Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio y el laboratorio de Mari Godenschwege, en particular, Yonezawa Aline, por los comentarios y ayuda con este protocolo. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de subvención R21NS06637 de FM y TAG, AB fue financiado por el número de la National Science premio de la Fundación 082925, MUR: Biología Integrativa para futuros investigadores.

1. Electrofisiología Rig Set-up <ol><li> El equipo requerido para el equipo de perforación electrofisiología configuración se describe en detalle por Augustin et al. en este Diario 14. Por favor, consulte este artículo para obtener una explicación detallada de los aparatos electrofisiológicos necesarios. </li><li> Modificar el equipo de electrofisiología se ha descrito anteriormente puesta a punto 14 mediante la adición de un micromanipulador sexto, que ocupa la nanoinjector. Para facilitar el acceso a la cabeza del animal que debe ser colocado entre los dos electrodos estimulantes micromanipuladores como se muestra en la Figura 2. </li><li> Antes de comenzar el experimento, asegúrese de que tiene un rango confortable en todos los ejes de rotación con todos los micromanipulador, y que todos los electrodos, así como la micropipeta de inyección (ver paso 2) puede alcanzar el animal. </li></ol> 2. Nanoinjection Set-up <ol><li> El nanoinjection puesta en marcha requiere un Nanoliter2000 (World Precisisobre los instrumentos, Sarasota, FL, EE.UU.) o de tipo similar de inyección que permite inyecciones controladas en cantidades nanolitros. </li><li> Preparar aguja de inyección utilizando las micropipetas de vidrio se suministran con el inyector tirando de ellos a una resistencia de 80-100 mW con un extractor de electrodo. </li><li> Para las inyecciones suaves que se requiere para biselar las micropipetas a una apertura 11-17 m con un ángulo de 45 grados (Figura 3). </li><li> Poco a poco rellenar la micropipeta de inyección de aceite sintético con una jeringa Hamilton con las instrucciones del manual de Nanoliter2000, asegurando que no queden burbujas de aire. </li><li> Con cuidado, garantizar la micropipeta en el nanoinjector y prepararla para cargar el compuesto por vaciar el exceso de aceite según las instrucciones del manual de Nanoliter2000. </li><li> Coloque el inyector en el micromanipulador y cargar el compuesto tal como se indica en el manual de Nanoliter2000. Asegúrese de que la punta de la micropipeta no se rompe durante esteprocedimiento. </li><li> Establecer la cantidad deseada de nanolitros a ser inyectados en la caja de control del inyector según las instrucciones del manual de Nanoliter2000. Tenga en cuenta que la inyección de la cantidad total no debe superar los 100 nl. Hemos encontrado que las grandes cantidades de soluciones de control de solución salina puede afectar a la función del circuito de EFP. </li><li> Es crítico para que el inyector desconectado de la caja de control durante la adquisición de grabación con la excepción de la inyección en sí, ya que la fuente de alimentación de la nanoinjector interfiere con las grabaciones, lo que es visible como el ruido de fondo (Figura 4). Sin embargo, no desconecte la fuente de alimentación a la caja de control, ya que volver a configurar. </li></ol> 3. Drosophila melanogaster Preparación <ol><li> Anestesie de 2 a 6 días de edad moscas con CO 2 o en el hielo a lo descrito previamente 14,15. </li><li> Una vez inmóvil, utilizar un par de pinzas para transferir al animal a una red Wi plato pequeñoª cera blanda dental por recogerlo en sus piernas. Tenga en cuenta que una mosca de la fruta macho pesa alrededor de 1,0 mg y una mosca de la fruta hembra pesa alrededor de 1,2 mg, por lo tanto compuesto de-a-peso relación es diferente en las moscas macho en comparación con las mujeres. Por lo tanto, se recomienda utilizar sólo un género para los experimentos. </li><li> Como se ha descrito previamente 14,15, cuidadosamente montar la parte dorsal mosca y asegurarse de que el tórax y la cabeza se inmovilizan con cera blanda dental colocado alrededor del cuerpo. Con cuidado, extender las alas de manera que ponen perpendicular al tórax (fig. 2, C). La mosca debe ser montado con el menor daño posible. </li></ol> 4. Nanoinjection emparejado / electrofisiología <ol><li> Coloque la marcha montados en la plataforma de electrofisiología con la cabeza hacia los electrodos de estimulación. </li><li> Empalar el animal con el estimulante correspondiente suelo, y electrodos de registro como se ha descrito previamente 14,15 (Figura 2, C). A menos que se lo desea, coloque un electrodo en la grabación de DLM y el otro en el músculo TTM. El músculo DLM está situado en el tórax entre las anteriores dorso-centrales pelos y la línea media de la mosca. El músculo TTM se encuentra cerca de los accesorios de las alas, entre los anteriores y posteriores Supra-Alar pelos de la mosca de la 7. </li><li> Alinear la micropipeta inyectable que contiene el compuesto con el centro de la ocelos tres situado en la porción media posterior de la cabeza, pero no se inyecte todavía (Figura 2, C). </li><li> Antes de la inyección compuesto de obtener un registro al inicio del GF de TTM y GF de DLM vías del sistema de fibra gigante (EFP, Figura 1) a través de la estimulación cerebral. Para ello, activar las fibras gigantes (GFS), con 10 trenes de 10 estímulos (40-50 mV) cada una y durante un tiempo de 0,03 ms a 100 Hz con un retraso de 1 segundo entre las 14,15 trenes (Figura 4). De tipo salvaje vuela shOuld ser capaz de seguir uno a uno en este tipo de estimulación tanto para DLM y las vías de TTM. Deseche la marcha si el GF GF DLM y de las vías de TTM no siguen la estimulación de 100 Hz con una relación 1:1. </li><li> Cambie a una estimulación continua del GF con pulsos individuales en 1 Hz (Figura 4). </li><li> Rápidamente conecte el inyector en la caja de control. A pesar de que el ruido de fondo puede interferir con las grabaciones de 1 Hz de estimulación, no lo deje. </li><li> Introducir cuidadosamente la micropipeta inyección en la cápsula de la cabeza de la mosca justo debajo de la cutícula, e inyectar la cantidad deseada de compuesto en la hemolinfa de la mosca mientras se mantiene la estimulación de 1 Hz (Figura 4). Debido al sistema circulatorio abierto de la mosca, todo el sistema nervioso será expuesto en el compuesto en cuestión de segundos. Aunque un sitio de inyección en particular no es crítico para entregar compuestos en la hemolinfa, se encuentra la región de la ocelos, que se localizand medial en la parte más dorsal de la cápsula de la cabeza, que es un sitio práctico que permite una inyección que lleva a la distribución rápida y uniforme del compuesto. </li><li> Inmediatamente eliminar micropipeta inyección desde el sitio de inyección y desconectar el inyector de la caja de control mientras continúa la estimulación de 1 Hz GF hasta 1 min después de la inyección (Figura 4). </li><li> Con el fin de revelar los efectos más sutiles de los compuestos en el modelo GFS, destacar las fibras gigantes (GFS), con 10 trenes de 10 estímulos a 100 Hz con un retraso de 1 segundo entre los trenes. Continuar para probar la función de las vías de GF con este paradigma cada 5 minutos hasta 15 minutos (Figura 4). Sin embargo, intervalos más cortos o más largos períodos de seguimiento son también posibles. </li><li> Con el fin de probar si el compuesto tiene un efecto en las uniones neuromusculares (NMJs) de la EFP, y posiblemente reducir los efectos del compuesto, proceder a activar el motor neuronas direccióntemente por la estimulación torácica. Para ello, quite los electrodos de estimulación de los ojos y vuelva a colocar a los lados anterior del tórax con el fin de estimular las neuronas motoras con 10 trenes de 10 estímulos a 100 Hz. </li></ol> Nota: Las huellas de electrofisiología se muestran en el video no corresponden a los efectos de la inyección de tinte puro. 5. Los resultados representativos Efecto de un antagonista en el PSI a DLM sinapsis del sistema de fibra gigante Methyllycaconitine citrato (MLA) es un antagonista nAChR que es específico para a7 subtipos Nachr. El PSI DLMn sinapsis en la vía de GF-DLM depende del subtipo de nAChR Dα7 para su correcto funcionamiento, mientras que la eliminación genética del subtipo nAChR Dα7 no tiene ningún efecto sobre la vía de GF-TTM 5,6. A fin de demostrar la especificidad y sensibilidad de nuestro ensayo se inyectó MLA a diferentes concentraciones (0, 0,02, 0,04, 0.08, 0,12 ng / mg, 46 nl inyectado) en la cabeza del animal (n = 10 por tratamiento con el compuesto, n = 15 para el tratamiento de solución salina). Sólo las moscas macho (de tipo silvestre genotipo 10E salvaje) fueron utilizados, y el efecto del compuesto se controló durante un total de 15 minutos después de la inyección. La Figura 5 representa la diferencia entre las grabaciones de referencia obtenidos antes de la inyección y los obtenidos después de la inyección en respuesta a MLA y solución salina de control. Hemos encontrado que la inyección de MLA como resultado la incapacidad de la vía de GF-DLM para seguir uno a uno a 100 Hz por estimulaciones de la FC en el cerebro, mientras que la vía de GF-MTT no se vio afectado. (Figura 5, trazo superior y media, t-test realizado entre los controles de solución salina [0 ng / mg] y las diferentes concentraciones de MLA en cada punto de tiempo a menos que los datos no paramétricos [la normalidad y la igualdad de las diferencias prueba], de lo contrario se utiliza una prueba de rangos de Mann-Whitney Sum. * p &lt;0,001). Sin embargo, una r uno-a-unoespuesta de la DLM se observó cuando las neuronas motoras fueron estimuladas directamente (Figura 5, traza de fondo), lo que demuestra que la función de la UNM DLM y TTM no se ve afectada por la MLA. MLA apareció para alcanzar su efecto máximo 1 minuto después de la inyección de 0,04, 0,08 y 0,12 ng / mg de MLA inyectado, como no hay cambios significativos adicionales se observaron durante los siguientes 15 minutos de período de prueba. Además, el compuesto alcanza un efecto máximo a 0,08 ng / mg, ya fuertes respuestas no se observaron con la dosis mayor de 0,12 ng / mg. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. El gigante de fibra de diagrama del sistema del sistema de fibra gigante (EFP). Las fibras gigantes (GFS, que se muestra en rojo) sinapsis eléctrica (uniones Gap), así como químicamente (colinérgico) en un Interneuron sinapsis periférica (PSI, que se muestran en verde) y la neurona Tergo muscular trocantéreo (TTMn, que se muestra en amarillo) 5. El PSI DLMn (neurona dorsal del músculo longitudinal, que se muestra en azul) de conexión depende de Dα7 nAChR subtipo 6. Por último, la unión neuromuscular (UNM) de la TTMn y DLMn el salto a la (TTM, que se muestra en color morado) y los músculos del vuelo (DLM, que se muestra en morado) es glutamatérgica. Nota: El Fondo Mundial para la conexión ISP es eléctrica y química. Sin embargo, en los mutantes que carecen de shakB (uniones), no hay respuesta puede ser grabado desde el DLM a la estimulación de la FC en el cerebro, lo que demuestra que el componente químico en la ausencia de conexiones eléctricas no es suficiente para provocar un potencial de acción en el PSI 5,16-18. Debido a que el GF a la conexión de la ISP es dependiente de las uniones, esta cifra sólo muestra la brecha de la salida en la sinapsis por razones de simplicidad. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Micromanipuladores set-up. <ol class="ualpha"><li> Una modificación puesta en marcha de un protocolo previamente publicado 14 se utiliza para ajustar el micromanipulador de inyección de pares de grabaciones de las EFP con nanoinjections simultáneas. La preparación marcha montada se orienta a la cabeza de la mosca hacia el experimentador. El micromanipulador inyección (# 1) se coloca delante de la experimentador entre los dos manipuladores para los electrodos de tungsteno estimulantes (# 2 y # 3). Los dos micromanipuladores para los electrodos de vidrio de grabación (# 4 y # 5) se colocan en el lado izquierdo y derecho, respectivamente. El micromanipulador para el electrodo de tierra de tungsteno (# 6) se coloca más lejos en la parte posterior ya sea en el lado izquierdo (mostrado aquí), o en el lado derecho. </li><li> Una vista cercana de la parte superior de las disposiciones de los diversos electrodos y micropipeta de inyección. </li><li> Un bien montado D. melanogaster empalado con electrodos y micropipeta inyección lista para la inyección. Observe que el cuerpo del animalse monta con su tórax en sentido horizontal y sus alas extendidas. La cera está firmemente envuelto alrededor de su cuerpo impidiendo que el animal se mueva. Además, el electrodo de tierra (# 6, en el abdomen), los electrodos de registro de vidrio (# 4 y # 5, en el tórax, resaltada en contornos oscuros) y los electrodos de estimulación (# 2 y # 3, una en cada ojo ) se empalado en su lugar, como se ha descrito previamente 14. La micropipeta de inyección (# 1) está correctamente alineado con el centro de la ocelos tres (círculo). La inserción de la micropipeta inyección debe ser colocado en esta área. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Micropipeta de inyección de biselado. Un diagrama de una micropipeta adecuadamente biselados se muestra aquí. La apertura del electrodo debe ser biselado a un ángulo de 45 grados y tiene una abertura entre 11 a 17 micras. Una micropipeta adecuada inyección de biselado es crucial para una inyección suave con un mínimo de dAmage a la mosca. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Esquema general del protocolo de nanoinjection / electrofisiología. Un esquema representativo del régimen general de la nanoinjection / protocolo de electrofisiología. Comience por la obtención de un registro al inicio mediante la estimulación de las fibras gigantes (GFS) a 100 Hz con 10 trenes de 10 estímulos cada uno (sólo uno de los trenes que se muestra aquí). Antes de la inyección, comienzan los estímulos 1 Hz un segundo de diferencia. Durante el tiempo de inyección (inyectores, mientras que está conectado a la caja de control), se observará el ruido de fondo considerable, sin embargo, no interrumpir las grabaciones. Después de la inyección (inyectores y está desconectado de la caja de control), continuar con la estimulación de 1 Hz durante 1 minuto más. Por último, procede destacar la FC con 10 trenes de 10 estímulos a 100 Hz, y poniendo a prueba la función de las vías de GF con este paradigma cada 5 minutos hasta 15 minutos. Nota: Las grabaciones wantes de manipular para crear el esquema general y no representan un resultado específico obtenido. No es a escala, no todos los restos se muestran. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3597/3597fig4large.jpg">Haga clic aquí para ampliar la imagen</a> . <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Los efectos de la MLA en la EFP. <ol class="ualpha"><li> Una representación gráfica de los efectos de la α7 antagonista de citrato de nAChR Methyllycaconitine (MLA) en el camino de GF-DLM de la mosca de la fruta a diferentes concentraciones (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg de n = 10 por tratamiento con el compuesto.; n = 15 para el tratamiento de solución salina). Sólo un minuto después de la inyección, un efecto inmediato y significativo fue visto con 0,04 ng / mg de MLA. Un efecto significativo también fue visto con 0.8ng/mg y 0.12ng/mg del Eje de acción a 100 Hz con la estimulación de la FG. No se observaron diferencias significativas entre los controles de solución salina y 0,02 ng / mg de MLA. Además, no puedo cambiarn efecto fue visto después de un minuto después de la inyección durante el tiempo de prueba (15 minutos). Un t-test se realizó entre los controles de solución salina (0 ng / mg) y las diferentes concentraciones del Eje de acción en cada momento. Los niveles se presentan como media + / - SEM, * p &lt;0,001. </li><li> Rastros de muestra de las respuestas a 100 DLM Hz de estimulación. Trazo superior muestra las respuestas de los músculos antes de la inyección diputado a la estimulación de la FG en el cerebro. Observe que el músculo es capaz de responder a cada estímulo de uno a uno a 100 Hz. Medio traza muestra las respuestas de la DLM después de la inyección de MLA (0,12 ng / mg). Observe que el músculo no es capaz de responder a cada estímulo de uno a uno a 100 Hz. (Asteriscos). Traza de fondo muestra las respuestas del DLM de la misma preparación (0,12 ng / mg) a la estimulación directa de las neuronas motoras en el tórax. Debido DLM responde uno a uno a 100 Hz con estimulación torácica, la falta de respuestas con estimulaciones cerebrales se puede atribuir a la colinérgica PSI-DLMn conexión. </li><li> Una representación gráfica de los efectos de diferentes concentraciones de MLA (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) en la vía GF-TTM. No se observaron efectos significativos entre la solución salina (0 ng / mg) y las inyecciones de compuestos en cualquier punto del tiempo. Un t-test se realizó entre los controles de solución salina (0 ng / mg) y las diferentes concentraciones del Eje de acción en cada momento, * p &lt;0,001. </li><li> Rastros de muestra de las respuestas a 100 TTM Hz de estimulación. Trazo superior muestra las respuestas del músculo antes de la inyección MLA tras la activación GF con la estimulación en el cerebro. Tenga en cuenta que el músculo es capaz de responder a todos los estímulos a 100 Hz. Medio traza muestra las respuestas de la DLM después de la inyección de MLA (0,12 ng / mg). Las respuestas del músculo MTT a la estimulación del GF en el cerebro siendo uno-a-uno. Traza de fondo muestra las respuestas de la MTT de la misma preparación a la estimulación de 100 Hz de las neuronas motoras en el tórax (0,12 ng / mg). </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

El bioensayo nanoinjection / electrofisiología que aquí se presenta permite una detección rápida de los compuestos en el sistema nervioso de la mosca de la fruta. Esta es una novedosa técnica in vivo que requiere pequeñas cantidades de un compuesto para provocar un efecto sobre una variedad de objetivos moleculares en un circuito bien caracterizado neuronal. Este método puede ser utilizado para probar la bioactividad de compuestos diferentes, de las toxinas desconocidas a agentes farmacológicos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Electrodos de registro de vidrio: vidrio borosilicato capilares </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1.0mm OD, 0.58mm ID </td></tr><tr><td> Estimulador </td><td> Grass Instruments </td><td> Modelo S48 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Obtener Instruments Inc. </td><td> Modelo 5A </td><td></td></tr><tr><td> Adquisición de datos del software: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Modelo 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Los datos del software colección: pCLAMP </td><td> Molecular Devices </td><td> La versión 10 </td><td></td></tr><tr><td> Estereomicroscopio wde fibra óptica ésima microscopio de lámpara anular </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Modelo HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> La disección de alcance para el montaje </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Manual de Kite Micromanipulador y basculante Base </td><td> World Precision Instruments </td><td> Modelo # M3301 Kite: Modelo # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster Wild 10E genotipo (cepa de tipo salvaje) </td><td> Bloomington Stock Center </td><td> Foto # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Extractor vertical la pipeta </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modelo 700C </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetas de inyección de vidrio: vidrio borosilicato capilares </td><td> World Precision Instruments </td><td> Catálogo # 4878 </td&gt; <td> 1.14mm diámetro exterior, 0,5 mm ID </td></tr><tr><td> Aceite de silicona </td><td> Pescador </td><td> Catálogo # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Biselador </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> KT Brown Tipo Modelo # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> World Precision Instruments </td><td> Catálogo # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Colorante azul </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Ingredientes: agua, propilenglicol, FD &amp; C Azul 1, y el 0,1% Propilparabeno (conservante). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine citrato (MLA) </td><td> Bioscience Tocris </td><td> Catálogo # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Barras de plástico de cera </td><td> Hygenic Corporation (Akron, Ohio, EE.UU.) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system

Compuestos de cribado para la actividad in vivo puede ser utilizado como un primer paso para identificar a los candidatos que pueden ser desarrollados en 1,2 agentes farmacológicos. Hemos desarrollado un novedoso nanoinjection / electrofisiología ensayo que permite la detección de efectos moduladores bioactivos de los compuestos sobre la función de un circuito neuronal que media la respuesta de escape en la Drosophila melanogaster 3,4. Nuestro ensayo in vivo, que utiliza el sistema Drosophila gigante de fibra (EFP, Figura 1) permite la detección de diferentes tipos de compuestos, tales como pequeñas moléculas o péptidos, y requiere sólo cantidades mínimas para provocar un efecto. Además, el GFS Drosophila ofrece una gran variedad de posibles dianas moleculares en las neuronas o músculos. Las fibras gigantes (GFS) sinapsis eléctrica (uniones Gap), así como químicamente (colinérgico) en una sinapsis periférica Interneuron (PSI) y la neurona Tergo trocantéreo muscular (TTMn) 5 </sup&gt;. El PSI DLMn (neurona dorsal del músculo longitudinal) de conexión depende de Dα7 receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) 6. Por último, las uniones neuromusculares (UNM) de la TTMn y la DLMn con el salto (TTM) y los músculos de vuelo (DLM) son glutamatérgica 7-12. Aquí, demostramos cómo inyectar cantidades nanolitros de un compuesto, mientras que la obtención de registros intracelulares electrofisiológicos del sistema de fibra gigante 13 y cómo controlar los efectos del compuesto sobre la función de este circuito. Se muestra la especificidad de la prueba con citrato de methyllycaconitine (MLA), un antagonista de nAChR, que interrumpe a la ISP a DLMn conexión, pero no el GF TTMn conexión o la función de la UNM en el salto o los músculos del vuelo. Antes de comenzar este video es muy importante que se observe con atención y se familiaricen con el video titulado &quot;Jove registros electrofisiológicos de la vía fibra gigante de D. melanogaster &quot;de Augustin et al 7, como el video que aquí se presenta pretende ser una expansión de esta técnica existente. Aquí se utiliza el método de los registros electrofisiológicos y el enfoque en detalle sólo en la suma de los pares de nanoinjections y la técnica de monitoreo.

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Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Una rápida<em&gt; En vivo</em&gt; Ensayo para probar compuestos de neuromoduladores que utilizan el sistema de fibra gigante (GFS) de los<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Se describe. Nanoinjections en la cabeza del animal, junto con registros electrofisiológicos de la EFP puede revelar la bioactividad de compuestos en las neuronas o músculos.

Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

paired-nanoinjection-electrophysiology-assay-to-screen-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

13.1K vistas.  Florida Atlantic University. Una rápida En vivo Ensayo para probar compuestos de neuromoduladores que utilizan el sistema de fibra gigante (GFS) de los Drosophila melanogaster Se describe. Nanoinjections en la cabeza del animal, junto con registros electrofisiológicos de la EFP puede revelar la bioactividad de compuestos en las neuronas o músculos.

Video: Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

Registros electrofisiológicos de la ruta de fibra gigante de D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Investigación

Neurociencias

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinación de la actividad locomotora espontánea en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Ensayo sencillo para cuantificación de Prevención Social en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uso de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Ensayo de Alto Rendimiento para el Examen de Preferencias de la puesta de huevos individual<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Las larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Una manera sencilla de medir alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensa Uso<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante

Resumen

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Capítulos en este video

Registros electrofisiológicos de la ruta de fibra gigante de D. melanogaster

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de

Determinación de la actividad locomotora espontánea en

Ensayo sencillo para cuantificación de Prevención Social en

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa

Ensayo de Alto Rendimiento para el Examen de Preferencias de la puesta de huevos individual

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de

Una manera sencilla de medir alteraciones en el comportamiento de búsqueda de recompensa Uso