Estos protocolos permiten la cuantificación de la resolución de células individuales, la coexpresión de marcadores y un análisis especial utilizando muestras de tejido fresco congelado fijado en formalina e incrustado en parafina para dilucidar las funciones de las células inmunes en el cáncer. Esta técnica es una poderosa herramienta que facilita la caracterización simultánea de un marcador 40 en una sola sección de tejido, preservando ampliamente la estructura del tejido en las muestras. El paso crítico es la optimización y validación de anticuerpos.
Si no se completa el paso, se pueden producir imágenes de baja calidad que pueden comprometer la retención de datos y resultados reproducibles de alta calidad. Comience girando todos los tubos que contienen anticuerpos a 10, 000 x G durante cinco minutos, agregue anticuerpos individuales al tampón de bloqueo y mezcle bien. No altere la parte inferior del tubo de anticuerpos al pipetearlo.
Filtre el panel de anticuerpos humedeciendo previamente un dispositivo de filtro centrífugo de 0,1 micrómetros con 100 microlitros de tampón de bloqueo. Gire el filtro a 10, 000 x G durante dos minutos y retire el flujo del búfer de bloqueo con una pipeta. Luego transfiera el panel de anticuerpos a una columna de centrifugado y gire el filtro a 10, 000 x G durante dos minutos.
Deseche la columna de centrifugado y utilice el flujo como panel de anticuerpos filtrados. Para la tinción de anticuerpos, retire el amortiguador de bloqueo de las diapositivas inclinando cada portaobjetos de lado y golpeando suavemente los bordes contra un limpiaparabrisas de tareas. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad y agregue de 100 a 200 microlitros de mezcla maestra de anticuerpos al tejido.
Agregue portaobjetos de control positivo y negativo al lote de tinción e incube los portaobjetos a 4 grados centígrados durante la noche. Para configurar el instrumento, inicie sesión en el software de control y haga clic en Despertar, si el instrumento está en modo de suspensión. Haga clic en Exchange Sample para cargar una diapositiva y luego haga clic en Continue para abrir la puerta.
Coloque la diapositiva en la ranura de carga con una muestra hacia arriba y la etiqueta a la derecha, haga clic en Continuar para cerrar la puerta. Seleccione el proyecto y, a continuación, seleccione el nombre de diapositiva para la muestra cargada. Visualice la imagen panorámica en el panel de imagen óptica de diapositiva para el campo de visión o la selección de campo de visión, haga clic en el menú Modo y seleccione Detector de electrones secundario, luego haga clic en el menú Modo de imagen y seleccione QC 300 micrómetros.
Haga clic en Jog Stage para controlar la ubicación del campo de visión y luego haga clic en las flechas para navegar y seleccionar la posición del FOV. Haga clic en agregar FOV, establezca 400 micrómetros por 400 micrómetros como tamaño de campo y seleccione Fino como Modo de imagen y 1 milisegundo de Tiempo de permanencia, haga clic en Confirmar. Después de crear una lista de campo de visión, continúe con el enfoque de la imagen y ajuste la estigmatización moviendo el haz a una región de tejido que no se visualizará.
Ajuste los parámetros hasta obtener una imagen central clara, haga clic en Iniciar ejecución. Las imágenes adquiridas se cargarán automáticamente y se almacenarán en la aplicación de gestión de imágenes basada en la web. La matriz que se muestra aquí describe el porcentaje de diafonía derivada de la pureza y los óxidos de la sonda.
Aquí los cuadros azules indican mayor o igual que 0.5% diafonía y los cuadros claros indican menos de 0.5% diafonía. Para las etiquetas Mass se muestran aquí las sondas que contribuyeron con al menos un 0,5% de diafonía en ningún canal, uno o dos canales, o más de dos canales. También se muestran canales masivos que reciben al menos 0,5% de diafonía sin sondas, una o dos sondas, o más de dos sondas.
Aquí se representan las imágenes representativas de tinción en diferentes tejidos como adenocarcinoma de pulmón, riñón no neoplásico y amígdalas. Aquí se presenta una imagen de una sección de tejido de amígdalas teñida con esta técnica y visualizada utilizando un programa de software de análisis de imágenes digitales de terceros antes del filtrado y la corrección. Aquí se muestra la imagen de la misma sección en las mismas condiciones después de los pasos de filtrado y corrección.
Este método genera imágenes que se pueden cargar en un software de análisis de imágenes digitales de terceros, lo que permite un análisis exhaustivo como la compartimentación de tejidos, la segmentación celular, la coexpresión de marcadores, así como el análisis de vecinos y el análisis a distancia. Los métodos de imagen altamente multiplex están disponibles a través de la investigación. Mediante la construcción de diferentes paneles, los investigadores pueden investigar muestras de cáncer, normales, paraneoplásicas, inflamatorias e infecciosas.
