Nuestra plataforma utiliza tejidos musculares diseñados en 3D y hardware de detección magnética para medir la contractilidad en 24 pozos simultáneamente. Esto proporciona un método de mayor rendimiento para evaluar nuevas terapias in vitro utilizando tejidos musculares humanos. Nuestro método de fundición mejora la consistencia y la reproducibilidad en la fabricación de tejidos musculares diseñados en 3D.
Hemos diseñado una placa de fundición consumible de 24 pocillos equipada con hardware de detección magnética para mediciones y análisis de contractilidad en nuestra plataforma. Este método puede proporcionar información valiosa sobre el modelado de enfermedades in vitro, el descubrimiento de fármacos y la terapia génica para cualquier enfermedad muscular que afecte la contractilidad. Actualmente estamos incorporando neuronas motoras en nuestras construcciones 3D para crear un modelo de unión neuromuscular también.
Para comenzar, coloque un kit de fundición de tejido preenfriado en un bloque frío o hielo dentro de la campana de cultivo celular. Coloque la placa de fundición plana sobre hielo. Agregue trombina al medio base para hacer la solución de trombina y mueva la red posterior de la placa de fundición a una nueva placa estéril de 24 pocillos.
Pipetear 50 microlitros de solución de trombina en cada pocillo preenfriado de la placa de fundición y volver a colocar la celosía en el kit. Coloque el kit de fundición a un lado en hielo. Luego, agregue 500 mililitros de RPMI medio, 10 mililitros de B27 y 2.5 gramos de ácido aminocaproico, o ACA, para preparar el medio EMT cardíaco.
Saque el medio EMT que se utilizará para moldear los tejidos y agréguele 10 inhibidores micromolares de ROCK. Prepare el medio EMT esquelético agregando 50 mililitros de medio F10 y 0.25 gramos de ácido aminocaproico, o ACA, para mioblastos primarios. Use 0.1 gramos de ACA para los mioblastos derivados de IPSC.
Luego, filtre estéril el medio de fundición que contiene ACA. Caliente el reactivo de disociación de grado de cultivo celular y un volumen igual de EMT medio a 37 grados centígrados. Este medio EMT calentado se utilizará para diluir el reactivo de disociación.
Lave las células con PBS y agregue el reactivo de disociación calentado para levantar las células. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos o hasta que las células se hayan levantado y comprobar los cultivos cada dos o tres minutos golpeando el costado de la placa. Una vez que las células se hayan levantado, transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros.
Triturar con una pipeta P-1000 para asegurar una suspensión de una sola celda. Lavar la placa y el matraz con un medio EMT adicional para recoger las células restantes y añadirlas al tubo cónico. Una vez más, triture las celdas para garantizar una suspensión de una sola celda.
Agregue medio EMT para terminar el proceso de disociación y luego tome muestras de las suspensiones celulares para los recuentos celulares. Realice recuentos celulares utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro en azul de tripano. Gire las células a 200 G durante cuatro minutos, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en cinco mililitros del medio base EMT para eliminar el reactivo de disociación residual.
Después de centrifugar nuevamente durante cuatro minutos, aspire el sobrenadante y prepare las suspensiones celulares a las densidades apropiadas. Calcule los volúmenes de cada solución celular necesarios para formar el número deseado de tejidos y pipete los volúmenes calculados de células en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue 10 microlitros de fibrinógeno por EMT a la suspensión celular y colóquelo en hielo.
Asegúrese de que cada EMT tenga 90 microlitros de suspensión celular, 10 microlitros de fibrinógeno y 50 microlitros de solución de trombina en la construcción final del tejido. En una campana de cultivo celular, retire la tapa del kit de fundición de tejido y coloque la placa de fundición con la celosía de postes sobre el hielo. Mezcle la mezcla de fibrinógeno celular y extraiga 100 microlitros con una pipeta P-200.
Agregue 100 microlitros de la mezcla a los pocillos preparados con 50 microlitros de solución de trombina y triture cinco veces para mezclar bien. No empuje la pipeta más allá de la primera parada y retire la punta después de la trituración para evitar la creación de burbujas. Mezcle la suspensión celular en el tubo cónico antes de fundir cada tejido.
Sostenga tanto la celosía como la placa de pozo de fundición simultáneamente usando el dedo índice y el pulgar de una mano para evitar cualquier movimiento de la celosía o deje la placa plana sobre hielo y balancee el cubo de hielo para ver dentro de la placa de fundición. Repita con una punta P-200 fresca para cada tejido hasta que todos los tejidos estén fundidos. Transfiera cuidadosamente el kit con semillas a la incubadora e incube a 37 grados centígrados durante 80 minutos.
A continuación, prepare una placa fresca de 24 pocillos con dos mililitros por pocillo del medio EMT para tejidos cardíacos e incube la placa a 37 grados centígrados para calentar el medio. Después de la incubación de 80 minutos, agregue suavemente un mililitro del medio EMT al borde de los pocillos de fundición e incube durante otros 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de 10 minutos de incubación, levante con cuidado la celosía posterior y transfiera los tejidos de la placa de fundición a una placa preparada de 24 pocillos con el medio calentado.
Finalmente, devuelva las placas con tejidos a la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados. La producción fallida de EMT puede variar desde fallas catastróficas como el desprendimiento de tejido de los postes, hasta defectos estructurales más sutiles, como burbujas de aire y deposición desigual de tejido alrededor de ambos postes. La construcción de EMT un día después de la fundición se muestra aquí.
Los tejidos del músculo esquelético se transfirieron a un medio de diferenciación a partir del día cero de la fusión celular y la compactación del hidrogel. Desde el séptimo día hasta el día 28, el mismo EMT mostró una longitud total ligeramente más corta entre los dos postes y un ancho más pequeño cuando se midió a través de la sección central del EMT. Se rastrearon cuatro placas de tejidos durante 21 días comparando el diámetro de EMT durante toda la compactación.
Los puntos de tiempo muestran un tamaño EMT consistente entre las placas. La compactación máxima se alcanza el día 21 a medida que se estabiliza la remodelación de la matriz. La inmunohistoquímica de los EMT se representa aquí.
Los EMT se fijaron en el día 10 de cultivo y se incrustaron en parafina. Las secciones transversales delgadas se tiñeron con anticuerpos contra la cadena pesada de miosina y la distrofina antes de la obtención de imágenes. Estas imágenes gráficas representan la fuerza de contracción absoluta promedio medida a partir de los EMT cardíacos y los EMT esqueléticos a lo largo del tiempo.
El tratamiento con doxorrubicina aguda y crónica en tejidos cardíacos diseñados se muestra aquí. Se administraron tres concentraciones de dosis diferentes de Dox en bolo o se administraron continuamente a tejidos cardíacos diseñados en el transcurso de 27 días. La respuesta a la dosis de BDM en tejidos musculares esqueléticos diseñados se presenta en esta figura.
La frecuencia cardíaca o la frecuencia de contracción cesa de manera dependiente de la dosis junto con un cese de la fuerza contráctil, lo que indica cardiotoxicidad cuando los EMT están expuestos a este compuesto. Las cosas más importantes que debe recordar al fundir los pañuelos de papel son mantener todo frío en todo momento, incluida la suspensión celular y los reactivos, y mantener la celosía completamente estacionaria una vez que comience el yeso.
