Assay מטריצת הקולגן פותחה לשפר על ידי עבודה של הרבה קבוצות מחקר שונות במהלך השנתיים עד שלוש השנים האחרונות. הגישות המתוארות כאן explants דופאמין ו striatal תועלת רבה ממחקרים אלה. בנוסף, החוקרים מודים Asheeta פראסאד על עזרתה בהקמת תרבויות explant striatal. לעבוד במעבדה מומן על ידי ארגון Human תוכנית המדע הגבול (פיתוח פרס קריירה), ארגון הולנד למחקר בריאות ופיתוח (ZonMW-VIDI ZonMW ו-TOP), האיחוד Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , גרנט 222999) (כדי RJP), לבין ארגון הולנד למחקר מדעי (TopTalent, כדי Eres).

1. הכנת קולגן זנב עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 6-10 זנבות עכברים בוגרים (ניתן לאחסן את זנבות ב -20 ° C עד השימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את זנבות באתנול 95% בין לילה בטמפרטורת החדר (RT). </li></ol> דיסקציה של זנבות עכברים (בשכונה בתרבית רקמה): (לשמור על כלי באתנול 70%, כאשר לא משתמשים בהם ולוודא כי כל הפתרונות, הכלים וכלי הזכוכית בשימוש בכל הליך זה הם סטריליים) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף גידים מ זנבות, לנתק את קצה הזנב. החזק בסופו של זנב גדול עם זוג מלקחיים. השתמש עוד זוג מלקחיים להחזיק, לכופף ולשבור את הזנב קרוב מלקחיים אחרים. לפרק ואת הגידים יישאר מאחור (איור 1 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הגידים סטרילית H 2 O, ולאחר איסוף כל הגידים להעביר אותם petridish חדש עם סטרילית H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2-3 גידים ו לגרוס אותם באמצעות 2 זוגות שלceps ב petridish חדש עם סטרילית H 2 O. הסר שאינם רקמת גיד כגון ורידים (רקמת גיד מבריק ומהורהר, 1C איור). לאחר הסרה של רקמת גיד לא הכל, זנב אחד מניב כ 100-150 מ&quot;ג של גידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הגידים עד 300 מ&quot;ל של חומצה אצטית סטרילית 3% ומערבבים לאט לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מ&quot;ל נוסף 200 של חומצה אצטית סטרילית 3% ומערבבים לאט לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה פתרון חומצה אצטית המכיל את הגידים XG ב 2700 ~ 120 דקות ב 4 ° C עד גלולה לא מומס הגידים שאינם גיד רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה להכין צינורות דיאליזה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתיכות של 40 ס&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרתיח ב 500 מיקרומטר EDTA 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריר סטרילי H 2 O </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור קשר בקצה אחד של צינור דיאליזה ולמלא את צינורות עם supernatant הפתרון גיד centrifuged על הקרח מכסה המנוע תרבות רקמות באמצעות pipett אוטומטיתE ו פיפטה 25 מ&quot;ל. הימנע לייצר בועות. קשר את הקצה השני של צינורות צינורות החנות על רדיד אלומיניום סטרילי על הקרח עד חתיכות של כל צינורות מלאים (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 ליטר של סטרילית 0.1x ספורט, pH 4.0, בשכונה בתרבית רקמה. הוסף מצוף לחתיכות של צינורות ולהוסיף אותם לפתרון מראש מקורר MEM 0.1x בכוס 10 ליטר. Dialyze לילה ב 4 ° C תוך לאט תוך ערבוב. דיאליזה זה מסיר עודפי חומצה, תוך שמירה על pH נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף חדשה מראש מקורר 10 אני 0.1x MEM ומערבבים לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב הקודם על ידי החלפת מראש עם חדש מקורר 10 אני 0.1x MEM ומערבבים במשך הלילה על 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולגן aliquot פתרון תוך 50 צינורות סטריליים מ&quot;ל. החנות aliquots ב 4 ° C. שמור על 6-12 חודשים, רק להתמודד עם המניות קולגן בשכונה בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לבדוק אם קולגן מטוהרים צריך להיות מדולל (ב 0.1x MEM) כדי להשיג תוצאות אופטימליות ב matr קולגןט assay. לכן, לייצר סדרה דילול הקולגן (הקולגן חי, 01:01, 01:02 ו 01:05 בדילול מלא) ולבצע מטריקס מבחני קולגן כמתואר להלן, כדי לקבוע את דילול קולגן אופטימלית. </li></ol> 2. דיסקציה של המוח התיכון דופאמין 7,8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח E14.5 עוברי עכברים מן הרחם של האם לשמור על המדיום L15 על הקרח עד הצורך. </li></ol> כל השלבים הנתיחה שלאחר מכן מבוצעות בתווך L15 על הקרח. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את telencephalon על ידי חיתוך לאורך החלק המדיאלי של שלפוחית ​​כל telencephalic (שימוש שלפוחית ​​telencephalic עבור explants striatal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נדן meningeal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך dorsoventral מקורי רק של כפף mesencephalic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות עוד קיצוץ הזנב dorsoventral רק כפף mesencephalic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך לאורך קו האמצע rostrocaudal הגב באמצעות microdissectioסכין n לחשוף את הרקמה הבסיסית המוח התיכון הגחון. להיזהר לא לפגוע ברקמת המוח התיכון הגחון מכיוון שהיא מכילה נוירונים דופאמין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשני חתכים rostrocaudal לרוחב ובמקביל קו האמצע הגחון כדי להסיר רקמות המוח התיכון הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את רקמת המוח התיכון הנותרים הגחוני אל explants באמצעות סכין microdissection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את explants במדיום L15 FBS המכיל 5% על הקרח עד לשימוש. </li></ol> 3. דיסקציה של הסטריאטום צעדים כל דיסקציה מבוצעות בתווך L15 על הקרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שלפוחית ​​telencephalic גזור במהלך דיסקציה המוח התיכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התלמוס על ידי חיתוך בין התלמוס ואת הסטריאטום באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך mediolateral מקורי כדי הסטריאטום להסיר מבנים מקורי כגון נורת חוש הריח. חזור על פעולה זו על רקמת ממוקם caudally אל הסטריאטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדהפרוסת הנותרים לקבל תצוגה העטרה של הסטריאטום (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסטריאטום יכול להיות מוכר כחלק מעט פחות צפוף (שקוף יותר) של רקמה. לנתח את הסטריאטום לחתוך לתוך explants באמצעות סכין microdissection. הימנע קרוב רקמות מעט כהה יותר כדי קו האמצע, אשר מכיל נוירונים נודדים של רוממות ganglionic לרוחב ו המדיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את explants במדיום L15 FBS המכיל 5% על הקרח עד לשימוש. </li></ol> 4. הרכבה קולגן מטריקס מבחני הכנת קולגן (בכל הצעדים על הקרח, להשתמש מקורר טיפים פיפטה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 860 μl של קולגן בדילול מלא עם 100 μl של MEM 10x ו 40 μl של סודה לשתייה 1 יג (NaHCO 3) ולשמור על הקרח. אם בשלב זה הקולגן מתחמם זה יהיה לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה של μl 20 (כ 5 מ&quot;מ קוטר) של קולגן מוכנים coverslip היטב מנה 4-גם Nuncולתת לו לעמוד CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות (הסביבה O 2 בריכוז מספיק). במהלך הדגירה זה קולגן יהיה gelatinize. </li></ol> הגדרת שיתוף תרבות קולגן ג&#39;ל <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קולגן יש gelatinized, השתמש פיפטה עם טיפ 200 μl להעביר explant דופאמין או striatal קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את explants בסמיכות זה לזה באמצעות מחט. להפריד ביניהם במרחק של קוטר של כ explant 1 (~~~HEAD=NNS 200-300 מיקרומטר) (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני עודף ולהוסיף 20 μl של קולגן מוכן על גבי explants את. זה יהיה לעיתים קרובות לגרום explants כדי לנוע. למקם מחדש את explants באמצעות מחט כמתואר 4.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הקולגן לחזק במשך 15 דקות ב RT ואחריו 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קולגן קבע, הוסף 400 μl של הבינוני xplant ולגדול במשך 2-3 ימים CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 5. ניתוח על פי אימונוהיסטוכימיה וכימות אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן explants, בעדינות להוסיף 400 μl של paraformaldehyde 8% (PFA) ב PBS עד 400 μl של המדיום (ובכך לדלל PFA ל -4%) ולתת לעמוד במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דקות 3x 15 ב PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחסימת המאגר (BB; PBS + 1% FBS + 0.1% טריטון X-100) במשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בין לילה עם הנוגדן העיקרי BB ב 4 ° C. על האקסונים דופאמין להשתמש נגד טירוזין נוגדנים hydroxylase (1:1000) 7, אקסונים striatal נגד DARPP32 נוגדנים (1:500) 9 ו המאפשר הדמיה את כל האקסונים נגד βIII טובולין (1:3000) 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שעה 5x 1 ב PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני מצומדות כדי fluorophore המתאים (1:500) ב BB לילה בשעה 4° C. משלב זה ואילך לצמצם את החשיפה של explants את האור (למשל לכסות אותן בנייר כסף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לילה PBS ב 4 ° C ואחריו שוטף כמה במהלך היום הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר explants על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות להאריך מגיב Antifade הרכבה בינונית. הוסף ירידה של 10 μl ~ בשקופית מיקרוסקופ זכוכית. קח coverslip בעדינות ומניחים אותו על ירידה של המדיום גובר כאשר הצד explant כלפי מטה. למנוע השמנה כל האוויר מתחת דה coverslip ידי בעדינות הורדת אותו על ירידה של המדיום גובר. </li></ol> כימות על ידי חישוב P / D יחס <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות דיגיטליות של explants באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתמונות אלה, לחלק אחד explant לתוך הרביעים לייצר ברבע פרוקסימלי (כלומר החלק של explant הקרוב explant צמוד) וגם ברבע דיסטלי (חלק explant הרחוק ביותר מן expla הסמוךNT) (איור 2, 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את אורך של 20 neurites הארוכים ביותר העולה מתוך explant הן את הרביעים הפרוקסימלית ומ דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באורך ממוצע של 20 neurites הארוכים ביותר כדי לחשב את יחס P / D עבור explant בנפרד. AP / D יחס&gt; 1 מציין משיכה האקסון, בעוד יחס &lt;1 מצביע על דחייה האקסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרים מסוימים, צמיחה צפופה של neurites מונע הערכת אורך neurite הפרט. במצבים אלה, כימות יכול להתבצע על ידי מדידת המרחק בין קצה explant והחזית המוביל של הצמיחה האקסון של הרביעים הפרוקסימלית ומ דיסטלי. </li></ol> 6. נציג תמונות אחרי התרבות המוצלח של explants דופאמין ו striatal מספר רב של אקסונים גלויים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או דמיינו כפי immunocytochemistry נגד βIII טובולין (לא מוצג). תת קבוצה של אקסונים אלה יהיו דופאמין או של<html> אקסונים triatal כמו immunocytochemistry באמצעות דמיינו (איור 3). על ידי חלוקת explants לתוך הרביעים כמתואר וקביעת P / D יחס, התוצאה האקסון המשוערת מושכת או דוחה ניתן לכמת (איור 3E). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> באיור 1. תמונות הממחישות את ההכנה של הקולגן בגידים זנב חולדה. א) משיכת חוץ זנב עכברוש חושף את הגידים. ב) הגידים הם נראים כמו חבל, כמו צרורות. ג) הגידים קל להבחין בין עורקים על ידי המראה הלבן הבוהק שלהם. ד) לאחר המסת הגידים חומצה אצטית, הפתרון הוא להעביר את צינורות דיאליזה. כדי לשמור על קור קולגן מומס, צינורות ממוקמות על רדיד אלומיניום סטרילי על הקרח. ה 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. סכמטי המציין את השלבים השונים של ההליך. אזורי המוח המתאימים גזור ופצע ליצור explants. המוח התיכון יחיד explant striatal ממוקמים בסמיכות במטריצה ​​קולגן והשאיר לגדול במשך 48-72 שעות על 37 ° C. האקסונים הם דמיינו ידי אימונוהיסטוכימיה הקרינה ואת היחס P / D מחושב לכמת התגובות chemotropic. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> איור 3. תוצאות נציג מראה צמיחה האקסון בתרבות מטריקס קולגן. א) explant המוח התיכון מוכתם נגד tyrosine hydroxylase נוגדנים תוצאה חושפים האקסון. הקו המקווקו מציין explant הסמוך. ב) הגדלה של מספר neurites בודדים המראים קונוסים צמיחה (חיצים). ג) explant Striatal מוכתם נגד DARPP32. D) הגדלה של C מראה neurites בודדים. ה) דוגמהע / D יחס כימות. Explants מחולקים הרביעים שווים. ברבע הפרוקסימלי עומדת בפני explant הסמוך ואילו ברבע דיסטלי פונה ממנו. ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר.

<ol>
	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

Assay מטריקס קולגן המתואר כאן נעשה שימוש ושיפרה ידי מעבדות רבות בעשורים האחרונים לחקור מגוון רחב של מולקולות האקסון הדרכה ומערכות עצביות (למשל לראות הפניות 5-8). מחקרים אלה הראו כי assay זה הוא כלי רב עוצמה לחקר תופעות ורגולציה של מולקולות האקסון הדרכה המופרשים על ידי (ביני...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> עגל עוברית סרום </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> גלוטמין (200 מ&quot;מ) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> מרק </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Media חיוניים מזערי (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> ליבוביץ של L-15 בינוני </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך מגיב Antifade זהב </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> דיאליזה צינורות </td><td> ספקטרום Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylase הארנב נגד טירוזין </td><td> פל, FreeZ </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד Darpp32 (H-62) </td><td> סנטה קרוז, </td><td> SC-11365 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר נגד βIII טובולין </td><td> סיגמא </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד שכותרתו נוגדנים משניים </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

הדופמין במוח התיכון (mdDA) נוירונים הפרויקט באמצעות צרור המוח הקדמי המדיאלי כלפי כמה אזורים telencephalon, כולל 1 הסטריאטום. הדדי, הנוירונים קוצניים בינוני בסטריאטום שיוצרים מסלול (ישיר) striatonigral innervate nigra substantia 2. פיתוח של שטחים אלה האקסון תלויה בפעולות קומבינטורית של שפע של צמיחה האקסון ואת רמזים הדרכה כולל מולקולות שפורסמו על ידי neurites או (ביניים) אזורים היעד 3,4. גורמים אלה מסיסים ניתן ללמוד במבחנה על ידי mdDA culturing ו / או explants striatal במטריצה ​​קולגן אשר מספק מצע תלת מימדי על אקסונים מחקה את הסביבה תאיים. בנוסף, מטריקס מאפשרת קולגן ליצירת שיפועים יציבה יחסית של חלבונים שפורסמו על ידי explants או תאים אחרים המוצבים בסביבה (למשל, לראות את הפניות 5 ו -6). כאן אנו מתארים את שיטות פורification של קולגן עכברוש הזנב, microdissection explants של דופאמין ו striatal, התרבות שלהם ג&#39;ל קולגן וניתוח immunohistochemical וכמותית שלאחר מכן. ראשית, במוחם של עוברי עכברים E14.5 הם מבודד דופאמין ו explants striatal הם microdissected. Explants אלה מכן (CO) בתרבית ג&#39;ל קולגן על coverslips במשך 48 עד 72 שעות במבחנה. כתוצאה מכך, תחזיות axonal הם דמיינו באמצעות סמנים עצביים (tyrosine hydroxylase למשל, DARPP32 או טובולין βIII) וצמיחה האקסון ותגובות האקסון אטרקטיביים או דוחה הם הניתנים לכימות. זו הכנה עצבי הוא כלי שימושי עבור במבחנה של המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון mesostriatal ו striatonigral והדרכה במהלך הפיתוח. שימוש assay זה, אפשר גם להעריך אחרים (ביניים) מטרות אקסונים דופאמין ו striatal או לבדוק אותות מולקולריים מסוימים.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays at JoVE.com

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Explants ממערכת המוח התיכון דופאמין הסטריאטום משמשים assay קולגן מטריקס עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; ניתוח של פיתוח מסלול mesostriatal ו striatonigral. ב assay זו תוצאה הדרכה axonal והוא יכול לטפל לכמת. זה גם יכול להיות שונה להערכת באזורים אחרים או סימנים מולקולריים.

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K Views.  University Medical Center Utrecht. Explants ממערכת המוח התיכון דופאמין הסטריאטום משמשים assay קולגן מטריקס עבור במבחנה ניתוח של פיתוח מסלול mesostriatal ו striatonigral. ב assay זו תוצאה הדרכה axonal והוא יכול לטפל לכמת. זה גם יכול להיות שונה להערכת באזורים אחרים או סימנים מולקולריים.

Video: Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

הערכת פנוטיפים ניווניות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים דופאמין על ידי מבחני לאז וimmunostaining מוח כל

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

סיבים חיבורים של אזור המשלים המשולב Revisited: מתודולוגיה של פיזור דיסק, DTI, ו 3 תיעוד מימדי

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...