidas de la etapa 1.4). Al elegir los marcadores fluorescentes, asegúrese de que son compatibles con la instrumentación y tienen parámetros fluorescentes distinguibles. </li></ol> 2. Selección y Amplificación de células genéticamente con código de barras <ol><li> Analice las células de mamíferos transducidas por citometría de flujo, al menos, 72 h después de transducción para cuantificar el porcentaje de transducción. Utilice una línea de células no transducidas comparable como control negativo. NOTA: Como clasificación se utiliza para purificar poblaciones celulares con códigos de barras individuales, un alto porcentaje de transducción inicial, aunque no es necesario, debe acelerar el proceso de amplificación. </li><li> Utilizar la célula clasificador de elección para obtener las células que expresan la proteína de interés. <ol><li> Para ello, asegúrese de que las puertas se han establecido correctamente en los canales adecuados. <ol><li> Para ello utilice la misma línea celular ingenuo como control negativo y ajustar la tensión parámetro / canal para que el negativo de la población está por debajo del valor de 10 3 en cada eje fluorescente. Determinar gating para fluorescencia positiva como eventos que aparecen por encima de la del control negativo para cada canal fluorescente. </li></ol></li><li> Tenga en cuenta que cada instrumento puede variar y el voltaje correcto para determinar compuerta debe ajustarse en consecuencia, por lo que los controles positivos y negativos imperativas en cada expconfiguración erimental. <ol><li> Para la detección de fluorescencia en este montaje experimental utilizar el canal FITC (filtro de paso de banda 530/30 procedió por un filtro de paso 502 de largo) para EGFP, el canal de PE (filtro de paso de banda 585/42 procedió por un filtro 556 pase) para td Tomate , y el canal de APC (filtro de paso de banda 660/20) para E2 Crimson. NOTA: El láser de 488 nm excita eGFP y td tomate mientras E2 Carmesí es excitado por el láser de 633 nm. </li></ol></li></ol></li><li> Ordenar en tubos de 15 ml cónicos con 1 ml de 100% de FCS. NOTA: El proceso de clasificación de las poblaciones de células fluorescentes no es obligatorio, según se puede proceder directamente con la especie de clones individuales (véase más adelante). Ordenando las poblaciones ajustados basados ​​en fluorescencia elegido asegura una población de copia de seguridad para la futura selección de clones individuales. Tenga en cuenta que las células individuales son a veces difíciles de cultivar, mientras que una gran población de células puede ser fácilmente congelado, y luego descongelado y se amplifica en una etapa posterior. </li><li> Spen bajar las poblaciones clasificadas en un rotor centrífugo cubo colgado en 524 g en 32 ° C durante 5 min para sedimentar las células. Vuelva a suspender en 1 ml de medio fresco, y volver a la placa de células de modo que la confluencia de células es inferior al 60% para permitir el crecimiento y la división durante al menos dos días. <ol><li> Por ejemplo, las células adherentes placa a alrededor de 3 x 10 5 células en 2 ml de medio por pocillo en una placa de 6 pocillos y 2 x 10 6 células en 2 ml de medio en una placa de 6 cm. Utilice DMEM para las células adherentes y RPMI para las células no adherentes (o cualquier medio especificado si se requiere). Coloque células sembradas en una incubadora a 37 ° C durante varios días para permitir la amplificación. </li></ol></li></ol> 3. Obtener clonales poblaciones de células genéticamente con código de barras en diferentes intensidades <ol><li> Obtener poblaciones clonales de células transducidas originalmente (paso 1.7) o de la población ordenada (paso 2.3). NOTA: Esto asegurará nivel igual o similar de expresión de la proteína fluorescente entre todos la células dentro de la población (una población apretado con una pequeña CV en la intensidad de fluorescencia media de hasta 40%). <ol><li> Para ello, las células tipo individuales en placas de 96 pocillos con una unidad de deposición de células automatizado (ACDU). Establecer puertas para la clasificación de acuerdo con la población de interés. Asegurar puertas se establecen al menos un registro escala aparte para obtener poblaciones distinguibles al elegir las células en diferentes intensidades fluorescentes. Para el procedimiento que se muestra aquí, utilizar la misma citometría de flujo experimental establecido como el descrito en el paso 2.2. </li></ol></li><li> Amplificar clones individuales en una incubadora a 37 ° C durante al menos 2 semanas. A través del proceso de amplificación analizar las células bajo el microscopio para asegurar que las poblaciones en crecimiento originan en las células individuales y no de más de uno. NOTA: Recuerde que el clasificador colocará una célula por pocillo en promedio, y mientras algunos pozos pueden no tener ninguna célula en absoluto, otros pueden tener más de uno. <ol><li> Para asegurar que una población surge de una célula única, extremadamente suave con la placa y nunca molestar a los pozos con la pipeta. Observar la placa, así por así, bajo el microscopio. NOTA: Mientras que las células individuales pueden ser difíciles de identificar, una vez que comience a dividirse serán fácilmente reconocibles a veces. </li><li> Tenga en cuenta que a menudo las células &#39;mata&#39; a lo largo de los bordes. Deseche los pozos donde se pueden observar múltiples poblaciones clonales y mantener los que tienen una población ajustada. NOTA: Es recomendable transferir aquellos en los platos más grandes para la amplificación. </li></ol></li><li> Se tamizan los poblaciones clonales putativos mediante el análisis de ellos por citometría de flujo. Comparación de ellos con un control negativo utilizando la misma configuración experimental citometría de flujo. <ol><li> Analizar sólo un porcentaje de la muestra y mantener el resto como reserva. Elija las poblaciones más claramente separados basados ​​en la intensidad media y opresión de la población. Amplificar según sea necesario o congelar las existencias enmedio de congelación con 20% de glicerol a -80 ° C durante períodos cortos de tiempo o nitrógeno líquido durante más tiempo. NOTA: Recuerde que una &quot;verdadera&quot; población clonal debe tener un patrón de fluorescencia muy apretado. </li></ol></li></ol> 4. Asegúrese de Capacidades de multiplexación para selección de alto rendimiento (HTS) <ol><li> Combinar tantos poblaciones clonales distintas según sea necesario que puede ser utilizado adicionalmente en un formato multiplexado. Elige clones con la absorción / espectros de emisión distinguible y / o diferentes intensidades. Si se utiliza un formato de placa de 96 pocillos, que es adecuado para HTS, semilla de 50.000 células en 200 l por pocillo. NOTA: Tenga en cuenta que el número de células es sólo una estimación y puede cambiar en función del tipo de célula y si es adherente o no. </li><li> Analizar la muestra utilizando citometría de flujo para garantizar que cada una de las líneas de células fluorescentes establecidas independientes se pueden distinguir unos de otros. Antes de preparar el análisis negativoy los controles de un solo color para ajustar los parámetros y los valores de compensación. NOTA: Ajuste de los parámetros para distinguir claramente las poblaciones mixtas les permita ser utilizada además en un formato multiplexado. </li></ol> 5. Adaptar líneas celulares genéticamente con código de barras a la aplicación biológica de Elección <ol><li> Transducir líneas celulares establecidas con códigos de barras genéticamente con partículas virales que contienen los elementos de ensayo de elección, como se describe aquí en Stolp et al., 2013 59. Recuerde que el ensayo de elección debe ocupar un canal fluorescente adicional y distinguibles y por lo tanto se va a transferir a la línea celular con código de barras apropiado. NOTA: Cada línea celular con código de barras puede soportar un ensayo diferente. </li><li> Células con código de barras Ordenar genéticamente fluorescentes para aquellos que contienen elementos de ensayo. NOTA: elementos de ensayo pueden ser diseñados junto a una etiqueta o proteína fluorescente (como una fusión o a través de un sitio interno de entrada al ribosoma) fo detección directa a través de Western Blot, citometría de flujo o microscopía. El sistema utilizado en este protocolo se basa en la expresión de superficie HA epítopo solo, o con la expresión epítopo FLAG adicional. <ol><li> Manchar las poblaciones clonales que contienen el ensayo con anticuerpos acoplados HA y APC con fluorescencia. Luego de analizar las poblaciones clonales con anti-FLAG y la tinción de anticuerpos conjugados con FITC. </li><li> Para rastrear el ensayo, analizar o &quot;descifrar&quot; las poblaciones en el canal adecuado, donde las líneas de células genéticamente distintas con códigos de barras se pueden distinguir. Aquí, decodificar la naturaleza del sustrato mediante el análisis en el canal de PE para la detección de tomate td. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí dos procedimientos bien establecidos se han combinado; la ingeniería genética a través de la tecnología retroviral y la detección de proteínas fluorescentes utilizando citometría de flujo. Los códigos de barras genético basado en una proteína fluorescente para la producción de líneas celulares únicos proporciona una manera simple y robusta para aplicaciones multiplexados. La generación de células con código de barras de ingeniería genética a través de la tecnología retroviral, es un principio d...

Tecnologías como la espectroscopia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, todos se basan en la fluorescencia, una propiedad ampliamente explotado en aplicaciones bioquímicas, biomédicas y químicas. Fluorescencia, ya sea intrínseco o mediante el etiquetado, se ha explotado para el análisis de patrones de expresión de la proteína y perfiles, el destino celular, interacciones de proteínas y funciones biológicas 1-9, y por medio de la fluorescencia / Förster de transferencia de energía de resonancia para la detección de interacciones de biomoléculas y los cambios conformacionales 10-13. Desde el aislamiento de la proteína fluorescente verde victoria Aequorea (GFP) 14, el descubrimiento de que ocurren naturalmente proteínas fluorescentes adicionales de otros cnidarios, en particular los corales, ha aumentado en gran medida el número de proteínas fluorescentes distinguibles existentes con espectros de excitación / emisión. Estos, junto con la introducción de mutaciones en sus genes 15-19, have amplió aún más las posibilidades, la obtención de una verdadera paleta de proteínas fluorescentes disponibles para los científicos que explotan la microscopía, citometría de flujo y otras tecnologías basadas en fluorescencia para su investigación. En paralelo, aunque de forma independiente, el desarrollo de la tecnología retroviral ha facilitado drásticamente la expresión estable de la información genética en células de mamíferos ectópico 20-23. Por lo tanto, no es sorprendente que esta tecnología ha sido utilizada para transferir genes de proteínas fluorescentes en un amplio número de tipos de células y tejidos 24-28 o para la producción de animales transgénicos 29-31. Después de la naturaleza de los retrovirus, la información genética de la proteína fluorescente ectópico se introduce dentro del genoma de la célula 32 y la célula se vuelve fluorescente `para ever&#39;. Esta propiedad ha permitido el seguimiento del destino de las células, o de una sola célula dentro de una población de células. La célula ahora fluorescente tiene así adquiel rojo su propio biofirma y puede definirse como códigos de barras. Su biofirma único identifica de otras células, y esto es importante, lo distingue de células manipuladas genéticamente para expresar diferentes proteínas fluorescentes distinguibles con espectros de absorción / emisión. Las aplicaciones biológicas, tales como el seguimiento de los factores de reprogramación hacia la pluripotencia 33, el análisis de los factores subnuclear para el esclarecimiento de localización nucleolar 34, la construcción de plásmidos indicadores fluorescentes para estudios transcripcionales 35 o el etiquetado genética de las neuronas para el estudio de arquitectura de red neuronal 36 , son sólo cuatro ejemplos de los muchos que han explotado diferentes genes de proteínas fluorescentes para la misma configuración experimental. La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para el análisis de los procesos biológicos a nivel de células individuales, tales como la expresión génica, el ciclo celular, la apoptosis y la señalización a través de fosforiloación 37-43 .La expresión estable de los genes de proteínas fluorescentes en células de mamífero ha mejorado aún más la utilidad de la citometría de flujo para el análisis celular 38,44 y las interacciones ligando-receptor 45. Reforzar la capacidad han permitido que la citometría de flujo para convertirse en una metodología ampliamente utilizada para alto rendimiento y alto contenido de cribado 46. A pesar del número ahora ampliada de fluorómetros y robótica tecnologías que pueden sistemas de lectura de placas pareja, imágenes y citometría de flujo, parece que hay una falta en el diseño experimental que puede explotar y adaptarse a estas capacidades tecnológicas mejoradas. Metodologías basadas en células rápidas, confiables, simples y robustas están drásticamente necesarios para aplicaciones multiplexados que mejoran aún más la capacidad de alto rendimiento. Esto es especialmente cierto en el campo del descubrimiento de fármacos en ensayos basados ​​en células de ingeniería en un formato multiplexado pueden mejorar el poder de cribado de alto rendimiento 39,47-50 </sup&gt;. Multiplexación, ya que permite analizar simultáneamente en una muestra, mejora aún más las capacidades de alto rendimiento 51-54. Los códigos de barras genético fluorescente no sólo permite la multiplexación elegante, sino también, una vez diseñada, evita la necesidad de protocolos que consumen tiempo, reduce los costes acompañados con anticuerpos, los granos y las manchas 39,52,55, y puede reducir el número de pantallas de alta requeridas para aplicaciones de rendimiento. Recientemente hemos descrito cómo la tecnología puede mejorar retroviral multiplexación mediante código de barras genético fluorescente para aplicaciones biológicas, mediante la expresión de un ensayo desarrollado previamente para controlar el VIH-1 actividad de la proteasa 56,57 con diferentes variantes clínicamente prevalentes 58. La metodología se explica de una manera más descriptiva se centra en la forma de seleccionar y amplificar las células genéticamente con código de barras fluorescentes y cómo producir paneles de poblaciones clonales que expresan proteínas fluorescentes distintas y / o diferente intensit fluorescenciaies. Los paneles de las poblaciones de células diferenciadas en función de sus características fluorescentes mejorar las capacidades multiplexados, que pueden ser más explotado en combinación con ensayos basados ​​en células que abordan diferentes cuestiones biológicas. El protocolo también se describe cómo diseñar un grupo de células con código de barras que llevan uno de los ensayos basados ​​en células previamente desarrollados en el laboratorio, como ejemplo 59. Este protocolo lo tanto, no se pretende mostrar la tecnología bien establecida retroviral / lentiviral para la transferencia genética, el valor de las proteínas fluorescentes o las aplicaciones de la citometría de flujo 60,48 sino más bien para mostrar el poder de la mejora de la combinación de los tres para aplicaciones multiplexados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Multiplexing fluorescente barcoded genéticamente células con el propósito de aplicaciones biológicas sólo puede lograrse una vez que se han generado poblaciones clonales individuales. Multiplexación es más efectiva cuando las poblaciones con códigos de barras tienen características fluorescentes distintas claras con solapamiento espectral mínima. El ejemplo mostrado en la Figura 1 con poblaciones clonales de células de mamíferos SupT1 ilustra que las células con códigos de barras con mCher...

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Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.2K vistas.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

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Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Investigación

Biología

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Los estudios genéticos de proteínas humanas de reparación del ADN utilizando la levadura como un sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Sistema de célula cerrada Cultura protocolo mediante buques HyperStack con la tecnología de materiales permeables al gas

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absoluta Quantum medición del rendimiento de las muestras de polvo

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.