Esta investigación fue financiada en parte por el NIH-SR3 EB007299-02 y NSF Premio EPSCoR Primera.

1. Preparación de tejidos Construct El tejido de la construcción de proceso de preparación consta de tres etapas principales: la expansión de la población de células, la siembra de células en un andamio biomaterial, y la diferenciación a través del uso de químicos moléculas de señalización. El procedimiento para la preparación de constructo se basa en métodos realizados por Dennis et al., Hong et al., Y Marion y Mao 8,9,10. <ol><li> Después de la cultura y la expansión de la línea celular, las semillas de las células madre mesenquimales humanas (h MSC) sobre una esponja de gelatina (4 mm de diámetro, 3,5 mm de espesor) a una densidad de 1x10 6 células / ml para los huesos y 3x10 6 células / ml adiposo formación. </li><li> Para la diferenciación de las MSCs h en adiposo, se aplican los medios de inducción formados por adiposas dexametasona mM 1, 0,5 mM isobutil-metilxantina, 10 ug / ml de insulina humana recombinante, y 200 mM indometacina en medio celular expansiónvez que las células parecen confluir en el cadalso. Después de tres días, reemplazar los medios con 10 mg / ml de insulina humana recombinante en los medios de expansión para 24 horas y luego volver a los medios de inducción. Repetir el ciclo tres veces y luego cambiar sólo en los medios de mantenimiento cada dos días. </li><li> Para inducir la osteogénesis, preparar los medios de inducción osteogénicas haciendo una concentración final de dexametasona de 0,1 micras, 50 M de ácido L-ascórbico-2phosphate, y 10 mM de β-glicerofosfato medio celular en expansión. Vuelva a colocar los medios de comunicación con nuevas osteogénicas cada dos días. </li></ol> 2. Caracterización del actuador Caracterización del actuador es un paso vital para el experimento de la ERM. ERM se basa en la propagación de ondas mecánicas de cizallamiento para evaluar los valores locales de las propiedades mecánicas, por lo tanto, estas vibraciones mecánicas necesitan ser generado y caracterizado dentro del tejido de interés utilizando un actuador piezoeléctrico. Un exa ilustradaMPLE del proceso de caracterización se muestra en la Figura 3. El objetivo de este procedimiento es el de optimizar el movimiento del actuador con el fin de generar inofensivas ondas de corte con amplitudes significativas (~ 250 micras). <ol><li> Antes del experimento, se aplican 0,5% en gel de agarosa para encerrar el constructo en un tubo de ensayo de 10 mm. La temperatura del gel debe ser de aproximadamente 37 ° C para minimizar el daño a la construcción. </li><li> Después de permitir que los gel de agarosa cinco minutos para fijar a la temperatura ambiente, insertar la punta del motor piezoeléctrico de flexión en la superficie del gel. </li><li> Una el tubo que contiene la muestra y el actuador a un soporte rígido, y orientar el haz de láser Doppler la Vibrómetro hacia la punta del actuador mecánico. Ajustar el posicionamiento del sistema para optimizar la señal reflejada, utilice cinta reflectante si es necesario. </li><li> En base a la frecuencia de resonancia esperada del actuador mecánico, ajustar el generador de funciones para barrer el dgama de frecuencias eseado (es decir, 20 a 2000 Hz en este experimento) utilizando un voltaje de funcionamiento de 20 Vpp con una señal de ruido blanco. </li><li> Ver el espectro se caracteriza en el programa de Polytec Vibrosoft para identificar la frecuencia de resonancia del sistema y configurar el programa para la FFT y la velocidad como el eje y. </li><li> Para la medición de desplazamiento, ajuste el actuador para entregar una sinusoide continua en la frecuencia de resonancia indicado utilizando un voltaje de operación de 200 Vpp, y observar el desplazamiento generado se entrega a la superficie del gel. Establecer Vibrosoft para mostrar la FFT con el desplazamiento como el eje y. </li></ol> 3. Adquisición de imágenes <ol><li> Después de completar la caracterización del actuador, poner la muestra y el actuador en el centro del escáner de RMN. Para los experimentos de constructos de tejido, utilizar una bobina de RF pequeño y más sensible (es decir, 10 mm en este experimento) para la transmisión y recepción de la señal RF. (El procedimiento se muestra utiliza una T 9,4imán taladro vertical equipado con gradientes de triple eje, 100 g / cm). </li><li> Adquirir una imagen de explorador para la identificación de la ubicación de construcción. </li><li> Establecer los parámetros para la adquisición. Un típico in vitro sagital exploración tendrá un tiempo de repetición de 1000 ms, tiempo de eco de 20-40 ms, grosor de corte de 0.5-1.0 mm, y campo de visión de 12x10 mm 2 con un tamaño de la matriz de 128x128 pixels. </li><li> Para los parámetros elastografía, ajustar la frecuencia de actuador para el valor determinado por la calificación vibrómetro láser Doppler. En el presente estudio, un par bipolar se necesitaba con una amplitud gradiente de 50 g / cm. Otros parámetros para ajustar incluyen el retraso que se debe establecer en cero milisegundos para la adquisición inicial. </li><li> Cambiar el generador de funciones a modo de ráfaga y ajustar los parámetros del generador de funciones para que coincida con los de los parámetros de adquisición de elastografía incluyendo la frecuencia y el número de ciclos. Además, establece la funciónción generador para ser disparado externamente. </li><li> Para obtener una imagen sagital, establezca la sensibilización de movimiento para estar en la dirección de corte positivo y comenzar la búsqueda. Tras la adquisición, comprobar la imagen y cambiar la sensibilización a la dirección de corte negativo. </li><li> Ejecutar el programa MATLAB que llevará a cabo la división complejo para la generación de la imagen de onda de corte. </li><li> Evaluar la imagen de la presencia de ondas de corte y objetos posibles, tales como ajuste de fase. </li><li> Si no hay ajustes a la imagen es necesario, ajustar el tamaño del parámetro de la matriz de ocho valores igualmente espaciados que van desde cero segundos para un periodo completo de la frecuencia de resonancia caracteriza. </li><li> Adquirir una exploración en ambas las orientaciones rebanada positivos y negativos. </li><li> Una vez que las imágenes se adquieren, utilizan un programa en MATLAB diseñada para la generación de los datos de ondas de corte de una serie de imágenes. </li></ol> 4. Experimento ERM Procesamiento de Imágenes <ol><li> Thpaso e final de la ERM es calcular la rigidez a cortante de las imágenes de ondas de corte. Colocar los datos en el programa de MATLAB que se evaluará el conjunto de datos en tres dimensiones (2 espacial, un temporal). </li></ol> Nota: Al asumir una onda transversal plana, las ecuaciones de movimiento que permite desacoplar la estimación de los módulo complejo con valores de cizalladura como una función del desplazamiento y su Laplaciano. El algoritmo se aproxima segundas derivadas espaciales con diferencias finitas y calcula el módulo de cizallamiento sobre una base pixel por pixel. A partir de este número complejo, muchos parámetros mecánicos se puede deducir tales como la velocidad de onda de corte, atenuación de la onda, la rigidez de cizallamiento, la elasticidad de cizallamiento, la viscosidad de cizallamiento, etc El algoritmo también permite la selección de las regiones de interés para los que la desviación media y estándar de cada parámetro se calcula. <ol start="2"><li> Los parámetros de imagen deben ser especificado al comienzo del programa. Además, ªlímite superior de la electrónica elastograma se puede ajustar para optimizar el contraste en la muestra. </li></ol> Nota: El programa ofrece los resultados intermedios (la onda después de filtros de paso bajo, ola tras el filtrado de dirección, temporal, FFT, perfiles de línea, etc) que ayudan al usuario calcular la fidelidad de la recuperación. <ol start="3"><li> Algunos parámetros se pueden ajustar sobre la base de esta información, tales como los niveles de filtros de paso bajo, la frecuencia temporal del movimiento, la dirección de propagación de la onda, etc La desviación estándar de un parámetro en una región específica de interés es también un indicador de la calidad del cálculo. </li></ol> 5. Los resultados representativos Figura 4 notas el cambio en las propiedades mecánicas a lo largo de cuatro semanas de desarrollo y construcción osteogénico adipogénica. ERM se realizó en 730 a 820 Hz. Mientras tanto las esponjas sembradas comenzó aproximadamente a las 3 kPa, osteogenic tejidos dirigidos dado lugar a una rigidez de 22 kPa, mientras que, los tejidos adiposos dirigido disminución de la rigidez a 1 kPa. Por otra parte, las construcciones osteogénicas mostró una notable disminución en el tamaño en comparación de principio a fin del estudio. Las propiedades adicionales derivadas de estudio elastografía se muestran en la Tabla 1. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. El proceso de adquisición de imágenes para elastografía por resonancia magnética. Durante la adquisición de la imagen, una secuencia de impulsos (a) controla la sincronización (b) del generador de funciones con los pulsos gradientes bipolar del equipo de resonancia magnética. Después de la adquisición de los gradientes bipolar activarse en orientaciones positivas y negativas, (c) una imagen de onda de corte se produce utilizando compleja división. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Diagrama de flujo del proceso de ERM para el motor de los tejidosconstrucciones Nimrais. En primer lugar, las células (a) son primero crecido y ampliado para el tamaño de la población esencial para el proyecto diseñado. Entonces las células se siembran (b) en un andamio biomaterial y reactivos químicos se aplican a la señal de diferenciación. Los andamios se caracterizan con MRE, cuya primera etapa (c) es la determinación de la frecuencia de resonancia del actuador acoplado a la construcción. Imágenes siguientes, MRI (d) son adquiridos para generar una imagen de onda de corte (e). Finalmente, un algoritmo se aplica para dar un elastograma (f) que los mapas de la rigidez de la construcción. Al mismo tiempo, las construcciones son seccionadas para la evaluación histológica (g) con el fin de validar la diferenciación. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Procedimiento actuador caracterización. El andamio gelatina está encerrada por un 0,5% en gel de agarosa. Para caracterizar el movimiento se transfiere a la muestra un ruido blanco se envía primero en el sistema(1a) y el movimiento resultante se detecta usando un láser Doppler Vibrómetro (1b). Una vez que la frecuencia de resonancia está determinada, una señal continua sinusoide a la resonancia (2a) se envía para determinar el desplazamiento (2b) transferido al medio ambiente gelatina. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Construir mapa de desarrollo a lo largo período de cuatro semanas. Adipogenic (A) y osteogénico (O) constructos se muestran de izquierda a derecha con una magnitud correspondiente y las imágenes de cizallamiento de onda, elastograma, y ​​la rigidez cortante promedio. El mapa de colores para los elastograma corresponde con el esquema de colores del gráfico de barras y barras de error representan la desviación estándar dentro de la región cada constructo de interés. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618Table1.jpg" alt="Tabla 1"/&gt; Tabla 1. Propiedades mecánicas de los constructos adiposo y osteo durante un período de cuatro semanas de crecimiento.

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	<li>Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tissue+engineering+using+magnetic+resonance+imaging.">Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging.</a> J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).</li><li>Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+microscopy+for+monitoring+osteogenesis+in+tissue-engineered+construct+in+vitro.">Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro.</a> Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).</li><li>Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+magnetic+resonance+elastography+(microMRE.">Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE.</a> Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).</li><li>Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+by+direct+visualization+of+propagating+acoustic+strain+waves.">Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves.</a> Science. 269, 1854-1857 (1995).</li><li>Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+monitoring+of+tissue+engineered+constructs.">Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs.</a> NMR Biomed. , (2011).</li><li>Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex-valued+stiffness+reconstruction+for+magnetic+resonance+elastography+by+algebraic+inversion+of+the+differential+equation.">Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation.</a> Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).</li><li>Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shear+wave:+comparison+to+a+dynamic+shear+material+test.">Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test.</a> Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).</li><li>Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+adipose+tissue+engineering+by+human+marrow+stromal+cell+seeded+gelatin+sponge.">Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).</li><li>Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+marrow-derived+mesenchymal+cell+porous+ceramic+composites+transplanted+subcutaneously:+effect+of+fibronectin+and+laminin+on+cell+retention+and+rate+of+osteogenic+expression.">Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression.</a> Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).</li><li>Marion, N. W., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+and+tissue+engineering.">Mesenchymal stem cells and tissue engineering.</a> Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).</li><li>Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+spin-echo+magnetic+resonance+elastography+of+the+brain.">Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain.</a> , 1647-1647 (2001).</li><li>Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+EPI+based+3D+MR+elastography+of+the+brain.">Fast EPI based 3D MR elastography of the brain.</a> , 3385-3385 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

En este procedimiento, el proceso de ERM para construcciones de ingeniería tisular se demuestra de preparación de células para la generación de una elastograma. Mediante la aplicación de un método no destructivo evaluación mecánica a la tubería ingeniería de tejidos, ahora es posible evaluar los cambios en las construcciones de ingeniería a lo largo de múltiples etapas de desarrollo. Además, ERM complementa otros métodos de resonancia magnética para el tejido de vigilancia construcciones de ingeniería ta...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> MSCGM Bullet-Kit </td><td> Reactivo </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 21600-010 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reactivo </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td> Almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> La dexametasona </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2915 </td><td></td></tr><tr><td> 3-isobutil-1-metilxantina </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I5879 </td><td> Almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> La insulina bovina páncreas </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td><td> Almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> La indometacina </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7378 </td><td></td></tr><tr><td> Β-glicerofosfato </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9891 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico 2-fosfato </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8960 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Andamio </td><td> Pharmacia &amp; Upjohn Co. </td><td> 09-0315-08 </td><td></td></tr><tr><td> Las células madre mesenquimales </td><td> Línea Celular </td><td> Lonza </td><td> PT-2501 </td><td></td></tr><tr><td> 9.4T MR escáner </td><td> Equipo </td><td> Agilent </td><td></td><td> 400MHz BM </td></tr><tr><td> 10 mm bobina Litz </td><td> Equipo </td><td> Doty Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibrómetro láser Doppler </td><td> Equipo </td><td> Polytec </td><td> PDV-100 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrosoft (20) </td><td> Software </td><td> Polytec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Generador de funciones </td><td> Equipo </td><td> Agilent </td><td> AFG 3022B </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Equipo </td><td> Piezo inc </td><td> EPA-104-115 </td><td></td></tr><tr><td> Piezo flexión del motor </td><td> Equipo </td><td> Piezo inc. </td><td> T234-A4Cl-203X </td><td></td></tr><tr><td> PC-Linux </td><td> Equipo </td><td> Procesador: Intel Core 2 Duo E8400 Memoria: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-Windows </td><td> Equipo </td><td> Procesador: Intel Core 2 Duo E8400 Memoria: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MATLAB </td><td> Software </td><td> Mathworks, Inc </td><td></td><td> 2009b </td></tr></tbody></table>

magnetic resonance elastography methodology for the evaluation of tissue engineered construct growth

Ensayos mecánicos tradicionales a menudo da como resultado la destrucción de la muestra, y en el caso de los tejidos a largo plazo diseñado construir estudios, el uso de la evaluación destructiva no es aceptable. Una alternativa propuesta es el uso de un proceso de imagen llamado elastografía por resonancia magnética. La elastografía es un método no destructivo para determinar el resultado de ingeniería mediante la medición de los valores locales de propiedad mecánica (es decir, complejo módulo de corte), que son esenciales para la identificación de marcadores de la estructura y funcionalidad de un tejido. Como un medio no invasivo para la evaluación, el seguimiento de las construcciones de ingeniería con técnicas de imagen como la resonancia magnética (RM) se ha visto un creciente interés en la última década 1. Por ejemplo, los de resonancia magnética (RM) las técnicas de difusión y relaxometría han sido capaces de caracterizar los cambios en las propiedades químicas y físicas durante el desarrollo de ingeniería tisular 2. El método propuesto enel protocolo siguiente, se utiliza elastografía microscópico resonancia magnética (μMRE) como una técnica no invasiva MR basado para medir las propiedades mecánicas de los tejidos blandos pequeñas 3. MRE se consigue mediante el acoplamiento de un actuador mecánico sónica con el tejido de interés y el registro de la propagación de la onda de cizallamiento con un escáner de RM 4. Recientemente, μMRE ha sido aplicada en la ingeniería de tejidos para adquirir información de crecimiento esencial que tradicionalmente se midió utilizando técnicas mecánicas destructivas macroscópicas 5. En el procedimiento siguiente, elastografía se logra mediante la formación de imágenes de construcciones de ingeniería con una modificación Hahn spin-eco secuencia junto con un actuador mecánico. Como se muestra en la Figura 1, la secuencia modificada de adquisición de imágenes se sincroniza con la transmisión de ondas de corte exteriores; posteriormente, el movimiento es sensibilizado a través del uso de la oscilación de los pares bipolares. Tras la recogida de las imágenes con movimiento positivo y negativo sensibilización, compleja división de los datos se encuentra una imagen de onda de corte. Entonces, la imagen se evaluó utilizando un algoritmo de inversión para generar un mapa rigidez cortante 6. Las mediciones resultantes en cada voxel se ha demostrado una correlación significativa (R 2&gt; 0,9914) con los datos recolectados a través de un análisis mecánico dinámico 7. En este estudio, la elastografía se integra en el proceso de desarrollo de los tejidos para el control de células madre mesenquimales humanas (h MSC) la diferenciación en las construcciones y adipogenic osteogénico, como se muestra en la Figura 2.

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Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

El procedimiento muestra la metodología de la elastografía por resonancia magnética para supervisar el desenlace de ingeniería de tejido adiposo y las construcciones de ingeniería tisular a través de osteogénicas evaluación no invasiva local de las propiedades mecánicas mediante la elastografía por resonancia magnética microscópica (μMRE).

Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

magnetic-resonance-elastography-methodology-for-evaluation-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K vistas.  University of Nebraska-Lincoln. El procedimiento muestra la metodología de la elastografía por resonancia magnética para supervisar el desenlace de ingeniería de tejido adiposo y las construcciones de ingeniería tisular a través de osteogénicas evaluación no invasiva local de las propiedades mecánicas mediante la elastografía por resonancia magnética microscópica (μMRE).

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Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

Bioluminiscencia de imágenes para la evaluación de la respuesta inmune después de la implantación de tejido cardiaco de Ingeniería (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Investigación

Bioingeniería

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocolo para la evaluación relativa hidrodinámico de Tri-lámina polimérica Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Técnica quirúrgica para la implantación de la ingeniería tisular injertos vasculares y posterior<em&gt; En Vivo</em&gt; Monitoreo

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Atímicos Rata Modelo de Evaluación de Ingeniería de ligamento cruzado anterior injertos

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complejo de polielectrolito para la unión a heparina de entrega osteogénico Factor de Crecimiento de dominio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Apoyo metabólico de suprimidos, los tejidos de cerebro vivos durante la adquisición de la microscopía de resonancia magnética

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue shape. Manipulating tissue shape on the micrometer to centimeter scale can direct cell alignment, alter effective mechanical properties, and address limitations related to nutrient diffusion. In addition, the vessel in which a tissue is prepared can impart mechanical constraints on the tissue, resulting in stress fields that can further influence both the cell and matrix structure. Shaped tissues with highly reproducible dimensions also have utility for in vitro assays in which sample dimensions are critical, such as whole tissue mechanical analysis.
This manuscript describes an alternative fabrication method utilizing negative master molds prepared from laser etched acrylic: these molds perform well with polydimethylsiloxane (PDMS), permit designs with dimensions on the centimeter scale and feature sizes smaller than 25 &#181;m, and can be rapidly designed and fabricated at a low cost and with minimal expertise. The minimal time and cost requirements allow for laser etched molds to be rapidly iterated upon until an optimal design is determined, and to be easily adapted to suit any assay of interest, including those beyond the field of tissue engineering.

Herein we present a rapid, facile, and low-cost method for fabricating custom polydimethylsiloxane molds that can be used for producing hydrogel-based engineered tissues with complex geometries. We additionally describe results from mechanical and histological assessments conducted on engineered cardiac tissues produced using this technique.

Custom diseñado moldes de cultivo de tejidos de maestros grabado a láser

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Fabricación de Aorta Abdominal hidrogel de tejido imitando fantasmas para la validación de la elastografía de ultrasonido

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...