Este trabajo fue apoyado por becas de los Knut y Alice Wallenberg. El personal entero de la proteína humana centros de Atlas en Uppsala, Estocolmo y la India son reconocidos por sus esfuerzos para generar el Atlas de proteínas humanas. Los autores desean agradecer especialmente a Frank Hammar y Gustafsson Sofie para obtener ayuda con las fotos y Karlberg Elene para obtener ayuda con la producción de TMA en los rodajes.

1. Cómo preparar los tejidos para la producción de microarrays de tejidos (Animación 1) <ol><li> Seleccione el material pertinente formol fija parafina incrustado (muestras de tejido o célula), incluyendo la sección de tejido correspondiente hematoxilina manchado. </li><li> Marcar área correspondiente de la sección de tejido. Se recomienda tener un recién cortado la sección teñida con hematoxilina correspondiente al bloque de parafina. </li><li> Diseño de la plantilla que se utiliza para la producción de TMA. Selección aleatoria de las muestras dentro de la plantilla para evitar los artefactos causados ​​por problemas técnicos, como la cobertura de los anticuerpos en toda la sección TMA y los problemas de seccionamiento. Agregar marcadores adicionales de orientación a la plantilla para la orientación. </li><li> Organizar los tejidos de acuerdo a la plantilla. </li></ol> 2. Tejido Manual de Producción de microarrays (esencial para la filmación) <ol><li> Para poder obtener una longitud normalizada de los núcleos de tejido, marcar el estilete por ejemplo 4,5 mm (Figura 2). Guidelines de distancia entre ejes de la muestra: tamaño del núcleo de 0,6 mm - 0,8-1,0 mm centrales de tamaño 1.0 mm - 1,8-2,0 mm tamaño del núcleo de 1,5 mm - 2,0-3,0 mm núcleo de tamaño de 2,0 mm - 2,5-4,0 mm Se recomienda dejar 2,5-3,0 márgenes mm en cada lado del bloque de parafina para evitar el agrietamiento de la parafina. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montar los golpes seleccionados para ser utilizados. Comience por aflojar los tornillos de cabeza hueca hexagonal que sostiene el golpe en su lugar. El punzón está en posición correcta cuando la ranura en el centro punzón está firmemente colocado contra la barra de metal en el plástico de v-bloque. Fijar los tornillos y asegurarse de que el borde del clip metálico es horizontal. </li><li> El golpe receptor (marcado en verde y rojo, específica para el distribuidor) debe ser colocado a la izquierda. El punzón donante (marcado en verde y azul, específico para el distribuidor), que tiene un diámetro ligeramente mayor, se debe colocar a la derecha (figura 3). </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Mueva los golpes a lo largo de los x-e y los ejes mediante el uso de los botones de ajuste XY. La perilla de ajuste de la derecha mueve los golpes a lo largo del eje X y el botón de ajuste de la izquierda se mueve los golpes a lo largo del eje. Hay una lectura micrómetro digital en ambos mandos de ajuste. Estos se activan cuando se mueve los mandos. </li><li> Restablecer → pulse el botón ZERO / ABS. Cambio entre pulgadas y mm → pulse el botón IN / mm botón. El espacio entre los agujeros deben ser de 2,0 mm (medida entre los centros de los agujeros) cuando se utiliza un punzón 1 mm para una plantilla de 9x8. </li></ol></li><li><ol class="lalpha"><li> Para asegurarse de que no insista en el golpe demasiado abajo en el bloque, llegando a la bandeja y la destrucción de la perforadora, poner un casete sin la parafina en el soporte y fijar la posición de fondo del recipiente golpe a 1 mm por encima de la parte inferior de la bandeja mediante el tornillo de tope de profundidad en elesquina superior izquierda de la Z-guía (Figura 3). </li><li> Coloque el bloque receptor en el soporte y utilizar la menor destornillador para apretar los tornillos. No apriete los tornillos demasiado apretada o la parafina podría liberarse de la cinta. </li><li> Empuje el golpe receptor hacia abajo aproximadamente 5 mm en el bloque receptor y usar el mango en el golpe para hacer girar el punzón de ida y vuelta una vez (Figura 3). El agujero será de 5 mm de profundidad al empujar el punzón tan abajo en el bloque como sea posible. </li><li> Aliviar la presión hacia abajo empuja lentamente, de modo que los resortes se puede mover el punzón hacia arriba. Utilice el estilete para vaciar el punzón y sacarles las semillas de parafina. </li></ol></li><li> Mover la torreta para cambiar a la donante punzón (Figura 3). </li><li> Coloque el puente bloque donante con el bloque de donantes sobre el soporte del bloque receptor (Figura 3). </li><li><ol class="lalpha"><li> Empuje la punción de los donantesh en el área seleccionada del bloque donante. Utilizar una correspondiente hematoxilina y eosina diapositiva manchado donde ha sido la región de interés marcado para localizar el tejido que es objeto de muestreo. Manual de mantener el bloque de los donantes en la posición con la mano izquierda y empuje el golpe con la mano derecha. Tenga en cuenta que no debe presionar sobre el estilete. El tope de profundidad no bloquea el movimiento de golpe en la posición adecuada para el bloque de los donantes, por lo que es importante que dejas de empujar cuando la segunda marca es visible en el estilete. </li><li> Gire el mango en el golpe una vez (Figura 3). Suelte lentamente la presión a la baja, mientras que mantiene el bloque de los donantes en el puente de bloqueo de los donantes. </li><li> El tejido del donante está preferiblemente perforada 0,5 mm más corta que el núcleo receptor. Este proceso se asegurará una alineación ajustable de los núcleos en la superficie del bloque receptor, evitando la pérdida de tejido representante valioso. </li></ol></li><li> Quitar el puente y el bloque de donantes. Hacerasegurarse de que el donante punzón está alineado con el agujero que se hizo anteriormente (punto 4). Debe ajustar la posición de perforación utilizando los tornillos de fijación si el golpe de los donantes y el agujero en el bloque receptor no están alineados. </li><li> Cuidado empuje el punzón hacia abajo hasta que su punta alcanza la parte superior del agujero en el bloque receptor. Mientras se mantiene esta posición, utiliza el estilete para vaciar el núcleo de tejido en el agujero. La superficie del núcleo debe estar en alineación con la superficie del bloque. </li><li> Vuelva a colocar el revólver con el punzón destinatario. </li><li> Mover a la siguiente posición con los botones de ajuste XY. </li><li> Repetir desde el punto 4c anteriores hasta que la matriz es completa. </li><li> Cuando el bloque receptor de que se complete, afloje los tornillos en el soporte del bloque receptor. Hornee el bloque de 42 ° C durante 40 minutos. Colocar el bloque con el área de seccionamiento hacia abajo sobre un portaobjetos de vidrio. Colocar la placa de vidrio con el bloque en la parte superior de un soporte para tubos de ensayo (o de construcción adecuado) y el lugar en tél horno. Después de la cocción, quitar el soporte del tubo de ensayo del horno y aplanar la superficie del bloque por acariciando suavemente el portaobjetos de vidrio. </li><li> Coloque el bloque con la placa de vidrio sobre una placa de enfriamiento durante 10 minutos. Para asegurar el tejido representante de todo el TMA un control de calidad en cada sección de 50 º se lleva a cabo. </li></ol> 3. Cómo TMA Sección (Animación 2) <ol><li> Cortar 4 micras de grosor, con un microtomo con el sistema de transferencia de la sección (SM 355S, Microm). El sistema puede ser utilizado con todos los microtomos rotativos de corriente. El sistema consta de un soporte de cuchilla con puente de transferencia integrado, un baño de agua caliente y una unidad de control. De la hoja de las secciones se deslizan sobre la superficie de transferencia húmedo a través de un puente de transferencia en el baño de agua. </li><li> Las secciones se deben tomar de un baño de agua inmediatamente después de haber tendido, para evitar la fusión de los puntos sensibles del tejido (tejidos ej. ricas en lípidos como el pecho y el cerebro). Place la sección sobre un portaobjetos de vidrio SuperFrost. El tiempo de las secciones puede ser dejado en el agua depende del tipo de parafina encerado utilizado y la temperatura del agua. Nuestro uso de laboratorio de cera de parafina de HistoLab Products AB, que tienen un punto de fusión de 56-58 ° C y se recomienda una temperatura de baño de agua de 37-39 ° C. </li><li> Colocar los portaobjetos en un soporte de diapositivas para el secado de la temperatura ambiente (TA) durante la noche. </li><li> Los portaobjetos se cuecen en 50 ° C durante 12-24 horas. El uso de un micrótomo STS, sin que usted tenga para el transporte de la sección de la hoja de un baño de agua de forma manual, por ejemplo usando un pincel. </li></ol> 4. Prueba y Procedimiento de valoración de inmunohistoquímica (Animación 3) Cada anticuerpo se somete a un procedimiento de ensayo normalizado utilizando especialmente diseñados TMA que contienen una mezcla de tejidos y diferentes tipos de células. El objetivo es evaluar un protocolo de inmunotinción individual y optimizado para cada anticuerpo. Inicialmente una dilución, basado en hormigaconcentración ibody de stock del anticuerpo primario se ensaya. El resultado de esta prueba de tinción se utiliza para guiar a otras diluciones y la optimización del protocolo. <ol><li> Desparafinización y la hidratación en etanol y xileno clasificado al agua destilada, se llevan a cabo antes de la inmunotinción. </li><li> Un paso de bloqueo para saciar peroxidasa endógena se realiza en 0,3% de H 2 O 2 en etanol al 95% durante 5 minutos. </li><li> El calor inducido Epítope (HIER) se lleva a cabo en un tampón de pH 6 recuperación, utilizando una caldera de presión (cámara de destape, Biocare Médica) como fuente de calor durante 4 minutos a 125 ° C. Después de completado de ebullición, las diapositivas permanecen en la caldera de presión y se deja enfriar a 90 ° C. El tiempo total de procesamiento para HIER es de aproximadamente 45 minutos. </li><li> Si no hay ningún resultado concluyente se obtiene en la prueba inicial, las pruebas que se realicen más basado en el patrón de tinción observado 5 6. Un estudio piloto, dentro de la HPA de alto rendimiento de la configuración, mostróque la recuperación de antígenos más útil donde HIER pH 6, pero otros métodos de recuperación, tales como la pre-incubación con proteinasa, microondas y ebullición en tampón con un pH superior o inferior puede por supuesto ser utilizado. Al cambiar la condición de IHC, por ejemplo cambio de los tiempos de incubación de anticuerpos, los anticuerpos y diluciones diaminobencidina (DAB) los tiempos de incubación el patrón de tinción puede dar resultados más concluyentes. </li></ol> 5. Programa de tinción, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Todas las incubaciones se realizan a temperatura ambiente y este protocolo también se puede utilizar en una configuración manual con los mismos reactivos. <ol><li> Enjuague con tampón de lavado. </li><li> La incubación con Ultra bloque V durante 5 minutos. </li><li> Enjuague con tampón de lavado. </li><li> La incubación con el anticuerpo primario durante 30 minutos. </li><li> Enjuague con tampón de lavado (x2). </li><li> La incubación con peroxidasa de rábano picante etiquetada-polímero durante 30 minutos. </li><li> Enjuague con tampón de lavado (x2). </li><li> El desarrollo en la solución de DABdurante 10 minutos. </li><li> Enjuague con tampón de lavado (x2). </li><li> Contratinción de hematoxilina de Mayers 5 minutos *. Cuando se utiliza un método de tinción progresiva (por ejemplo, hematoxilina Mayers) la intensidad depende del tiempo y no hay diferenciación es necesaria. Una tinción regresiva por ejemplo, método hematoxilina de Harris requiere la diferenciación para eliminar el exceso de tinte de los tejidos con el fin de acentuar una estructura. </li><li> * Enjuague con agua del grifo. </li><li> Enjuague en agua de carbonato de litio, diluido 1:5 en solución saturada de 1 minuto *. </li><li> Enjuague con agua del grifo durante 5 minutos *. </li><li> Las diapositivas son deshidratados en etanol clasificado y las diapositivas se coverslipped (PERTEX, Histolab) </li></ol> Todos los reactivos se aplican a un volumen de 300 l por diapositiva. * Los pasos 10-14 se realizan en un instrumento histostaining (Autostainer XL, Leica) y cubreobjetos es, además, realizar en un sistema cubreportas (cubreportas automatizada CV5030, Leica). 6. Cómo escanearuna diapositiva El método de escanear diapositivas depende del escáner digital que se utilizan, este protocolo sólo define cómo escanear una diapositiva con el análisis del sistema automatizado de Aperio XT (Aperio Technologies). En la proteína humana Atlas configuración 20 aumentos para el tejido y 40x para las células se utilizan. Exploración automatizados podrían encontrar problemas de foco debido a la heterogeneidad del tejido y el número de tejidos diferentes incluidos en un TMA. <ol><li> Limpiar el portaobjetos de vidrio de la suciedad, pegamento y comprobar si las burbujas de aire entre el cubreobjetos y la sección. En caso de que el aire vuelva a montar las burbujas de la diapositiva. </li><li> Coloque la diapositiva en un bastidor y coloque el estante en el escáner digital. El tiempo para escanear un TMA a 20x de aumento es de aproximadamente 6 minutos. Un software de Aperio se utiliza para seleccionar el área de interés. La selección del punto de enfoque se realiza automáticamente en el software. Manualmente la selección del área de exploración y los puntos focales es también posible. </li><li> Después de la imagen hcomo se ha generado se puede utilizar para la evaluación y la anotación de la tinción IHC. Las imágenes permanecen como un archivo de resultado del experimento y se puede distribuir a sus colegas para los debates y más utilizado para la publicación de los datos. Las imágenes se pueden ver en un software de libre disposición de Aperio. </li></ol> 7. Cómo buscar tu proteína favorita en el Atlas de proteínas humanas <ol><li> Vaya a <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a> </li><li> Introduzca el nombre de su proteína favorita, Ensembl Identificación, número de UniProt adhesión o la insulina HGNC por ejemplo el nombre. </li><li> Ingresar a la página de resumen y desplácese hacia abajo para el tejido normal y el resumen de órganos. El panorama general muestra la expresión de proteínas en el páncreas. </li><li> Haga clic en &quot;datos de los tejidos más&quot;. Usted entra a los tejidos normales de ver donde se puede ver todos los tejidos incluidos ordenados por órgano. </li><li> Haga clic en el páncreas para ver los resultados de IHC 3 anticuerpos dirigidos hacia la misma proteína. Para ver una altagh-resolución de imagen de páncreas clic en la imagen. </li><li> Información adicional acerca de la expresión de proteínas en el tejido canceroso, células y otros datos de validación en el Atlas de proteínas humanas se pueden encontrar navegando por la web Human Protein Atlas. </li></ol> 8. Los resultados representativos Animación 1. ¿Cómo preparar los tejidos para la producción de microarrays de tejidos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la Animación 1</a> . Animación 2. Cómo TMA sección. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la animación 2</a> . 3 Animación. La técnica de inmunohistoquímica se describe. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la animación 3</a> .<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema general del proceso dentro de la proteína humana Atlas de Uppsala. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" /> Figura 2. Estilete de donantes marcada para la duración estandarizada de los núcleos de tejido, por ejemplo, 4,5 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" /> Figura 3. Microarrayer tejido manual. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" /> Figura 4. Ejemplos de diferente calidad de las TMA producidos. (A) Una. Recta y alineada correctamente TMA con espacio suficiente entre las filas y columnas, así como a la orilla de la parafina (B) Un TMA con algunos de los núcleos demasiado cerca del borde resultante en dificultades probables cuando seccionamiento. (C) Un TMA que han sido horneados para too largo que resulta en una colapsada TMA sin la plantilla correcta. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" /> Figura 5. Hematoxilina y eosina tiñen las TMA. (A) Una sección adecuadamente cortado con columnas rectas y alineados e hileras. Utilizando una cuchilla malo o sucio puede resultar en la división (B) o secciones comprimido (C). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" /> Figura 6. La titulación de anticuerpos. (A) Reacción de las células de los ganglios linfáticos en el centro muestra un anticuerpo de forma óptima valora que resulta en una tinción citoplásmica específica (en marrón) sin fondo. (B) La sección de tejido muestra una tinción débil. Tinción negativa o débil se encuentra cuando la concentración de anticuerpo primario es demasiado baja o si la proteína diana no está presente en los tejidos immunostained. (C) La sección de tejido se overstained debido al uso de una concentración demasiado elevada de anticuerpo primario. El darca resultados de color en las dificultades que determinan la localización subcelular, debido a extenderse, la reactividad cruzada y falsos positivos.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

La inmunohistoquímica es de lejos la aplicación más utilizada de las TMA. La combinación de IHC y TMA se puede utilizar en varios entornos diferentes, por ejemplo, selección de alto rendimiento de los patrones de expresión de proteínas en los tejidos y las células 7 8 9 10, los estudios de biomarcadores de detección basados ​​en muestras de tejido de grandes cohortes de pacientes 11 12 y más básico de la biología del tumor estudios, incluidos los diferentes fenotipos y genotipos, las etapas de diferenciación, la progresión y metástasis 13. Una ventaja de usar TMA es que el material de grandes cohortes pueden ser analizados en un tiempo, ambos experimentos de ahorro de material biológico valioso y asegurar más reproducibles. Además, el uso de la tecnología TMA ahorra costos de reactivos y tiempo de procesamiento de laboratorio. Como un TMA sólo contiene una cantidad limitada de tejido, tejido heterogeneidad es un problema. Dependiendo del tipo de tejido y preguntas a ser tratadas, varias muestras puede ser necesario de la misma specimen. Para los tejidos tumorales, el uso de dos a cuatro núcleos de cada muestra se recomienda ya que se ha demostrado resultar en un alto grado de precisión en la representación de las secciones de tejido enteros 13 14. Dependiendo de la composición del tejido del diámetro de los troqueles (que van desde 0,6 mm a 2 mm) se puede ajustar. Los tejidos son complejos y se componen de ambos tipos de células de varios diferentes, las estructuras y la matriz extracelular. La composición de cada tipo de tejido diferente del que contiene una cantidad variable de grasa, los vasos sanguíneos, tejido conectivo, cartílagos, etc, pueda afectar la presión necesaria para la perforación y la recolección de núcleos separados. Por consiguiente, es de importancia para la práctica todos los pasos del procedimiento en el material que no es de ningún valor, antes de producir un TMA con tejidos definidos para los experimentos destinados. Cuando seccionar una variedad de diferentes tejidos dentro de un bloque de TMA la composición del bloque podría influir en la capacidad de adquirir secciones de alta calidad. Certain tejidos, la piel, por ejemplo, la médula ósea, el cerebro de la grasa, y de mama, render la sección del bloque TMA difícil debido a los efectos de las diferencias en la textura que afectan cómo se extienden las secciones en el baño de agua y cómo diferentes durezas es cortado por la cuchilla, etc Por ello se recomienda a los tejidos de grupos con características similares, por ejemplo, el tejido ricas en lípidos en un TMA, en su caso. La mayoría de los tejidos de cáncer son en este sentido homogéneo, que facilita el corte de TMA cancerosas. Un método alternativo de seccionamiento para la estabilización de los núcleos de microarrays se puede emplear al manipular un TMA con tipos heterogéneos de tejidos. El uso de una cinta adhesiva puede ser útil para evitar la pérdida de núcleos y caer en la seccionada TMA. El uso de cinta adhesiva debe ser empleado con precaución, ya que la cinta puede influir en el espesor de los núcleos de sección y, posteriormente, también el resultado de la tinción inmunohistoquímica 15. En el Human Protein Atlas configurar una plantilla de TMA de 9x8 (con exclusión de los marcadores) núcleos arcorreo utilizado. Es de suma importancia para obtener el máximo número de secciones y mantener todos los tejidos representados en todo el bloque. Para guardar los reactivos y el tiempo de barrido, 2 secciones se colocan en un portaobjetos de vidrio que permite una plantilla máxima de 9x8. El repositorio principal de información de proteína, 16 de Recursos Universal Protein incluye aproximadamente 20.300 entradas crítica de proteínas humanas, de los cuales sólo aproximadamente el 66% tienen evidencia a nivel de proteínas. También para una mayoría de los genes para los cuales existe evidencia de la existencia en el nivel de proteína, existe escasa o ninguna información en función de las proteínas y la distribución de expresión. Un reto importante para el futuro es analizar el patrón de distribución y abundancia relativa de estas proteínas desconocidas en diversos tipos de tejido humano. La información procedente de bases de datos tales como Uniprot, Ensembl, los datos publicados de PubMed se puede utilizar como una guía para establecer si los patrones de tinción inmunohistoquímica utilizando anticuerpos parasalas proteínas desconocidas representan los perfiles reales de proteína de la proteína objetivo previsto. Además, varias estrategias de validación se necesitan otros para asegurar la funcionalidad de anticuerpos, por ejemplo, la funcionalidad de anticuerpos en matrices de la proteína, el Western blot, inmunofluorescencia, inmuno precipitación y tire hacia abajo los experimentos. Tal vez la herramienta más importante para la validación de la funcionalidad de anticuerpo es el uso de anticuerpos pareadas, es decir, dos anticuerpos diferentes producido contra separadas, que no se solapan epítopos sobre la proteína diana mismo, para comparar ensayo específico resultado 17. Con base en la información recopilada, los anticuerpos se ponen a prueba y se valora de acuerdo a las normas de IHC y la experiencia de probar y validar más de 35.000 los anticuerpos en el proyecto Human Protein Atlas. Durante más de 20% de todos los genes con los perfiles de proteínas, los datos de anticuerpos emparejados (2 o más anticuerpos hacia la no superposición epítopos en la misma proteína) se ha utilizado para determinar la mejor estimación uncompañero del patrón de expresión de la proteína correspondiente. Anticuerpos vinculados proporcionar una estrategia definitiva para la validación de técnicas de inmunohistoquímica específicos basados ​​en los patrones de expresión de la proteína. Esta estrategia es valiosa porque la multitud de diferentes tejidos incluidos en la proyección básica aumenta el riesgo de reactividad cruzada. También debe tenerse en cuenta que ciertos tejidos son en general más propensos a mostrar fondo tinción macrófagos por ejemplo, músculo liso, túbulos distales en el riñón y hepatocitos en el hígado. Otras cuestiones a considerar son las variaciones en las técnicas de procesamiento de tejidos a través del tiempo para los tejidos tomados de material de archivo, que puede dar lugar a falsos negativos o inadecuados patrones positivos de tinción por IHC. Este fenómeno se observa también en el análisis de gran sección. Controles negativos y positivos son vitales y deben ser utilizados siempre que sea posible. Para estudios más profundos, incluyendo los análisis funcionales, líneas celulares con expresión forzada y específica tumbar-de tr correspondientesanscripts (tecnología siRNA) puede ser utilizado para crear los controles. Para obtener resultados óptimos en IHC, es importante para probar y utilizar los sistemas de recuperación de antígeno, ya que la fijación con formalina induce diversas modificaciones químicas, por ejemplo, reticulación, la hidrólisis de bases de Schiff de enmascaramiento del antígeno 18. En conclusión, basados ​​en anticuerpos proteómica que emplean la tecnología TMA y IHC es una poderosa estrategia para la generación de datos de expresión de proteínas en gran escala. El proyecto Human Protein Atlas se ha establecido para crear un mapa de la expresión de la proteína humana en tejidos humanos normales y cancerosas. El objetivo de este proyecto es presentar un primer borrador de un Atlas de la proteína humana integral para el año 2015. Además de proporcionar los perfiles de proteínas en órganos y tejidos normales, este esfuerzo también proporciona un punto de partida para proyectos de investigación biomédica, incluyendo los esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores clínicos. El objetivo final es añadir una capa de información al lado en la parte superior de la secuencia del genoma humano que wiva a ser crucial para una comprensión más profunda de la biología que subyace a varios estados de la enfermedad, y proporcionar una base para el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El tampón de lavado </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> Tampón citrato pH 6 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> Diluyente de anticuerpos </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> Ultravisión LP polímero HRP </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB más el sistema de sustrato </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> Ultra V Bloque </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> Primaria de anticuerpos Enhancer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers hematoxilina </td><td> Histolab </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Nombre del equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Manual de tejido de micro arrayer </td><td> Estigen, Beecher Instrumento </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> Cascada microtomo </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> Escáner de imágenes automatizado </td><td> Aperio Tecnologías </td><td> XT </td></tr><tr><td> Sistema automatizado de tinción de portaobjetos </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> Autostainer 480s-2D </td></tr><tr><td> Sistema automatizado de tinción de diapositivas de deparafinization y deshidratación </td><td> Leica Biosystems </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> Cubreportas automatizada </td><td> Leica BiosSISTEMAS </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Destape de cámara </td><td> Biocare Médica </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

El microarray tisular (TMA) proporciona los medios de alto rendimiento para el análisis de múltiples tejidos y células. La técnica se utiliza en el proyecto Human Protein Atlas para el análisis global de los patrones de expresión de proteínas en tejidos humanos normales, el cáncer y líneas celulares. Aquí se presenta el conjunto de núcleos de 1 mm, recuperado de los tejidos al microscopio representativos seleccionados, en un único destinatario bloque de TMA. El número y tamaño de los núcleos en un bloque de TMA puede variar desde aproximadamente cuarenta 2 núcleos mm a cientos de 0,6 mm núcleos. La ventaja de utilizar la tecnología TMA es que gran cantidad de datos rápidamente se puede obtener utilizando un protocolo de inmunotinción único para evitar la variabilidad experimental. Es importante destacar que sólo cantidad limitada de tejido escaso es necesario, lo cual permite el análisis de grupos de pacientes grandes 1 2. Aproximadamente 250 secciones consecutivas (4 m de espesor) se puede cortar a partir de un bloque de TMA y utilizado para inmunohistoquímica staining para determinar los patrones específicos de expresión de la proteína por 250 anticuerpos diferentes. En el proyecto Human Protein Atlas, los anticuerpos se generan hacia todas las proteínas humanas y se utiliza para adquirir los perfiles correspondientes proteínas en tejidos humanos normales a partir de 144 individuos y los tejidos de cáncer en 216 pacientes diferentes, que representan a las 20 formas más comunes de cáncer en humanos. TMA secciones técnicas de inmunohistoquímica manchadas en portaobjetos de vidrio son escaneados para crear imágenes de alta resolución de la cual los patólogos pueden interpretar y anotar el resultado de la inmunohistoquímica. Imágenes junto con los correspondientes datos de anotación a base de la patología se hizo disponible al público para la comunidad investigadora a través del portal de la proteína humana Atlas ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (Figura 1) 3 4. El Atlas de Human Protein proporciona un mapa que muestra la distribución y abundancia relativa de las proteínas en el cuerpo humano. La versión actualsión contiene más de 11 millones de imágenes con los datos de expresión de proteínas para 12.238 proteínas únicas, que corresponden a más del 61% de todas las proteínas codificadas por el genoma humano.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Microarrays de tejidos permite un método eficaz para obtener información simultánea de una multitud de tejidos. Piezas representativas de los tejidos se integran en un único bloque de parafina. Las secciones del bloque se utilizan para inmunohistoquímica y el análisis de patrones de expresión de proteínas. Exploración digital genera imágenes correspondientes para la distribución de datos.

La producción de microarrays de tejidos, las técnicas de inmunohistoquímica y la digitalización En el Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

55.7K vistas.  Uppsala University. Microarrays de tejidos permite un método eficaz para obtener información simultánea de una multitud de tejidos. Piezas representativas de los tejidos se integran en un único bloque de parafina. Las secciones del bloque se utilizan para inmunohistoquímica y el análisis de patrones de expresión de proteínas. Exploración digital genera imágenes correspondientes para la distribución de datos.

Video: Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 enriquece el rendimiento de los melanocitos humanos de los tejidos adultos de la piel

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Cultivo de tejido de corteza ovárica bovina

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...