The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.

Este protocolo sigue las directrices LUMC y AMC de comité de ética de investigación humana. 1. Procedimiento Quirúrgico y Tejidos Colección Nota: A pesar de que existen diversas técnicas para la extirpación quirúrgica de la contractura de Dupuytren, el actual estándar de oro es la fasciectomía parcial 15. La mayoría de los pacientes son tratados en el hospital de día de la cirugía. <ol><li> Hacer una cirugía con anestesia general o regional de acuerdo con las preferencias del paciente y anestesiólogo de y para las comorbilidades del paciente. Estas consideraciones están más allá del alcance de este documento. Antes de la incisión, toque la piel con un objeto afilado para verificar que la anestesia es satisfactoria. Use un torniquete para facilitar la visualización quirúrgica en un entorno sin sangre. </li><li> Después de preparar de estéril y drapeado, marcar la incisión anticipada con un bolígrafo. Incisión en la piel con un bisturí con una lupa lupa de forma longitudinal or mediante incisiones en zigzag para evitar contracturas adicionales y también para permitir una exposición suficiente. </li><li> El uso de la disección de tijera, liberar a la piel y la capa subcutánea de los subyacentes palmar fascia contratados. Identificar y proteger el paquete neurovascular del dedo porque el cable enfermo puede desplazarlo hacia la línea media. Una vez que el tejido fibrótico (nódulo y / o espinal) se perfila, extirparlo bruscamente y regional (subtotal) utilizando un bisturí. Realice una hemostasia meticulosa bajo control torniquete al final del procedimiento para evitar la formación de hematoma. </li><li> Para cerrar la piel, utilice Z-plastias adicionales para obtener el alargamiento parcial de la piel. </li><li> Para estos estudios utilizan sólo la parte del cable de nódulo fibrótico, la parte más activa y celular de la enfermedad. Haga que el cirujano realice la identificación macroscópica. Los nódulos aislados en la palma de la mano son a menudo precursores o una cuerda, pero casi nunca se resecan, ya que por lo general no causan síntomas.Los que fueron resecados los nódulos que formaban parte de un cordón del dedo contratado. Identificar estos nódulos por la parte gruesa duro de las cuerdas en el handpalm (Figura 1A). </li><li> Una vez que el cirujano extirpa el tejido, inmediatamente transferir utilizando pinzas estériles a un tubo de 50 ml que contenía medio DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% (P / S). Mantener el tejido por un máximo de 2 horas en este medio en una caja de hielo húmedo (4 ° C) (por ejemplo, el transporte del tejido desde la sala de operación para las instalaciones de cultivo celular). </li><li> Mantener las muestras en hielo (4 ° C) mientras se prepara para el siguiente paso. Preparación de la cámara de materiales y cultivo celular requiere 10-20 min. </li></ol> 2. Preparación de los instrumentos, medio de cultivo y Cultura Inserciones Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente. <ol><li> Preparar 500 ml de DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% (P / S) y el filtro sterilize. Calentar inicialmente el medio a 37 ° C. </li><li> Fórceps Autoclave, un par de tijeras de Mayo-curvadas hoja (150-170 mm de longitud) y un par de tijeras Metzenbaum y guardar en un recipiente estéril. </li><li> Bajo flujo laminar, abra una placa de cultivo de 12 pocillos estériles. Coloque un inserto de cultivo (0,45 micras de tamaño de poro, 12 mm de diámetro) en cada pocillo de la placa de 12 pocillos (Figura 1B, panel inferior). </li><li> Llene la placa de 12 pocillos con 600 l de precalentado (37 ° C) los medios de cultivo por pipeteo en el pozo y no directamente sobre la membrana de la inserción. Colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) (Figura 1B, panel superior). <ol><li> También puede utilizar una placa de 24 pocillos y añadir 300 l de medio por pocillo. El volumen de medio por pocillo es óptima cuando se forma una capa de menisco entre el líquido y la parte inferior de la inserción de la membrana. Nota: el medio en la parte inferior del pozo se difunde a través de la membr nitrocelulosaane formar la capa de menisco como se representa en los esquemas de la figura 1B (panel inferior). </li></ol></li></ol> 3. Tejido Preparación Configuración y ex vivo de Cultivo de Tejidos Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente. <ol><li> Transferir la parte nódulo del cable desde el tubo de 50 ml en una placa de Petri de 100 mm y añadir 10 ml de precalentado (37 ° C) medio. Asegúrese de que el tejido está en contacto con el líquido durante todo el procedimiento. <ol><li> Retire la capa de grasa perinodular con las tijeras Metzenbaum. Deseche el tejido graso. Con el uso de fórceps y las tijeras curvadas hoja, cortar transversalmente el tejido en trozos más pequeños (espesor máximo de 200 micras). </li></ol></li><li> Transferir la placa de 12 pocillos de la incubadora en la campana laminar. Compruebe que la membrana de la inserción se ha vuelto transparente (húmedo) y por lo tanto está en contacto con el medio. </li><li> Con unas pinzaslevante con cuidado una parte de tejido tocando la capa exterior (no aplicar tensión en el tejido). Colocar una parte de tejido sobre la membrana del inserto de cultivo celular para que el tejido permanece en la interfase aire-medio. Cultura un máximo de dos partes de tejido en el mismo inserto / pocillo. </li><li> Asegúrese de que el tejido se coloca plana sobre la membrana, en contacto con el medio longitudinal de tal manera que el tejido no flota fuera de la membrana ni está totalmente cubierto por medio. Evite las burbujas de aire. Nota: En esta etapa, es posible añadir factores de crecimiento o inhibidores de interés para los medios de comunicación; por ejemplo, los compuestos de ensayo (A, B, C, D, E) en repeticiones y / o en curva de concentración. Incluya por lo menos 2 de control (sin tratar) trozos de tejido en condiciones normales de crecimiento para asegurar que el experimento se ha establecido correctamente. Incubar los tejidos durante 3-7 días en una incubadora de cultivo de tejidos. </li><li> Infectar el tejido, ya sea con constructo lentiviral o si adenoviral sobreexpresión o derribar experimentos de una necesidad de genes de interés a realizar (Figura 2). Transferir una parte del tejido de la placa de 12 pocillos en una placa de 35 mm con pinzas. <ol><li> Utilizar un volumen máximo de 10 l de virus de alto título. </li><li> Realice la inyección bajo un microscopio de disección con una jeringa de insulina cargada con 50 l de PBS que contiene 10 l de la virus seleccionado. Coloque la aguja perpendicular al centro del tejido. </li><li> Lentamente inyectar el contenido de la jeringa. No retraiga la aguja directamente. Al pinchar el tejido, no permita que la aguja pase por el otro lado, pero mantener la aguja dentro del propio tejido (alrededor del centro del tejido). </li><li> Transferir el tejido nuevo en la placa de 12 pocillos, cierre la placa de cultivo y colóquelo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2). </li></ol></li></ol> 4. Todo el montaje de inmunofluorescencia tinción y Reconstrucción 3D Nota: Todos los prolos procedimientos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente. El protocolo para toda la inmunotinción de montaje y de formación de imágenes se describe a continuación es una adaptación de los métodos reportados previamente utilizados para otros tejidos 16-19. Tampones y materiales se describen en la Tabla 1 y la Lista de Materiales. <ol><li> Tejidos de transferencia de la placa de cultivo a 2 ml tubos de microcentrífuga que contenían PBS. Lavado 2x por 5 min en una solución de PBS en una plataforma giratoria. Fijar los tejidos en 4% PFA tamponada (1,5 ml de solución por el tejido en 2 ml tubos de microcentrífuga), O / N a 4 ° C en una plataforma giratoria. </li><li> Retire PFA y lavar 3 veces en PBS durante 5 minutos cada uno. </li><li> Deshidratar tejidos por inmersión en una solución de metanol 25% durante 2 h a RT sobre una plataforma giratoria. Aumentar el porcentaje de metanol gradualmente (50%, 75%, 100%) con los tejidos sumergidos en cada solución durante 2 h a RT sobre una plataforma giratoria. </li><li> Tejidos de transferencia en DMSO / solución de metanol (paso permeabilización) durante 3 semanas a 4 ° C,como se ha descrito previamente 18. Nota: En esta etapa, los tejidos se pueden almacenar a largo plazo en 100% de metanol a -20 ° C. </li><li> Continúe con el procedimiento de tinción 16, 17; rehidratar gradualmente los tejidos (75% -50% -25% -0% serie metanol). Realizar cada etapa de rehidratación durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C, con agitación constante. </li><li> Incubar las muestras con anticuerpos primarios en PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 20% DMSO O / N a 4 ° C. Utilice anticuerpos en las siguientes proporciones utilizando las reservas comerciales en PBS: actina de músculo liso anti-α (1: 500, ratón), anti-colágeno tipo I (1: 500, de cabra), anti-colágeno tipo III (1: 500, cabra). </li><li> Lavar extensivamente en PBS durante 48 horas a 4 ° C (cambio de solución de PBS de 3 a 4 veces). </li><li> Diluir anticuerpos secundarios apropiados (Alexa 555 anti-ratón, Alexa 488 anti-cabra) a 1: 250 dilución en PBS que contenía 1% (BSA) y 20% DMSO. Incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar extensivamente en PBS durante 48 horas a 476; C e incubar con contratinción nuclear, TO-PRO-3 diluido 1: 500 en PBS a la etapa de lavado final. Nota: TO-PRO-3 es un tinte de ADN emisor de rojo lejano (con una línea de láser de 633 nm de He-Ne) y se combina para formación de imágenes simultánea con otros canales; en este tipo de colágeno caso de E / colágeno tipo III (488 nm), α-actina de músculo liso (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). </li><li> Transferir los tejidos a una serie metanol (25% -50% -75%) para deshidratar lentamente el tejido; realizar cada etapa de deshidratación durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con agitación constante. <ol><li> Tejidos de transferencia en tubos de polipropileno. Tejidos claros en salicilato de metilo (mango bajo el capó química) 18 o como uso alternativo solución BABB 19. Se incuba a RT con agitación constante hasta que los tejidos se vuelven transparentes. Monte entre un portaobjetos y un cubreobjetos sellada con juego duro medio de montaje (Figura 1C, panel superior). </li></ol></li><li> Muestras de imagen en un micro confocal invertidoalcance equipado con alta NA 63X y / o 100X objetivos de inmersión en aceite (Figura 1C). <ol><li> Limpiar la lente con la solución de limpieza proporcionado por el fabricante microscopio. </li><li> Aplicar una gota de aceite sobre la lente del objetivo. Colocar el portaobjetos con la muestra sobre la platina del microscopio y enfoque en la muestra. </li></ol></li><li> Establezca las configuraciones en el microscopio en busca de imágenes simultáneas de la fluorescencia de tres canales con líneas de láser de 488 nm, 514 nm y 633 nm. </li><li> Adquirir imágenes individuales XY o varias imágenes de plano focal (Z pila) (Figura 3A). Utilice una mayor anchura de Z pila para realizar la reconstrucción 3D. Para obtener una imagen de alta resolución de usar baja velocidad de exploración, número de exploraciones promedio (≥ 3) y adquirir imágenes de 16 bits de resolución 1024 x 1024 píxeles. </li><li> Analizar las imágenes adquiridas Z pila: primero cambiar el nombre y guardar el archivo de imagen (xyz). Utilizando el programa de software del microscopio confocal, configurar proje máxima intensidadcción de las imágenes Z pila en un 3D reconstruido imagen. <ol><li> Seleccione el archivo xyz, en las &quot;Herramientas de proceso&quot;, haga clic en &quot;Visualización&quot; y &quot;Proyección 3D&quot;. Enter &quot;Máximo&quot; en el método de proyección (o &quot;promedio&quot; si la señal fluorescente está saturado). Para una sola proyección no cambian los ejes X, Y y Z aviones, y aplicar la herramienta de proyección (Figura 3B, r1). </li></ol></li><li> Utilice las imágenes de pila Z para crear una proyección en 3D con animación (software confocal) para fines de visualización. Seleccione el archivo xyz, en las herramientas de proceso, haga clic en &quot;Visualización&quot; y &quot;Proyección 3D&quot;. <ol><li> Haga clic en &quot;Crear Película&quot;. Introduzca el ángulo de inicio de rotación en grados (por ejemplo, 0 ° como punto de partida de la película, eje Y) y haga clic en &quot;Start Set&quot;. Introduzca el ángulo final de giro en grados (eje Y) como punto final de la película (por ejemplo, 180 ° o 3606; para una rotación completa) y haga clic en &quot;End Set&quot;. </li><li> Seleccione &quot;máxima&quot; como método de proyección (o &quot;promedio&quot; si la señal fluorescente está saturado). Introduzca el &quot;Number of Frames&quot; para la rotación de la reconstrucción 3D (por ejemplo, 20 rotaciones o superior para reducir la velocidad de rotación). Haga clic en &quot;Aplicar&quot;. Exportar la película como archivo visual (por ejemplo, &quot;avi&quot;) (Película 1 complementario) o exportar como archivo &quot;tiff&quot; que crea un archivo de imagen para cada ángulo de rotación (Figura 3B; r4 rotación, r10, r18). </li></ol></li></ol> 5. Combinado de segunda generación armónica (colágeno) y de dos fotones de fluorescencia Emocionado (elastina) Imaging en ex vivo de tejidos durante la Cultura Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente. <ol><li> Retire las placas transwell de la incubadora y colocar una sola (sin fijar) tiparte DICIÓN en una placa de cultivo celular de 35 mm que contiene 500 l de medio. </li><li> Coloque el tejido de modo que el eje largo es plana en la placa. Mantenga tejido húmedo en todo momento sin embargo, no flotante. </li><li> Coloque objetivo sumergido en agua del microscopio multifotónica directamente en contacto con el tejido (Figura 1C). </li><li> Obtener imágenes con una longitud de onda de excitación de 800 nm y recoger la luz emitida entre 371-425 nm (SHG, colágeno) y 474-532 nm (autofluorescencia, elastina) (Figura 3C). Realizar microscopía de dos fotones en un microscopio confocal vertical equipado con un láser de femtosegundo usando un objetivo de inmersión en agua 20X / 1,0 NA. Confocal Proceso apila con el software del fabricante. Nota: la excitación con un láser de infrarrojo cercano de moléculas de colágeno de alta crea imágenes de contraste de las estructuras de colágeno nativo en diferentes profundidades. </li></ol>

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S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+&#945;-smooth+muscle+actin+determines+the+contractile+phenotype+of+Dupuytren's+nodular+cells.">Post-transcriptional regulation of &#945;-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).</li></ol>

Los autores han presentado una solicitud de patente para la enfermedad de Dupuytren: cultivo de órganos en 3D. # GB1307200. De licencias y contratos de servicios comerciales están disponibles.

Los pasos más críticos de cultivo de tejido conectivo ex vivo humano son el uso inmediato del tejido después de la extirpación quirúrgica para asegurar la viabilidad; el tejido debe permanecer en solución del medio o solución salina en todo momento; mantener un cultivo estéril; secciones transversales de tejido deben tener un grosor máximo de 200 micras; configurar el sistema de cultivo ex vivo es óptima cuando el tejido está en contacto con el medio, pero no completamente sumergido. Medio d...

Enfermedad de Dupuytren (DD), una enfermedad benigna fibroproliferativa provoca la flexión permanente de los dedos debido a la formación de nódulos y cordones en la palma de la mano. Aunque la propagación de la enfermedad es particularmente alto entre los caucásicos del norte de Europa, la etiología genética subyacente de la enfermedad sigue siendo desconocida 1. La principal característica de DD es el exceso de producción de (ECM) proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno), que forman un tejido fibroso duro que ocupa el espacio entre los tendones y la piel de la palma de la mano y los dedos, lo que altera permanentemente los movimientos finos de la mano 2, 3. La recurrencia de la enfermedad sugiere alteraciones genéticas subyacentes como una causa de la fibrosis 1, 4. Un tratamiento eficaz podría ser para apuntar directamente los mecanismos fibróticas incontrolables a nivel celular y molecular. Nuestro trabajo reciente sobre la fibrosis nos ha llevado al desarrollo de unnovedoso sistema de cultivo 3D que permite cultivo a corto plazo de tejido fibrótico humano con el potencial de pruebas de drogas. Este sistema ha ayudado a superar el enfoque limitante de cultivos de fibroblastos 2D y definir el papel de la regulación a la baja parcial, logrado por la omisión de exón, de activación de la vía TGF en la mediación de la fibrosis 5. Hemos desarrollado un método para el cultivo ex vivo especímenes de resección humana de pacientes con DD para estudiar la interacción entre los miofibroblastos y la ECM circundante 5, 6. El estudio de DD fibrosis del tejido conectivo, así como otras enfermedades fibróticas se basa en el análisis histopatológico de la extirpado quirúrgica especímenes, el aislamiento de los fibroblastos del tejido y el establecimiento de cultivos primarios o procedimientos de clasificación de células. Estos enfoques son bastante estática, ya que no permiten la manipulación exógena de las propiedades de la enfermedad o intervención terapéutica por el experimentador. Además, ce primariall culturas tienden a adaptarse a las condiciones de cultivo y sus propiedades de expresión de genes difieren esencialmente de la situación in vivo después de cada paso, incluso durante los primeros pasajes (entre el paso 3 y 6) 7, 8. Hemos logrado mantener el material quirúrgico de residuos en ex vivo condiciones de cultivo para un periodo de tiempo que permite el estudio de las características específicas del paciente y el cribado de compuestos de fármacos anti-fibróticos o anti-inflamatorios. El sistema se basa en una membrana de nitrocelulosa que permite el contacto del tejido con el medio, pero no con el plástico, por lo tanto, la prevención de la alteración del tejido tras la unión, como ya se observó cuando el cultivo de fibroblastos DD, así como otros tipos de células 9. No se requiere gel de colágeno u otro sustrato de proteínas ECM, ya que el propio tejido DD produce grandes cantidades de estas proteínas. Esto es ventajoso para el mantenimiento de la microambiente ECM nativa y sin rotaciónsustratos de matriz ce son importantes regulador de la arquitectura y la función 10, 11 tejidos. Por ejemplo, las proteínas ECM como la fibronectina, laminina y colágeno, pueden influir en la polaridad delantero-trasero del fibroblastos mostradas como igualmente para la polaridad apical-basal en las células epiteliales de 12, 13 . células polarizadas tienen una distribución asimétrica de moléculas extracelulares que determina la migración celular y la expresión génica, por ejemplo, la accesibilidad de la integrina α1β1 en la membrana afecta a la adhesión celular a colágeno de tipo I 14. Puesto que un objetivo principal de este modelo 3D era preservar el microambiente nativo, no se utilizó sustrato matriz ECM artificial. En resumen: los especímenes de resección son igualmente cortados en un ambiente estéril y se colocaron en membranas nitrocellular. Si se requiere un tratamiento administrado a través de la inyección de los tejidos se inyectan después de que se han colocado en la membrana. Si el tratamiento no requiere ser administrado a través de injección entonces el compuesto se añade al medio de cultivo (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), con 1% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)). Los cultivos se mantuvieron durante un máximo de diez días después de que el tejido se fija en 4% de paraformaldehído (PFA), procesado a través de solución de sacarosa al 30%, embebidos en compuesto OCT y se almacenaron a -80 ° C, como se describió previamente 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>high glucose, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PIHA01250</td>
			<td>0.45um pore size, 12mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1310-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- &#945; smooth muscle actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type III</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1330-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylsalicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsccope glass coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>BB024060A1</td>
			<td>24x60mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope SuperFrost slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>AA00000102E</td>
			<td>76x26mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 II confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710 NLO upright confocal microscope</td>
			<td>Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA 
			water-immersion objective.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human dupuytren's ex vivo culture for the study of myofibroblasts and extracellular matrix interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

El método de la ex vivo, la cultura 3D de tejido conectivo es un conjunto de hasta sistema fácil y robusto para comprender la relación entre ECM y otros componentes de las células que constituyen el tejido DD y potencialmente otros tipos de fibrosis, así. Además, este sistema permite un método fiable para probar los efectos de los compuestos sobre diferentes tipos de células y sus efectos sobre la carga 20 fibrótica. Los pasos de la colección de material de dese...

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Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Enfermedad de Dupuytren (DD) es una enfermedad fibroproliferativa de la palma de la mano. A continuación, presentamos un protocolo para muestras de resección cultura de DD en un sistema de cultivo en tres dimensiones (3D). Tal sistema de cultivo a corto plazo permite la preservación de la estructura 3D y propiedades moleculares del tejido fibrótico.

Humano Dupuytren<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de miofibroblastos y matriz extracelular Interacciones

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

10.3K vistas.  Leiden University Medical Center.  Enfermedad de Dupuytren (DD) es una enfermedad fibroproliferativa de la palma de la mano. A continuación, presentamos un protocolo para muestras de resección cultura de DD en un sistema de cultivo en tres dimensiones (3D). Tal sistema de cultivo a corto plazo permite la preservación de la estructura 3D y propiedades moleculares del tejido fibrótico. 

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Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Vivo Cultura de tejido del paciente y examen de la entrega de genes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Investigación

Medicina

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos neuroendocrinos líneas de células tumorales como un modelo tridimensional para el estudio de la terapia humana tumor neuroendocrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

Un humano<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placa aterosclerótica modelo para estudiar la lesión Biología

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedimiento para safena humana Venas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión y refuerzo externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Generación de microtumores Uso Humano 3D Biogel sistema de cultivo y las células de glioblastoma derivados de los pacientes para Kinomic de perfiles y pruebas de respuesta a los fármacos

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Tubo de Ensayo de la célula endotelial Formación estratégica: Comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir<em&gt; En Vivo</em&gt; Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...