El ensayo de matriz de colágeno se ha desarrollado y mejorado por el trabajo de muchos grupos de investigación durante los últimos dos o tres décadas. Los enfoques descritos aquí para explantes dopaminérgicos del cuerpo estriado, y se benefician enormemente de estos estudios. Además, los autores desean agradecer a Asheeta Prasad por su ayuda en la creación de culturas del cuerpo estriado de explantes. El trabajo en el laboratorio fue financiado por la organización del programa Human Frontier Science (Premio a la Trayectoria para el Desarrollo), la Organización Holandesa de Investigación en Salud y el Desarrollo (ZonMW-VIDI y ZonMW TOP), la Unión Europanian (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (para RJP), y la Organización Holandesa de Investigación Científica (TopTalent; de ERES).

1. Preparación de colágeno de rata cola <ol><li> Recoger 6-10 colas de rata adulta (es posible almacenar las colas a -20 ° C hasta su uso). </li><li> Remoje las colas en el 95% de etanol durante la noche a temperatura ambiente (RT). </li></ol> La disección de las colas de rata (en la campana de cultivo de tejidos): (Mantener las herramientas en el 70% de etanol, cuando no usarlos y asegúrese de que todas las soluciones, herramientas y material de vidrio se utilizan en este procedimiento son estériles) <ol start="3"><li> Para recoger los tendones de las colas, corte la punta de la cola. Mantener el extremo grande de la cola con un par de fórceps. Utilice otro par de pinzas para tocar, doblar y romper la cola cerca de las pinzas de otros. Separe y los tendones se quedará atrás (Figura 1A, B). </li><li> Recoge los tendones en el H 2 O estéril, y después de recoger todos los tendones que mueven a una placa petri estéril de nuevo con H 2 O. </li><li> Tome 2-3 tendones y destrucción de todos con 2 pares de lasetas en una placa petri estéril de nuevo con H 2 O. Retire el tendón no tejidos, tales como las venas (tejido del tendón es brillante y reflectante; Figura 1C). Después de la eliminación de todos los tejidos no-tendón, cada cola rinde aproximadamente 100-150 mg de tendones. </li><li> Transferir los tendones a 300 ml de estéril de ácido acético al 3% y se agita lentamente durante la noche a 4 ° C. </li><li> Añadir un adicional de 200 ml de agua estéril de ácido acético al 3% y se agita lentamente durante la noche a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la solución de ácido acético que contiene los tendones a ~ 2700 xg durante 120 min a 4 ° C a pellets no disueltos tendones y tejido no-tendón. </li><li> Durante la centrifugación preparar tubo de diálisis: <ul><li> cortar piezas de 40 cm </li><li> mM EDTA hervir en 500 durante 5 minutos </li><li> fresco en estériles H 2 O </li></ul></li><li> Atar un nudo en un extremo del tubo de diálisis y llenar el tubo con el sobrenadante de la solución centrifugada tendón en hielo en la campana de cultivo de tejidos utilizando un sistema automático pipeteeE y una pipeta de 25 ml. Evitar la producción de burbujas. Nudo el otro extremo del tubo y el tubo almacén en papel de aluminio estéril sobre hielo hasta que todas las piezas de tubo se llena (Figura 1D). </li><li> Preparar 10 l de MEM estéril 0,1 X, pH 4,0, en la campana de cultivo de tejidos. Añadir flotador a las piezas de tubo y añadirlos a la solución MEM pre-enfriado 0,1 X en un vaso de precipitados de 10 l. Dializar durante la noche a 4 ° C mientras se revuelve lentamente. Esto elimina el exceso de ácido de diálisis mientras se mantiene el pH bajo. </li><li> Vuelva a colocar con el nuevo pre-enfriado de 10 l 0,1 x MEM y agitación durante una noche a 4 ° C. </li><li> Repita el paso anterior mediante la sustitución con el nuevo pre-enfriado de 10 l 0,1 x MEM y agitación durante una noche a 4 ° C. </li><li> Alícuota de solución de colágeno en estériles tubos de 50 ml. Alícuotas se almacenan a 4 ° C. Mantenga los 6-12 meses, sólo manejan el stock de colágeno en la campana de cultivo de tejidos. </li><li> Es importante para comprobar si el colágeno purificado debe ser diluido (en 0,1 x MEM) para obtener resultados óptimos en la MATR colágenoix ensayo. Por lo tanto, generar una serie de dilución de colágeno (colágeno sin diluir, 1:1, 1:2 y se diluyó 1:5) y realizar ensayos de colágeno de la matriz como se describe a continuación para determinar la dilución óptima de colágeno. </li></ol> 2. La disección del cerebro medio dopaminérgico 7,8 <ol><li> Diseccionar E14.5 embriones de ratón desde el útero de la madre y mantener en medio L15 en hielo hasta que se necesite. </li></ol> Todas las etapas subsiguientes de disección se realiza en medio L15 en hielo. <ol start="2"><li> Diseccionar el cerebro. </li><li> Retire el telencéfalo cortando a lo largo de la parte medial de cada vesícula telencefálica (use las vesículas telencefálicas para los explantes de cuerpo estriado). </li><li> Quite la envoltura meníngea. </li><li> Haga un corte dorsoventral solo rostral de la flexura mesencefálica. </li><li> Haga otro corte dorsoventral acaba de caudal de la flexura mesencefálica. </li><li> Haga un corte a lo largo de rostrocaudal la línea media dorsal utilizando un microdissection un cuchillo para exponer el tejido subyacente cerebro medio ventral. Tenga cuidado de no golpear el tejido del cerebro medio ventral, ya que contiene las neuronas dopaminérgicas (Figura 2). </li><li> Haga dos cortes rostrocaudal lateral y paralela a la línea media ventral para extraer tejido mesencéfalo dorsal. </li><li> Divide el resto de tejido del cerebro medio ventral en explantes con un cuchillo microdisección. </li><li> Guarde los explantes en medio L15 conteniendo FBS al 5% en hielo hasta su uso. </li></ol> 3. La disección del cuerpo estriado Todos los pasos de disección se realiza en medio L15 en hielo. <ol><li> Utilice vesículas telencefálicas disecadas durante la disección del cerebro medio. </li><li> Retire el tálamo mediante la reducción de entre el tálamo y el cuerpo estriado el uso de fórceps. </li><li> Haga un corte medio lateral rostral en el cuerpo estriado para eliminar las estructuras rostrales, como el bulbo olfatorio. Repita este paso para el tejido situado caudalmente en el cuerpo estriado. </li><li> Posiciónla rebanada restante para obtener una vista coronal del cuerpo estriado (Figura 2). </li><li> El cuerpo estriado puede ser reconocida como una parte ligeramente menos denso (más transparente) de tejido. Diseccionar el cuerpo estriado y corte en explantes utilizando un cuchillo de microdisección. Evitar el cierre del tejido ligeramente más oscuro que la línea media, que contiene las neuronas que migran de la eminencia ganglionar medial y lateral. </li><li> Guarde los explantes en medio L15 conteniendo FBS al 5% en hielo hasta su uso. </li></ol> 4. Asamblea matriz de colágeno ensayos Preparación del colágeno (todos los pasos sobre el hielo, usar puntas de pipeta enfriada) <ol><li> Mezclar 860 l de colágeno diluido con 100 l de MEM 10x y 40 l de bicarbonato de sodio 1M (NaHCO 3) y mantener en hielo. Si en este punto que el colágeno se calienta hasta que se solidifique. </li><li> Añadir una gota de 20 l (aproximadamente 5 mm de diámetro) de colágeno preparados para un cubreobjetos en un pozo de una placa de Nunc de 4 pocillosy se deja reposar en una incubadora de CO 2 a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 30 minutos (ambiente concentración de O 2 es suficiente). Durante esta incubación, el colágeno se gelatiniza. </li></ol> Instalación de co-cultivo en gel de colágeno <ol start="3"><li> Después de que el colágeno se ha gelatinizado, utilice una pipeta con una punta 200 l para transferir un explante dopaminérgica o estriado con el colágeno. </li><li> Mueva los explantes en estrecha proximidad entre sí mediante una aguja. Mantenerlos separados a una distancia de aproximadamente el diámetro de un explante (aproximadamente 200-300 micras) (Figura 2). </li><li> Eliminar el exceso de medio y se añaden 20 l de colágeno preparada en la parte superior de los explantes. A menudo, esto hará que los explantes para moverse. Vuelva a colocar los explantes utilizando una aguja como se describe en 4.4. </li><li> Que el colágeno solidificar durante 15 min a temperatura ambiente seguido por 30 min a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Después de que el colágeno se ha puesto, añadir 400 l de correomedio xplant y crecer durante 2-3 días en una incubadora de CO 2 a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 5. El análisis por inmunohistoquímica y la cuantificación La inmunohistoquímica <ol><li> Para solucionar los explantes, suavemente añadir 400 l de 8% paraformaldehído (PFA) en PBS a 400 l de medio (con lo que la dilución de la PFA al 4%) y dejar reposar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x 15 min en PBS a temperatura ambiente. </li><li> Incubar en tampón de bloqueo (BB; PBS + 1% de FBS + 0,1% de Triton X-100) durante 2 horas. </li><li> Incubar toda la noche con el anticuerpo primario en BB a 4 ° C. Para los axones dopaminérgicos uso de anti-tirosina hidroxilasa anticuerpos (1:1000) 7, para los axones del cuerpo estriado anti-DARPP32 anticuerpos (1:500) y 9 para la visualización de todos los axones de lucha contra la βIII tubulina (1:3000) 7. </li><li> Lavar 5x 1 hora en PBS a temperatura ambiente. </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario conjugado con el fluoróforo apropiado (1:500) en BB durante la noche a 4° C. Desde este paso en minimizar la exposición de los explantes a la luz (por ejemplo, los cubre con papel de aluminio). </li><li> Lavar la noche en PBS a 4 ° C seguido por varios lavados durante el día siguiente. </li><li> Monte explantes en portaobjetos utilizando Prolongue reactivo Antifade medio de montaje. Añadir una gota de ~ 10 l en un portaobjetos de vidrio. Tome el cubreobjetos y suavemente coloca sobre la gota de medio de montaje con la cara hacia abajo explante. Evitar que queden atrapadas en el aire de cubreobjetos con mucho cuidado por que la reducción en la gota de medio de montaje. </li></ol> La cuantificación mediante el cálculo de P / D <ol start="9"><li> Adquirir imágenes digitales de los explantes utilizando un microscopio epifluorescente (Figura 3). </li><li> El uso de estas imágenes, dividir cada explante en cuadrantes para generar un cuadrante proximal (es decir, parte del explante más cercana a la explante adyacente) y un cuadrante distal (parte del explante más alejado de la explicación adyacentent) (Figura 2, 4). </li><li> Medir la longitud de 20 largas neuritas que salen de la explante tanto en los cuadrantes proximal y distal. </li><li> Utilice la duración media de las 20 más largas neuritas para calcular el cociente P / D por cada explante individual. AP / relación D&gt; 1 indica que la atracción del axón, mientras que una proporción &lt;1 indica que la repulsión del axón. </li><li> En algunos casos, el crecimiento de neuritas densa impide la evaluación de la longitud de las neuritas individuo. En estas situaciones, la cuantificación se puede realizar mediante la medición de la distancia entre el borde del explante y el frente principal de crecimiento del axón en los cuadrantes proximal y distal. </li></ol> 6. Imágenes representativas Después de un cultivo con éxito de explantes dopaminérgicos y estriatal un gran número de axones son accesibles mediante microscopía de campo claro o como visualizaron por inmunocitoquímica anti-tubulina βIII (no mostrado). Un subconjunto de estos axones será dopaminérgica o s<html> axones triatal como visualizaron utilizando inmunocitoquímica (Figura 3). La división de los explantes en cuadrantes como se ha descrito y la determinación de P / D proporciones, un efecto axón putativo atracción o de repulsión se puede cuantificar (Figura 3E). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> Figura 1. Fotos ilustran la preparación de colágeno de los tendones de cola de rata. A) separando la cola de rata expone a los tendones. B) Los tendones son visibles como la cuerda-como paquetes. C) Los tendones son fáciles de distinguir de las venas por su aspecto blanco y brillante. D) Después de disolver los tendones en ácido acético, la solución se transfiere a un tubo de diálisis. Para mantener el frío colágeno disuelto, los tubos se colocan en una lámina de aluminio estéril sobre hielo. e 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Esquema indicando las diferentes etapas del procedimiento. Las regiones cerebrales apropiadas se disecan y corte para generar los explantes. Una sola mesencéfalo y explante estriatal se encuentra en las proximidades en una matriz de colágeno y deja crecer durante 48-72 horas a 37 ° C. Los axones son visualizados mediante técnicas de inmunohistoquímica de fluorescencia y un ratio de P / D se calcula para cuantificar las respuestas quimiotrópicas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> Figura 3. Los resultados representativos que muestran el crecimiento del axón en una cultura matriz de colágeno. A) explante mesencéfalo teñidas con anti-tirosina hidroxilasa anticuerpos revela axón. La línea punteada indica explante adyacente. B) ampliación de un neuritas que muestran individuales y los conos de crecimiento (flechas). C) explante estriatal teñidas con anti-DARPP32. D) Ampliación de la C que muestra neuritas individuales. E) Ejemplo deP / D cuantificación. Los explantes se dividen en cuadrantes iguales. El cuadrante proximal se enfrenta el explante mientras que el cuadrante adyacente distal se enfrenta lejos de ella. Las barras de escala indican 100 micras.

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	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El ensayo de matriz de colágeno se describe aquí se ha utilizado y mejorado por muchos laboratorios diferentes en las últimas décadas para investigar una variedad de moléculas de guiado de los axones neuronales y sistemas (por ejemplo, véanse las referencias 5-8). Estos estudios han demostrado que este ensayo es una poderosa herramienta para estudiar los efectos y la regulación de las moléculas de orientación axón secretadas por diferentes tejidos diana (intermedio). Sin embargo, d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina (200 mM) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Mínimos medios esenciales (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz medio L-15 </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reactivo Antifade Oro </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Diálisis tubo </td><td> Spectrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> De conejo anti-tirosina hidroxilasa </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse anti-tubulina βIII </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor etiqueta secundaria de anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

La dopamina del cerebro medio (MDDA) neuronas se proyectan a través del haz medial del cerebro anterior hacia varias áreas en el telencéfalo, incluyendo el cuerpo estriado 1. Recíprocamente, las neuronas espinosas medias en el cuerpo estriado que dan lugar a la estriatonigral (directa) y la vía inervan la sustancia negra 2. El desarrollo de estas extensiones del axón depende de las acciones de combinatorias de una gran cantidad de crecimiento de los axones y las señales de orientación que incluyen moléculas que se liberan por neuritas o por regiones de destino (nivel intermedio) de 3,4. Estos factores solubles pueden ser estudiados in vitro por MDDA cultivo y / o explantes estriatales en una matriz de colágeno que proporciona un sustrato tridimensional para los axones que imitan el entorno extracelular. Además, la matriz de colágeno permite la formación de gradientes relativamente estables de proteínas liberadas por explantes otras células y colocados en la proximidad (por ejemplo, véanse las referencias 5 y 6). Aquí se describen los métodos para las comficación de colágeno de cola de rata, microdisección de los explantes dopaminérgicos del cuerpo estriado, y, de su cultura en geles de colágeno y su posterior análisis inmunohistoquímico y cuantitativo. En primer lugar, los cerebros de embriones de ratón E14.5 están aislados y dopaminérgico estriatal y los explantes se microdissected. Estos explantes son entonces (co) cultivadas en geles de colágeno en cubreobjetos de 48 a 72 horas in vitro. Posteriormente, las proyecciones axonales se visualizan utilizando marcadores neuronales (por ejemplo, la tirosina hidroxilasa, DARPP32 o tubulina βIII) y crecimiento de los axones y las respuestas de los axones atractivas o repulsivas son cuantificados. Esta preparación neuronal es una herramienta útil para los estudios in vitro de los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento de los axones y mesoestriatales estriatonigral y orientación durante el desarrollo. Utilizando este ensayo, también es posible evaluar otros (intermedio) objetivos para los axones dopaminérgicos y estriado o para probar específicos señales moleculares.

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Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Los explantes procedentes del sistema de la dopamina mesencéfalo y el cuerpo estriado se utilizan en un ensayo para la matriz de colágeno<em&gt; In vitro</em&gt; Análisis del desarrollo y la vía mesoestriatales estriatonigral. En este ensayo crecimiento axonal y orientación puede ser manipulado y cuantificados. También se puede modificar para evaluar otras regiones o señales moleculares.

Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K vistas.  University Medical Center Utrecht. Los explantes procedentes del sistema de la dopamina mesencéfalo y el cuerpo estriado se utilizan en un ensayo para la matriz de colágeno In vitro Análisis del desarrollo y la vía mesoestriatales estriatonigral. En este ensayo crecimiento axonal y orientación puede ser manipulado y cuantificados. También se puede modificar para evaluar otras regiones o señales moleculares.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Una unidad motora funcional en la placa de cultivo: Co-cultivo de explantes de la médula espinal y las células musculares

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

El aislamiento y la cuantificación de la neurotoxina botulínica A partir de matrices complejas utilizando el BoTest Matrix Ensayos

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Conexiones de Fibra del Área de Motor Suplementario Revisited: Metodología de la Dissección de Fibra, DTI, y Documentación Tridimensional

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Cirugía estereotáctica para manipulación genética en las células estriatales de cerebro de ratón Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...