Este ensayo de fagocitosis in vivo permite a los investigadores realizar análisis genéticos y estudios de asociación en todo el genoma para identificar genes nuevos que regulan la fagocitosis en las células sanguíneas adultas. Este experimento es cuantitativo, fácil de realizar y se puede aplicar al cribado de animales vivos en busca de factores de acogida que influyen en el reconocimiento, la absorción y el aclaramiento de patógenos. Después de tirar de los capilares de vidrio de pared delgada con un tirador de aguja, utilice un micrómetro para sujetar la aguja bajo un microscopio y utilice pinzas de acero inoxidable de punta fina número cinco para romper la punta a un diámetro de punta de 100 micrómetros.
Para medir el volumen de líquido que se inyectará en cada mosca, cargue una aguja capilar con colorante estéril de 5% alimentos en PBS, y expulse el líquido en una gota de aceite mineral en un micrómetro de etapa de 0,01 milímetros. Dispensar 10 microlitros de 1,6 miligramos por mililitro de partículas en un pequeño cuadrado de Parafilm, y tirar del líquido dentro de la aguja. Monte la aguja en la boquilla del inyector y forje las moscas anestesiadas a lo largo de su área designada en la almohadilla de mosca, del lado ventral hacia arriba, con las cabezas orientadas hacia la parte delantera de la almohadilla.
Coloque los viales en las áreas correspondientes en el banco e inyecte las moscas en la esquina superior del abdomen con cinco bombas de 100 milisegundos de líquido para entregar alrededor de 10 nanolitros de partículas en total. Transfiera cada mosca al vial adecuado a medida que se inyecta, observando el tiempo en el vial. A continuación, cargue una nueva aguja con una solución 0.4%Trypan Blue, y ajuste el inyector neumático en privado, para permitir un flujo constante de aire para empujar el líquido fuera de la aguja.
30 minutos después de la inyección inicial, inyectar cada abdomen de la mosca con Trypan Blue hasta que el abdomen esté lleno y distendido. Montar las moscas en diapositivas de microscopio con cinta eléctrica, lado ventral hacia abajo, empujando las alas hacia el lado de la mosca para asegurarlas a la cinta. A continuación, empuje suavemente la cabeza en la cinta para asegurarse de que la mosca no se moverá.
Inmediatamente después de que todas las moscas han sido aseguradas, imagen de los insectos, uno a la vez, a un aumento de 25 o 32 veces en un microscopio de fluorescencia invertido conectado a una cámara digital y computadora, centrándose en el recipiente dorsal de cada mosca utilizando el software de computadora para la cámara digital. A continuación, registre el tiempo de exposición y el aumento entre los experimentos. Para cuantificar la fluorescencia, abra un programa de análisis de imágenes adecuado y abra una imagen.
Para medir la intensidad de fluorescencia del recipiente dorsal, dibuje un polígono alrededor del recipiente dorsal y seleccione Medir para registrar la intensidad de fluorescencia dentro del polígono. Para determinar la intensidad de fluorescencia de fondo, copie el primer polígono y muévalo a un área adyacente al recipiente dorsal de cada mosca. A continuación, seleccione Medir y registre la intensidad de fluorescencia del área de fondo.
Para normalizar la fluorescencia del vaso dorsal por la fluorescencia de fondo, después de medir las intensidades de fluorescencia del resto de las moscas, dividir la fluorescencia del vaso dorsal por la fluorescencia de fondo, y calcular la intensidad media de fluorescencia del vaso dorsal normalizado de todas las moscas en una sola cepa. Después de ser montado lado ventral hacia abajo en un pedazo de cinta eléctrica, los dos primeros segmentos del abdomen, donde se encuentra el vaso dorsal, son claramente visibles. Las fuentes clave de error experimental surgen en los pasos de inyección e imágenes del procedimiento.
El uso de la misma aguja para inyectar varias moscas puede hacer que se obstruya con tejido mosca o partículas. Las moscas que no reciben suficiente fluorescencia de Trypan Blue brillantemente a lo largo de todo su abdomen, lo que puede reducir la relación del vaso dorsal con la fluorescencia de fondo, disminuyendo así la verdadera proporción de intensidad de fluorescencia del animal. Las moscas deben ser fotografiadas mientras están inmovilizadas por dióxido de carbono, ya que las moscas en movimiento activo producen imágenes borrosas que no se pueden cuantificar.
Una línea mutante de la colección Zuker de moscas tratadas con metanoesulfonato etílico son incapaces de fagocitosis gram-negativa y gram-positiva bacterias y muestra casi ninguna fluorescencia del vaso dorsal en el ensayo de fagocitosis in vivo, emparejado con el fondo isogénico cepa Zuker y otra cepa común de control de laboratorio. Lleve un registro del tiempo y el orden en que se inyectan las moscas para asegurarse de que las moscas se encuentran en etapas comparables de reconocimiento y absorción de patógenos cuando se imagenn. Los mecanismos moleculares subyacentes a los defectos fagocíticos se pueden determinar mediante el estudio de hemocitos individuales con microscopía confocal o después de la clasificación celular activada por fluorescencia o por aislamiento magnético de cuentas de hemocitos adultos.
