Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Mari eo laboratório Godenschwege, em especial Aline Yonezawa, para comentários e ajudar com este protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame R21NS06637 concessão para FM e TAG; AB foi financiado pelo número prêmio National Science Foundation 082925, URM: Biologia Integrativa para futuros pesquisadores.

1. Eletrofisiologia Rig Set-up <ol><li> O equipamento necessário para o equipamento de electrofisiologia de configuração é descrito em detalhe por Augustin et ai. neste Jornal 14. Por favor, consulte este artigo para uma explicação detalhada dos aparatos necessários eletrofisiológicas. </li><li> Modifique o descrito anteriormente eletrofisiologia plataforma set-up 14 por adição de um micromanipulador sexta, que detém a nanoinjector. Para um fácil acesso para a cabeça do animal deve ser colocada entre os dois eléctrodos estimulantes micromanipuladores como mostrado na Figura 2. </li><li> Antes de iniciar a experiência, garantir que tem uma gama confortável em todos os eixos de rotação com todos os micromanipuladores, e que todos os eléctrodos, assim como a micropipeta de injecção (ver passo 2) pode chegar ao animal. </li></ol> 2. Nanoinjection Set-up <ol><li> O conjunto nanoinjection-se requer uma Nanoliter2000 (World precisisobre os instrumentos, Sarasota, FL, EUA) ou de tipo semelhante de injetor que permite injeção em quantidades controladas nanolitros. </li><li> Preparar agulha de injecção usando as micropipetas de vidro fornecidos com o injector, puxando-as para uma resistência de 80-100 mohms com um puxador de eléctrodo. </li><li> Para injecções lisas é exigido que os bisel micropipetas para uma abertura iM 11-17 a um ângulo de 45 graus (Figura 3). </li><li> Lentamente aterrar a micropipeta de injeção com óleo sintético utilizando uma seringa Hamilton com as instruções do manual do Nanoliter2000, garantindo que nenhuma bolha de ar estão presentes. </li><li> Cuidadosamente garantir a micropipeta na nanoinjector e prepará-lo para carregar o composto por esvaziar o excesso de óleo com as instruções do manual do Nanoliter2000. </li><li> Coloque o injector na micromanipulador e carregar o composto como indicado no manual Nanoliter2000. Assegure-se que a ponta da micropipeta não quebre durante esteprocedimento. </li><li> Defina a quantidade desejada de nanolitros ser injetados na caixa de injetor de controle conforme as instruções do manual do Nanoliter2000. Por favor, note que o montante total injetado não deve exceder 100 nl. Nós descobrimos que maiores quantidades de soluções de controlo de solução salina pode afectar a função do circuito GFS. </li><li> É crítico para ter o injector desligado da caixa de controlo durante a aquisição de gravação com a excepção da injecção de si, uma vez que a fonte de energia do nanoinjector interfere com as gravações, que é visível como o ruído de fundo (Figura 4). No entanto, não desligue a fonte de alimentação para a caixa de controle como ele vai voltar a defini-la. </li></ol> 3. Drosophila melanogaster Preparação <ol><li> Anestesiar 2 a 6 dias de idade moscas com CO 2 ou em gelo, como descrito anteriormente 14,15. </li><li> Uma vez imóvel, use um par de pinças para transferir o animal para uma pequena placa wicera mole ª dental por pegá-la de suas pernas. Por favor, note que uma mosca da fruta macho pesa cerca de 1,0 mg e uma mosca de fruta fêmea pesa cerca de 1,2 mg, assim composto-a-corpo relação peso é diferente nas moscas do sexo masculino versus feminino. Portanto, recomenda-se usar apenas um dos sexos para as experiências. </li><li> Como descrito anteriormente 14,15, cuidadosamente montar o lado dorsal mosca-se e assegurar que o tórax e da cabeça são imobilizados com cera dental macio colocado em torno do corpo. Cuidadosamente espalhar as asas para fora de modo que eles estabelecem perpendicular ao tórax (Figura 2, C). A mosca deve ser montado com como danos pouco quanto possível. </li></ol> 4. Nanoinjection emparelhado / eletrofisiologia <ol><li> Coloque o fly montado sobre a plataforma de eletrofisiologia com a cabeça em direção aos eletrodos de estimulação. </li><li> Empalar o animal com a correspondente estimulante chão, e eléctrodos de registo, como descrito anteriormente 14,15 (Figura 2, C). Salvo disposição em contrário desejado, a gravação de um eletrodo lugar para o DLM eo outro no músculo TTM. O músculo DLM está localizado no tórax entre os anteriores dorso-centrais cabelos e da linha mediana da mosca. O músculo TTM está localizado perto das ligações da asa, entre os posteriores e anteriores Supra-Alar pêlos da mosca 7. </li><li> Alinhar o micropipeta de injecção contendo o composto com o centro do ocelos três situado sobre a porção média posterior da cabeça, mas não injectar ainda (Figura 2, C). </li><li> Antes da injecção composto obter uma gravação de linha de base do GF o MTT e GF para DLM vias do sistema de fibras gigante (GFS, Figura 1) através da estimulação do cérebro. Para fazer isso, activar as fibras gigantes (FG) com 10 trens de 10 estímulos (40-50 mV) cada dado para uma duração de 0,03 ms a 100 Hz, com um atraso de 1 segundo entre os trens 14,15 (Figura 4). Tipo selvagem voa should ser capaz de seguir um-para-um, a este ritmo de estimulação para ambos DLM e vias TTM. Descarte a mosca se o GF a DLM e GF para as vias de TTM não seguem o estímulo de 100 Hz em uma proporção de 1:1. </li><li> Mudar a estimulação contínua do GF com pulsos simples, no Hz 1 (Figura 4). </li><li> Rapidamente conecte o injector na caixa de controle. Mesmo que o ruído de fundo vai interferir com as gravações de estimulação 1 Hz, não eliminá-la. </li><li> Cuidadosamente inserir o micropipeta de injecção para dentro da cápsula cabeça da mosca logo abaixo da cutícula, e injectar a quantidade desejada de composto na hemolinfa da mosca enquanto se mantém a estimulação 1 Hz (Figura 4). Devido ao sistema circulatório aberta da mosca, todo o sistema nervoso será exposto ao composto em poucos segundos. Embora um local de injecção particular não é crítica para entregar compostos na hemolinfa, encontramos a região do ocelos, que são localizard medial no lado mais dorsal da cápsula cabeça, para ser um local conveniente que permite para a injecção fácil que leva a uma distribuição rápida e uniforme do composto. </li><li> Imediatamente remover micropipeta de injecção a partir de local da injecção e desligue o injector a partir da caixa de controlo, enquanto continua a 1 Hz estimulação GF até 1 min após a injecção (Figura 4). </li><li> A fim de revelar efeitos mais sutis de compostos no GFS, sublinham os fibras gigantes (GFS), com 10 trens de 10 estímulos de 100 Hz com um atraso de 1 segundo entre os trens. Continuar a testar a função das vias GF com este paradigma a cada 5 minutos até 15 minutos (Figura 4). No entanto, intervalos mais curtos ou longos períodos de monitoramento também são possíveis. </li><li> A fim de testar se o composto tem um efeito nas junções neuromusculares (NMJs) do GFS, e possivelmente diminuir os efeitos do composto, proceder para activar o motor neurónios direcçãoqüentemente por estimulação torácica. Para isso, remover os eléctrodos estimulantes dos olhos e substituí-los nos lados anterior do tórax, a fim de estimular os neurónios motores com 10 trens de 10 a 100 Hz estímulos. </li></ol> Nota: Os traços electrofisiologia mostrados no vídeo não correspondem aos efeitos da injecção de corante puro. 5. Os resultados representativos Efeito de um antagonista sobre o PSI para DLM sinapse do sistema de fibras Gigante Methyllycaconitine citrato (MLA) é um antagonista nAChR que é específico para α7 subtipos nAChR. A PSI para DLMn sinapse na via de GF-DLM é dependente do subtipo nAChR Dα7 para o bom funcionamento, enquanto a remoção genética de Dα7 subtipo nAChR não tem efeito sobre a via GF-TTM 5,6. A fim de demonstrar a especificidade e sensibilidade do nosso ensaio que injectado MLA em diferentes concentrações (0, 0,02, 0,04, 0.08, 0,12 ng / mg, 46 nl injectada) para a cabeça do animal (n = 10 por tratamento com composto, n = 15 para o tratamento de solução salina). Apenas as moscas do sexo masculino (do tipo selvagem genótipo selvagem 10E) foram usados, eo efeito do composto foi monitorizado durante um total de 15 minutos após a injecção. A Figura 5 representa a diferença entre valores basais obtidos antes da injecção e os obtidos após a injecção, em resposta a MLA e solução salina de controlo. Nós descobrimos que a injecção de MLA resultou na incapacidade da via GF-DLM para seguir um-para-um a 100 Hz por estímulos do FG no cérebro enquanto a via GF-TTM permaneceram inalterados. (Figura 5, o traço superior e médio, t-teste realizado entre os controlos de solução salina [0 ng / mg] e as concentrações diferentes de MLA em cada ponto de tempo, a menos que os dados são não-paramétrico [normalidade e variâncias iguais testado], caso contrário, usamos de Mann-Whitney Rank Sum Test. * p &lt;0,001). No entanto, r um-para-umesposto do DLM foi observado quando os neurónios motores foram estimuladas directamente (Figura 5, traço de fundo), demonstrando que a função JNM do DLM e TTM não é afectada pela MLA. MLA apareceu para atingir o seu máximo efeito de 1 minuto após a injecção para 0,04, 0,08 e 0,12 ng / mg de MLA injectado, como não há mais alterações significativas foram observados durante os seguintes 15 minutos de período de teste. Além disso, o composto alcançado um efeito máximo a 0,08 ng / mg uma vez que as respostas mais fortes não foram observadas com a dosagem mais elevada de 0,12 ng / mg. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. O diagrama de sistema gigante de fibra do sistema de fibras gigante (GFS). As fibras gigantes (FG, mostrado em vermelho) sinapse electricamente (Junções Gap), bem como quimicamente (colinérgica), sobre um Interneuron sinapse periférica (PSI, mostrado em verde) e o tergo neurónio Muscle Trochanteral (TTMn, mostrado na amarelo) 5. O PSI DLMn conexão (neurônio músculo dorsal longitudinal, mostrado em azul) é dependente Dα7 subtipo nAChR 6. Finalmente, a junção neuromuscular (JNM) do TTMn eo DLMn para o salto (TTM, mostrado em roxo) e músculos de vôo (DLM, mostrado em roxo) é glutamatérgica. Nota: O GF para conexão PSI é tanto elétrica e química. No entanto, em mutantes shakB (que carecem de junções), nenhuma resposta pode ser gravado a partir do DLM após estimulação da FG no cérebro, demonstrando que o componente químico, na ausência de ligações eléctricas não é suficiente para evocar um potencial de acção no PSI 5,16-18. Porque o GF para conexão PSI é dependente junções, esta figura mostra apenas a junção de GAP na sinapse por razões de simplificação. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Micromanipuladores set-up. <ol class="ualpha"><li> A modificado set-up de um protocolo publicado anteriormente 14 é utilizado para ajustar a injeção micromanipulador para gravações emparelhados GFS com nanoinjections simultâneas. A preparação fly montado é orientado com o chefe da mosca para o experimentador. O micromanipulador injecção (# 1) é colocado na frente do experimentador entre os dois manipuladores para os eléctrodos de tungsténio estimulantes (2 # e # 3). Os dois micromanipuladores para os eléctrodos de vidro de gravação (# 4 e # 5) são colocados no lado esquerdo e direito, respectivamente. O micromanipulador para o eléctrodo de terra de tungsténio (# 6) é colocado mais distante na parte de trás, quer do lado esquerdo (mostrado aqui) ou no lado direito. </li><li> Um fim vista a partir do topo do regime dos eléctrodos e vários micropipeta de injecção. </li><li> Um devidamente montado D. melanogaster empalado com eletrodos e micropipeta de injeção pronto para a injecção. Note-se que o corpo do animalé montado com o seu tórax horizontalmente e as asas se espalhar. A cera está firmemente enrolado em torno do seu corpo impedindo o animal de se mover. Além disso, o eléctrodo de terra (# 6, no abdómen), os eléctrodos de registo de vidro (# 4 e # 5, no tórax, em destaque por contornos escuras), e os eléctrodos de estimulação (# 2 e # 3, uma em cada olho ) são empalado no lugar, como descrito anteriormente 14. A micropipeta de injecção (# 1) está correctamente alinhado com o centro do ocelos três (círculo). A inserção da micropipeta de injecção deve ser colocado nesta área. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Micropipeta de injeção chanfrada. Um diagrama de uma micropipeta devidamente chanfrado é mostrado aqui. A abertura do eléctrodo deve ser chanfrada a um ângulo de 45 graus e têm uma abertura entre 11 a 17 uM. A micropipeta de injecção adequada chanfrada é crucial para uma injeção suave com mínimo damage à mosca. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Esquema geral do protocolo nanoinjection / eletrofisiologia. Um diagrama representativo do regime geral para o nanoinjection / protocolo de eletrofisiologia. Comece por obter uma gravação de linha de base, estimulando as fibras gigantes (GFS) a 100 Hz com 10 trens de 10 estímulos cada (apenas um trem mostrado aqui). Antes da injeção, começam os estímulos 1 Hz um segundo de intervalo. Durante o tempo de injeção (injetora, enquanto está ligado à caixa de controle), você vai observar o ruído de fundo significativo, no entanto, não interromper as gravações. Após a injeção (e injetor está desconectado da caixa de controle), continuar a estimulação de 1 Hz por cerca de mais 1 minuto. Finalmente, proceder para salientar a FG com 10 trens de 10 estímulos a 100 Hz e continuar para testar a função das vias GF com este paradigma a cada 5 minutos até 15 minutos. Nota: gravações were manipulado para criar o regime geral e não representam um resultado específico obtido. Não à escala, nem todos os traços são mostrados. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3597/3597fig4large.jpg">Clique aqui para ampliar a imagem</a> . <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig5.jpg" alt="A Figura 5" /> Figura 5. Os efeitos do MLA no GFS. <ol class="ualpha"><li> Uma representação gráfica dos efeitos do nAChR citrato antagonista α7 Methyllycaconitine (MLA) sobre a via de GF-DLM da mosca da fruta em diferentes concentrações (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg n = 10 por tratamento com composto.; n = 15 para o tratamento de solução salina). Apenas um minuto após a injecção, um efeito significativo e imediata foi observada com 0,04 ng / mg de MLA. Um efeito significativo também foi visto com 0.8ng/mg e 0.12ng/mg de MLA a 100Hz estimulação do FG. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os controles de salinas e 0,02 ng / mg de MLA. Além disso, não mudar in efeito foi observado após uma injecção de pós minutos durante o tempo testado (15 minutos). Um t-teste foi realizado entre os controlos de solução salina (0 ng / mg) e as concentrações diferentes de MLA em cada ponto de tempo. Os níveis são apresentados como média + / - SEM, * p &lt;0,001. </li><li> Vestígios de exemplo das respostas DLM a 100 Hz estimulação. Traço superior mostra as respostas do músculo antes MLA injecção após estimulação GF no cérebro. Note-se que o músculo é capaz de responder a cada estímulo de um-para-um a 100 Hz. Meio de rastreio exibe as respostas do DLM após injecção MLA (0,12 ng / mg). Note-se que o músculo não é capaz de responder a cada estímulo de um-para-um a 100 Hz. (Asteriscos). Traço inferior mostra as respostas do DLM da mesma preparação (0,12 ng / mg) com a estimulação direta dos neurônios motores no tórax. Devido DLM responde um-para-um a 100 Hz, com a estimulação torácica, a falha de respostas com estímulos cerebrais pode ser atribuído à ligação PSI DLMn-colinérgico. </li><li> Uma representação gráfica dos efeitos com diferentes concentrações MLA (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) sobre a via do GF-TTM. Não houve diferenças significativas foram observadas entre o soro fisiológico (0 ng / mg) e injeções de compostos em nenhum momento. Um t-teste foi realizado entre os controlos de solução salina (0 ng / mg) e as concentrações diferentes de MLA em cada ponto de tempo, * p &lt;0,001. </li><li> Vestígios de exemplo das respostas TTM a 100 Hz estimulação. Traço superior mostra as respostas do músculo antes MLA injeção sobre GF ativação com estimulação no cérebro. Note-se que o músculo é capaz de responder a todos os estímulos a 100 Hz. Meio rastreio mostra as respostas do DLM após injecção MLA (0,12 ng / mg). As respostas a partir do músculo TTM à estimulação do GF no cérebro permanecer um-para-um. Traço inferior mostra as respostas do MTT da mesma preparação a 100 Hz estimulação dos neurónios motores no tórax (0,12 ng / mg). </li></ol>

<ol>
	<li>Koehn, F. E., Carter, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+natural+products+in+drug+discovery.">The evolving role of natural products in drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).</li><li>Miljanich, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+neuronal+calcium+channel+blocker+for+treating+severe+chronic+pain.">Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).</li><li>Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conantokins:+peptide+antagonists+of+NMDA+receptors.">Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).</li><li>Lewis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conotoxins+as+selective+inhibitors+of+neuronal+ion+channels,+receptors+and+transporters.">Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters.</a> IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila.">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS biology. 4, e63 (2006).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-glutamate+as+an+excitatory+transmitter+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction.">L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).</li><li>Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Glutamate+at+insect+excitatory+nerve-muscle+synapses.">L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses.</a> Nature. 219, 1169-1172 (1968).</li><li>Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+glutamate+receptor+subunits+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).</li><li>Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+glutamate+receptors+in+Drosophila+reveals+a+retrograde+signal+regulating+presynaptic+transmitter+release.">Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release.</a> Neuron. 19, 1237-1248 (1997).</li><li>Qin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+different+subunits+are+essential+for+expressing+the+synaptic+glutamate+receptor+at+neuromuscular+junctions+of+Drosophila.">Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).</li><li>Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+an+invertebrate+glutamate+receptor+subunit+expressed+in+Drosophila+muscle.">Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle.</a> Science. 254, 112-114 (1991).</li><li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila.">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> Journal of. 44, 405-421 (1980).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).</li><li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Null+mutation+in+shaking-B+eliminates+electrical,+but+not+chemical,+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system:+a+structural+study.">Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study.</a> J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).</li><li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila.">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li><li>Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Passover+locus+in+Drosophila+melanogaster:+complex+complementation+and+different+effects+on+the+giant+fiber+neural+pathway.">The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway.</a> Genetics. 126, 1045-1059 (1990).</li><li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis.">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li><li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter.">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).</li><li>Mejia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+in+vivo+screening+of+toxins+using+the+Drosophila+Giant+Fiber+circuit.">A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit.</a> Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).</li><li>Stork, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O bioensaio nanoinjection / eletrofisiologia aqui apresentada permite uma rápida triagem de compostos no sistema nervoso da mosca da fruta. Este é um novo na técnica in vivo que requer pequenas quantidades de um composto para eliciar um efeito sobre uma variedade de alvos moleculares em um circuito bem caracterizado neuronal. Este método pode ser usado para testar a bioactividade de compostos diferentes, a partir de toxinas desconhecidos para comercialmente disponíveis agentes farmacológicos. </p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Gravação de eletrodos de vidro: vidro borosilicato capilares </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1,0 milímetros OD, 0,58 milímetro ID </td></tr><tr><td> Estimulador </td><td> Grass Instruments </td><td> Modelo S48 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Obtendo Instruments Inc. </td><td> 5A modelo </td><td></td></tr><tr><td> Aquisição de dados Software: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Modelo 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dados software de coleta: pCLAMP </td><td> Molecular Devices </td><td> Versão 10 </td><td></td></tr><tr><td> Estereomicroscópio wom fibra óptica iluminador anel microscópio </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Modelo HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando espaço para montagem </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Kite micromanipulador Manual &amp; Inclinação da Base </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> Modelo # M3301 Kite: Modelo # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster Selvagem genótipo 10E (cepa selvagem) </td><td> Bloomington estoque centro </td><td> Stock # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Vertical pipeta extrator </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modelo 700c </td><td></td></tr><tr><td> Injeção micropipetas de vidro: vidro borosilicato capilares </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> Catálogo # 4878 </td&gt; <td> OD 1,14 milímetros, 0,5 milímetros ID </td></tr><tr><td> Óleo de silicone </td><td> Pescador </td><td> Catálogo # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Beveler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> KT Tipo Brown Modelo # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> Catálogo # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Corante azul </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Ingredientes: água, propileno glicol, FD &amp; C Azul 1, e 0,1% Propilparabeno (conservante). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine citrato (MLA) </td><td> Tocris Bioscience </td><td> Catálogo # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Plástico paus de cera </td><td> Hygenic Corporation (Akron Ohio EUA) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system

Os compostos de rastreio para a actividade in vivo pode ser usada como um primeiro passo para identificar candidatos que podem ser desenvolvidos em 1,2 agentes farmacológicos. Nós desenvolvemos uma nova ensaio nanoinjection / electrofisiologia que permite a detecção de efeitos modulatórios bioactivos de compostos sobre a função de um circuito neuronal que medeia a resposta de fuga em Drosophila melanogaster 3,4. O nosso ensaio in vivo, que utiliza o sistema de fibra de Drosophila gigante (GFS, Figura 1) permite a triagem de diferentes tipos de compostos, tais como pequenas moléculas ou péptidos, e requer apenas quantidades mínimas de eliciar um efeito. Além disso, a Drosophila GFS oferece uma grande variedade de potenciais alvos moleculares nos neurônios ou músculos. As fibras gigantes (FG) sinapse electricamente (Junções Gap), bem como quimicamente (colinérgica) sobre uma sinapse periférica Interneuron (PSI) e do músculo tergo Trochanteral neurónio (TTMn) 5 </sup&gt;. O PSI para DLMn conexão (neurônio muscular longitudinal dorsal) é dependente Dα7 receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) 6. Finalmente, a junção neuromuscular (JNM) do TTMn eo DLMn com o salto (TTM) e os músculos de vôo (DLM) são glutamatérgica 7-12. Aqui, é mostrado como para injectar quantidades nanolitros de um composto, enquanto que a obtenção de electrofisiológicos gravações intracelulares a partir do sistema de fibra gigante 13 e como para monitorizar os efeitos do composto sobre a função deste circuito. Nós mostramos especificidade do ensaio com methyllycaconitine citrato (MLA), um antagonista nAChR, que interrompe o PSI para DLMn ligação, mas não o GF para TTMn ligação ou a função do JNM no salto ou músculos de voo. Antes de começar este vídeo é fundamental que você observar cuidadosamente e se familiarizar com o vídeo intitulado &quot;JOVE gravações eletrofisiológicas da via fibra gigante de D. melanogaster &quot;de Augustin et al 7, como o vídeo aqui apresentado destina-se como uma expansão a esta técnica existente. Aqui usamos o método gravações eletrofisiológico e foco em detalhes apenas na adição dos nanoinjections emparelhados e técnicas de monitoramento.

Watch this Scientific Journal Video about Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System at JoVE.com

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Uma rápida<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para testar compostos neuromoduladores usando o sistema de fibra gigante (GFS) do<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; É descrito. Nanoinjections na cabeça do animal, juntamente com gravações eletrofisiológicas do GFS pode revelar bioatividade dos compostos nos neurônios ou músculos.

Nanoinjection emparelhado e Eletrofisiologia Ensaio para a tela de bioatividade dos compostos utilizando os Drosophila melanogaster Sistema Fibra Gigante

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

paired-nanoinjection-electrophysiology-assay-to-screen-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

13.0K visualizações.  Florida Atlantic University. Uma rápida In vivo Ensaio para testar compostos neuromoduladores usando o sistema de fibra gigante (GFS) do Drosophila melanogaster É descrito. Nanoinjections na cabeça do animal, juntamente com gravações eletrofisiológicas do GFS pode revelar bioatividade dos compostos nos neurônios ou músculos.

Vídeo: Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Neurociência

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...