Agradecemos la compartición de código abierto de MATLAB código partícula de seguimiento proporcionado por Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), junto con el código IDL antes y una extensa documentación proporcionada por John C. Crocker y Eric R. Weeks. Este trabajo fue posible gracias al financiamiento del Instituto Nacional del Cáncer (NCI / NIH), K99CA155045 y R00CA155045 (PI: JPC).

1. Esferoides tumorales cultivo <ol><li> Mezclar 10 ml de agua de grado de cultivo de células con 0,1 g de agarosa para obtener una solución de agarosa al 1%. </li><li> Solución de agarosa de calor por encima de 70 ° C (más o menos 14 segundos en un horno de microondas estándar o mediante el uso de una placa de calentamiento) antes de alícuotas de 40 l de solución de agarosa en un pocillo en una placa de 96 pocillos. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante al menos 1 h mientras la cosecha de las células utilizando técnicas estándar. </li><li> Utilice un hemocitómetro para determinar la concentración de células en la suspensión. </li><li> Diluir la suspensión de células a 1000 células / ml y añadir 100 l de esta dilución a la bien que contiene el lecho de agarosa curado. </li><li> Colocar la muestra en un agitador durante la noche en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Quitar la muestra de coctelera y añadir 100 ml de medio de cultivo celular. </li><li> Incubar esferoides hasta que se alcanza el diámetro deseado. Por ejemplo, después de 9 días, un spHeroid habrá aproximadamente 450 m de diámetro. Durante este tiempo, el medio de crecimiento fresco puede ser añadido a los pozos de aspiración, pero se debe evitar ya que esto resultará en la eliminación del esferoide. </li></ol> 2. Preparación esferoides tumorales 3D incrustados en ECM <ol><li> Preparar una estación de trabajo con los materiales necesarios dentro de una campana de flujo laminar. </li><li> Prepare una mezcla diluida de 1 m de diámetro sondas trazadores fluorescentes modificado carboxilato añadiendo sondas 2 piezas de stock (2% de sólidos) a 25 partes de agua estéril. </li><li> Quitar una botella de 3,1 mg / ml de colágeno bovino de la nevera y colóquelo sobre hielo. </li><li> Alícuota de 125 l de colágeno en un vacío vial de 2 ml. </li><li> Añadir 50 l de solución de sonda de trazador diluido al vial que contiene el colágeno y agitar brevemente para distribuir sondas. </li><li> Añadir 235 l de medio de cultivo celular apropiado que contiene rojo de fenol (que se convertirá amarillo) para un volumen total de 410 ml y agitar brevemente antes de retirar 205 ml (la mitad del volumen total) y colocándolo en un nuevo vial de 2 ml. Vial 1 contendrá el esferoide tumoral y Vial 2 será una mezcla de control. </li><li> Añadir ~ 2 l de 1 M de NaOH al vial 1 para llevar la solución de nuevo a pH neutro (medios de cultivo que contienen rojo de fenol deben volver a rojo). Tenga en cuenta que esto hará que la mezcla para iniciar el curado si no se mantiene en hielo. Vortex brevemente para mezclar, y luego volver a una rejilla de hielo inmediatamente. NOTA: El esferoide es apenas visible a simple vista después de 9 días de cultivo y su retirada de la cama de agarosa es una tarea delicada. El uso de un microscopio de disección puede ser útil para algunos usuarios. El mantenimiento de la integridad del esferoide durante la transferencia es de suma importancia. </li><li> Con una punta de pipeta de boca ancha, retire suavemente 40 l de los medios de comunicación desde el pozo que contiene el esferoide tumor. Conserve este 40 l, mientras que la realización de la siguiente etapa. </li><li> Compruebe el pozo para ver si el esferoidefue eliminado en el paso anterior. Si lo fuera, añadir los 40 l que contenía el esferoide al vial 1. Si no, coloque los 40 l atrás en el bien y repita el paso anterior. </li><li> Revuelva suavemente Vial 1 (no se arriesgue a vórtex, se puede dañar el esferoide) antes de transferir la mezcla en 60 porciones mu l en tres pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Inspeccionar cada pocillo con un microscopio después de la adición de la mezcla para determinar que bien contiene el esferoide. </li><li> Añadir ~ 2 l 1 M de NaOH y 40 l de medios de cultivo celular a Vial 2 y un vórtex antes de alícuotas 60 l de esta mezcla a un vacío bien en la placa de 96 pocillos y etiquetado como control. </li><li> Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C para curar durante al menos 1 hora. </li></ol> 3. Construir rejilla de puntos muestrales y Tomar un video en cada punto <ol><li> Transfiera la placa de la muestra de la incubadora a la platina del microscopio. Permita 10 minutos para que la muestra equilibrate con la temperatura ambiente si una etapa caliente no está disponible. </li><li> Observar la muestra con lentes de objetivo de baja potencia para asegurarse de que está intacto y listo para la imagen. Determinar la posición del tumor dentro del pozo. </li><li> Decida cuántos puntos de muestra a tomar. Por lo general, 20 puntos de muestreo en cada pocillo, distribuidos en anillos concéntricos alrededor del esferoide producirán resultados debidamente detalladas. </li><li> Mueva el escenario para cada posición deseada y utilice el microscopio interfaz de software para registrar las coordenadas X e Y (o registro de las coordenadas manualmente en caso de interface de software no está disponible). </li><li> Encienda el microscopio a una lente de objetivo de alta potencia (típicamente 100X), y seleccione el cubo de filtro apropiado para la longitud de onda de excitación de las sondas de rastreo. Use la lista de puntos creados en el paso 3.4 para mover al primer punto de la cuadrícula. </li><li> Ajuste el enfoque para encontrar el fondo del pozo, y luego moverse hacia arriba para encontrar un campo de visión (FOV) que contiene varios trac de enfoqueer sondas. </li><li> Observe el histograma de intensidad y ajustar la intensidad y el tiempo de exposición para obtener el mayor rango dinámico posible al tiempo que garantiza que la imagen no se convierte en saturada. </li><li> Obtener una secuencia de vídeo a una velocidad de 20 a 30 milisegundos por cuadro (aproximadamente 800 marcos o 16-24 segundos de longitud se recomienda para proporcionar estadísticas suficientes para el cálculo MSD robusta equilibrio con la necesidad de reducir al mínimo el tiempo de adquisición en cada punto de la malla espacial) y guardar con una convención apropiada. Durante la grabación, no toque el microscopio o una mesa. </li><li> Repita los pasos 3.6 hasta 3.9 por cada punto de muestra en la cuadrícula. </li><li> Repita los pasos 3.3 a 3.10 para cada pozo en el experimento. </li></ol> 4. Análisis de los datos de vídeo para Calcular Propiedades reológicas en cada punto de muestra <ol><li> Copie todos los datos de vídeo a una carpeta de análisis (posiblemente en un equipo diferente). </li><li> Importar datos de imagen en MATLAB u otro software de análisis. NOTE: Amplia documentación relativa al conjunto de MATLAB rutinas de seguimiento de partículas adoptadas aquí está disponible en <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Se recomienda el uso de una función de llamada personalizados para automatizar el procesamiento de múltiples archivos en diferentes posiciones. </li><li> Calibrar el software mediante el análisis de varios fotogramas de vídeo para determinar adecuadamente los parámetros de selección y rechazo (tamaño, de paso de banda, etc) para la identificación de las posiciones del centro de la sonda. Amplia fondo de estos pasos cruciales es descrito por Crocker y Grier. </li><li> Utilice el software para determinar automáticamente cada posición de la sonda para todos los fotogramas de vídeo y luego vincular estas posiciones en las trayectorias. </li><li> Utilice los datos de trayectoria para calcular la media al cuadrado de desplazamiento (MSD) como una función del tiempo de retraso, asegurándose de aplicar el factor de calibración espacial apropiada (m por píxel) para la lente de objetivo específico, cualquier pixel binning, etc (típicamente llevadoen los metadatos). </li><li> Calcular G * (usando la generalizada relación de Stokes-Einstein tienen en cuenta los límites de aplicabilidad de GSER para una determinada muestra de 24,28,43. Alternativamente, los usuarios pueden querer interpretar propiedades ECM directamente desde MSD simplemente comparando la escala de ley de potencia, meseta valores, índices de heterogeneidad u otros parámetros. </li><li> Repita los pasos 4.2 a 4.6 por cada fov en el experimento. </li><li> Co-registro de datos de posición desde el paso 3.4 con modulii viscoelásticas a una frecuencia particular de interés. Dependiendo del fabricante del microscopio utilizado, este paso puede ser facilitada por una rutina personalizada que lee los metadatos microscopio o posición de los datos pueden ser tabulados manualmente. </li><li> Uso de las funciones de interpolación 3D para generar un mapa de la reología espacial de la ECM. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

En este protocolo se introduce una estrategia sólida y de aplicación general para el seguimiento longitudinal cambios locales en la rigidez ECM en modelos de tumores en 3D. Tenemos la visión de que esta metodología podría ser adoptada por los biólogos del cáncer y biofísicos interesados ​​en el comportamiento mechanosensitive implicados en la remodelación de la matriz durante el crecimiento del tumor y de los procesos de invasión. La cuantificación precisa de la cinética de degradación de la matriz podr...

Pues bien, de un creciente cuerpo de evidencia en la literatura que las células cancerosas, al igual que las células epiteliales de mamíferos no malignas, son muy sensibles a las propiedades mecánicas y biofísicas de la matriz extracelular circundante (ECM) y otros componentes del microambiente 1-9. Estudios mecánicos elegantes han proporcionado ideas sobre el papel de la rigidez extracelular como socio de señalización mechanosensitive complejo que regula el comportamiento maligno de crecimiento y la morfogénesis 2,3,10,11. Esta labor se ha visto facilitada en particular, por el desarrollo del 3D en modelos tumorales in vitro que restauran la arquitectura del tejido biológicamente relevante y se pueden cultivar en materiales de andamiaje con la mecánica sintonizables y imágenes de microscopía óptica 12-19. Sin embargo, el otro lado de este cuadro de diálogo mechanoregulatory entre el tumor y el microambiente, a través del cual las células cancerosas, a su vez modificar la reología de su entorno, sigue siendo algomás difíciles de estudiar. Por ejemplo, durante los procesos de invasión, las células en la periferia de un tumor pueden someterse a transición epitelial a mesenquimal (EMT) y aumentar la expresión de metaloproteasas de la matriz (MMPs) que causan la degradación local de la ECM 20-22, que a su vez influye en el comportamiento de crecimiento de mechanosensitive otras células tumorales proximal. A través de una variedad de procesos bioquímicos, células de cáncer de marcar continuamente la rigidez local de su entorno arriba y hacia abajo para adaptarse a diferentes procesos en diferentes momentos. La metodología descrita aquí está motivada por la necesidad de instrumentos de análisis que reportan los cambios locales en la rigidez y el cumplimiento de la MEC durante el crecimiento, que se pueden integrar con modelos de tumores en 3D y correlacionados longitudinalmente con cambios bioquímicos y fenotípicas sin interrumpir la cultura. En busca de una técnica apropiada para aplicar en este contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) se perfila como un fuerte candidato.Este método, pionero originalmente por Mason y Weitz 23,24, utiliza el movimiento de las sondas de rastreo incrustados en un fluido complejo reportar el módulo complejo dependiente de la frecuencia de cizalla viscoelástico, G * (ω) a escalas de longitud de micras. Este enfoque general ha sido desarrollado con múltiples variaciones adecuadas para diferentes aplicaciones en-suaves de la Materia Condensada, coloides, la biofísica y la física de polímeros 25-31. PTM tiene ciertas ventajas con respecto a otros métodos, ya que las lecturas de la viscoelasticidad local son proporcionados por formación de imágenes de vídeo no destructivo de las sondas de trazador bioquímicamente inactivos que se incorporan en el momento de preparación de cultivo y permanecen en su lugar durante largos períodos de crecimiento. Esto está en contraste con las medidas estándar de oro con un reómetro de cizalla oscilatoria a granel, lo que necesariamente requiere la terminación de la cultura y de los informes de la reología macroscópica grueso de la muestra en lugar de mediciones puntuales dentro del complejo microenvir tumor 3DAMBIENTE. De hecho, un número de estudios han demostrado la utilidad de la interpretación de las mediciones de movimientos de la sonda trazador en o alrededor de las células cancerosas o no cancerosas para medir deformaciones asociadas con la migración celular 32, la tensión mecánica inducida por un esferoide expansión 33, reología intracelular 34,35, y para asignar cargas mecánicas en la ingeniería de tejidos 36, y la relación entre el tamaño de los poros y la velocidad de invasión 37. Otras técnicas adecuadas para microrheology, tales como la microscopía de fuerza atómica (AFM) se pueden implementar, pero principalmente para sondear los puntos en la superficie de la muestra y también pueden plantear problemas de esterilidad de la cultura que complican las mediciones longitudinales 38. Aquí se describe un protocolo integral métodos para el crecimiento de esferoides tumorales 3D adecuados para su transferencia a ECM con sondas fluorescentes incrustados para vídeo partícula de seguimiento y análisis de métodos para mapear fiablemente espacial que abarcacambios en microrheology largo del tiempo en la cultura. En la presente aplicación, modelos de tumores 3D se cultivan en formato de múltiples pocillos con vistas a la incorporación de mediciones microrheology con otros ensayos tradicionales (por ejemplo, citotoxicidad) que este formato es propicio para. En esta ilustración representativa de esta metodología de cultivo in vitro esferoides 3D utilizando células PANC-1, una línea celular de cáncer de páncreas establecidos conocidos para formar esferoides 39, pero todas las mediciones descritas en este documento son ampliamente aplicables al estudio de tumores sólidos usando una variedad de líneas celulares adecuados para el cultivo en 3D. Debido a que este método se basa formación de imágenes de sí que es ideal para el co-registro de los datos microrheology alta resolución con grandes campos de luz transmitida de vista que informan de cambios en el crecimiento celular, la migración y el fenotipo. La implementación de PTM integrado con microscopía de luz transmitida de esta manera asume el posicionamiento reproducible de los qu platina del microscopioich suele estar disponible en los microscopios biológicos epifluorescencia widefield comercial motorizados. El protocolo desarrollado a continuación se puede implementar con cualquier microscopio biológico de fluorescencia automatizado razonablemente equipadas. Este es un método intensivo de datos inherente, lo que requiere la adquisición de gigabytes de datos de microscopía de vídeo digitales para el procesamiento fuera de línea. En el siguiente protocolo, Protocolo 1 se refiere a la preparación inicial de esferoides tumorales que se describe aquí el uso de superposición en agarosa, pero podría estar sustituidos con una variedad de otros métodos tales como la gota que cuelga 40, o cultivo rotatorio 41 técnicas. Protocolo 2 se describe el proceso de integración de esferoides en una estructura de colágeno, aunque, alternativamente, in vitro tumores en 3D podrían ser cultivadas mediante encapsulación o la incrustación de células resuspendidas en ECM 12,15, en lugar de esferoides no adherentes individuales pre-formadas. Protocolos posteriores describen procedimientos para obtaining mediciones microrheology tiempo de resolverse mediante la adquisición y procesamiento de datos de microscopía de vídeo, respectivamente. El procesamiento de datos se describe utilizando MATLAB, haciendo uso de las rutinas de código abierto para el PTM construido en algoritmos descritos originalmente por Crocker y Grier 42, que también se han desarrollado ampliamente para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semana / idl /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

La mecánica microambiente se ha demostrado que actúa como un regulador crucial del comportamiento de crecimiento del tumor y de señalización, que es en sí remodelado y modificadas como parte de un conjunto de, interacciones de dos vías mechanosensitive complejos. Si bien el desarrollo de modelos de tumores en 3D biológicamente relevantes han facilitado estudios mecánicos sobre el impacto de la reología de la matriz en el crecimiento del tumor, el problema inverso de la cartografía de los cambios en el entorno mecánica inducida por tumores sigue siendo un reto. Aquí, se describe la aplicación de partículas de seguimiento de microrheology (PTM) en conjunción con modelos 3D de cáncer de páncreas como parte de un enfoque sólido y viable para el seguimiento longitudinalmente cambios físicos en el microambiente del tumor, in situ. La metodología descrita aquí se integra un sistema de preparación in vitro en modelos 3D incrustados en un modelo de matriz extracelular (ECM) andamio de colágeno de tipo I con sondas marcadas con fluorescencia distribuidos de manera uniforme para POsición y mediciones microrheology dependientes del tiempo a lo largo de la muestra. tumores in vitro están chapados y probaron en condiciones paralelas utilizando placas de imagen de múltiples pocillos. Sobre la base de los métodos establecidos, videos de los movimientos de la sonda de rastreo se transforman a través de la Relación Generalizado Stokes Einstein (GSER) para reportar el módulo de cizallamiento complejo viscoelástico dependiente de la frecuencia, G * (ω). Debido a que este enfoque es a base de formación de imágenes, caracterización mecánica también se proyecta sobre grandes campos espaciales de luz transmitida a reportar simultáneamente cambios cualitativos en el tamaño del tumor 3D y fenotipo. Los resultados representativos que muestran contraste respuesta mecánica en sub-regiones asociadas con degradación de la matriz localizada inducida por invasión-, así como la calibración del sistema, se presentan los datos de validación. También se presentan los resultados no deseados de los errores experimentales comunes y solución de problemas de estos temas. El formato de chapado cultura 3D de 96 bien implementado en este protocolo es conducive a la correlación de las mediciones microrheology con ensayos de cribado terapéuticos o de imagen molecular para obtener nuevos conocimientos sobre el impacto de los tratamientos o estímulos bioquímicos en el microambiente mecánico.

Para verificar la validez de G * (ω) mediciones en las posiciones localizadas dentro de un complejo microambiente tumoral modelo, se realizaron dos experimentos iniciales de validación. En primer lugar, hemos tratado de validar nuestras medidas contra el &quot;estándar de oro&quot; de reometría cizalla oscilatoria granel. Hemos preparado muestras idénticas de matriz de colágeno (sin células) a una concentración de 1,0 colágeno mg / ml. Estas muestras se probaron con un reómetro mayor (TA Instruments A...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K vistas.  University of Massachusetts Boston.  Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D. 

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Investigación

Bioingeniería

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

La mejora en 2D y 3D de la piel<em&gt; In Vitro</em&gt; Uso de modelos macromoleculares hacinamiento

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricación de un hidrogel de derivados de matriz extracelular renal corteza

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

Las matrices de hidrogel permiten un mayor rendimiento para los efectos de detección de los componentes de la matriz y la terapéutica en modelos tumorales 3D

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...