Queremos agradecer a Monte Westerfield, Makoto Kobayashi y Topczewski Jacek por los dones de plásmidos para la hibridación in situ y la microinyección de mRNA. Estamos muy agradecidos a Steph Erhard por aparecer en el video. También queremos agradecer la asistencia de William Goossens con la microscopía confocal se muestra en el video. Tyler Schwend siempre las imágenes utilizadas en el video, y Rodney Dale contribuyó a la preparación para el vídeo. También agradecemos al personal de cuidado de los animales CMRC por su trabajo con la cría del pez cebra. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R21 AA13596 SCA.

1. El etanol tratamiento de los embriones <ol><li> Embriones de pez cebra derivados de tipo salvaje apareamientos se elevaron a 28 ° C en 5 ml de agua embrión. (Agua Milli-Q con 60 mg / L Instant Ocean). Las diferentes cepas de tipo salvaje embriones tienen tolerancias ligeramente diferentes para el etanol de la exposición 9. </li><li> La exposición a etanol se inició en la etapa de cúpula (~ 4,3 horas después de la fertilización, HPF) para la longitud de tiempo deseado, hasta un pulso de 24 horas. Esta etapa inicial es más o menos equivalente a la fase de implantación de los embriones de mamíferos, justo antes de la gastrulación. Las concentraciones de etanol utilizadas oscilan entre el 0,2% -2,5%, volumen / volumen. Las pruebas han demostrado que entre 25-50% de la solución en el agua termina en el embrión en desarrollo 10, 11. Los embriones se mantienen a 28 ° C durante el período de tiempo deseado. Después de la longitud deseada de la exposición de etanol, la solución de etanol-agua es eliminado y reemplazado con tres lavados de agua pez cebra regular y mantenido FOr la longitud de tiempo deseado. La especificidad del defecto depende del tiempo de inicio, la dosis y la duración del pulso de etanol. </li></ol> 2. Recolección de embriones para el ARN, hibridación in situ, anticuerpos, y la tinción de cartílago <ol><li> Para la recolección del mRNA para qPCR, edad embriones encontrados se recogen en tubos Eppendorf. Tras la eliminación del agua pez cebra, tampón de lisis con TCEP se añade. Un pulverizador motorizado se utiliza para disociar físicamente los embriones en la solución de lisis. Este se pasa entonces a través de una columna preclear, que elimina todos los trozos grandes no disociadas. La solución resultante contiene todas las macromoléculas liberadas por el proceso de lisis. ARN se extrae a continuación mediante la ejecución de esta solución en una columna, seguido de lavados y el tratamiento DNAsa. La elución se realiza a continuación utilizando ya sea agua o una solución de elución proporcionado por el fabricante (5&#39;-emergencia). El ARN puede ser convertido a cDNA utilizando técnicas estándar para qPCR o utilizados en micromatriz de análisis. </li><li> Para la hibridación in situ y la tinción de anticuerpos, los embriones de 6 a 24 HPF se fijaron en paraformaldehído al 4% durante toda la noche a 4 ° C. Esto es seguido por 3 lavados en PBS + 0,1% Tween (PBT), para mantener los embriones se peguen entre sí. Los embriones se transfieren entonces a través de una serie de 3 metanol: PBT lava en 100% de metanol, en cuyo punto se puede almacenar a -20 ° C. Estos embriones se pueden utilizar para la hibridación in situ o tinción de anticuerpos. Algunos anticuerpos no funcionan después de tratamiento con metanol, por lo que esta advertencia debe ser tomada en cuenta y su anticuerpo específico probados para determinar si va a trabajar después del tratamiento con metanol. </li><li> Para la tinción de cartílago, los embriones deben ser elevado a 5 ó 6 días después de la fertilización (dpf). Luego se fija en el 4% de paraformaldehído durante la noche a 4 ° C, seguido de 3 lavados en PBT. </li></ol> 3. La evaluación inducida por etanol cambios de expresión génica y consecuencias en el desarrollo <ol><li&gt; Para determinar qué niveles de expresión génica han cambiado, determinados genes son examinados tanto por qPCR y la hibridación in situ. qPCR se logra utilizando los cebadores diseñados con Integrated DNA Technologies (IDT) de software, y luego validado utilizando 3 muestras biológicas distintas. Una vez que los cebadores se han validado, qPCR se realiza en ADNc creado a partir de recolectó muestras de ARN. Cada muestra se realizaron por triplicado. Las reacciones de PCR se ejecutan platino SYBR Green qPCR super mezcla (Invitrogen) en una máquina de croma-4 PCR (BioRad) o similar de la máquina PCR con un sistema de detección multicolor. Además de los genes siendo interrogado, es crítico que un control conjunto de cebadores se utiliza para equilibrar las pequeñas diferencias en la preparación de ADNc o ARN. Para nuestros embriones de pez cebra, se utiliza GAPDH: 5&#39;GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3 &#39;y 5&#39;TTGCACCACCCTTAATGTGA3&#39;. Los genes analizados se normalizan a los niveles de GAPDH una cuantificación de la relación de la expresión génica se calcula utilizando la variación del método Pfaffl el 2 de <sup&gt; - Ct, muestra los datos como veces la diferencia en relación experimental con el tipo salvaje 12. El cálculo normal supone que todos los genes están duplicando el ADN dos veces por cada ciclo, y por lo tanto expresa los datos como una proporción del cambio en el gen experimental sobre el cambio en el gen de referencia, expresado como cálculos de potencia durante el entero &quot;2&quot;, que es la eficiencia de la duplicación de ADN por ciclo visto en una perfecta reacción de PCR. El método sustituye a la Pfaffl genérica &quot;2&quot; con el experimentador genera la verdadera eficacia de la PCR elegido. Esto refleja una reflexión más precisa de la diferencia en las reacciones de PCR. La fórmula completa es: <table border="0"><tbody><tr><td> (Eficiencia de la genética experimental) (Ct de la muestra de control-Ct de la muestra tratada) </td></tr><tr><td> -------------------------------------------------- ----------------------------------- </td></tr><tr><td> (Eficiencia de los genes de referencia) (Ctmuestra de control - Ct de la muestra tratada) </td></tr></tbody></table></li><li> Para la hibridación in situ, digoxigenina (DIG)-etiquetados ribosondas se construyen a partir de plásmidos que contienen porciones del gen de interés. Emparejados por edad embriones son expuestos a ribosondas utilizando condiciones estándar 13 y detectado usando anticuerpos anti-dig acoplados a fosfatasa alcalina, que permite la localización de los ribosondas marcadas utilizando una reacción de color (NBT / BCIP). Los embriones son y visualizado en un microscopio Leica disección (Figura 1B-G). </li><li> Para evaluar el desarrollo morfogénica, los embriones se recogen en el momento deseado y se examina bajo el microscopio de disección. Por la forma somite, embriones vivos se visualizan 14. Para la distancia entre oculares y de la longitud del cuerpo, los embriones se fijan en PFA. En todos los casos, las imágenes de la región deseada son capturados en un microscopio de disección con un aumento fijo y las mediciones realizadas con Adobe Photoshop software 10,14. </li><li> Para examinar los efectos del tratamiento sobre las estructuras del cartílago en desarrollo de la larvas de pez cebra, se utiliza la tinción de azul Alcian. Larvas de pez cebra fijo se tratan con una solución de azul Alcian disolvió en etanol al 80%: 20% de ácido acético glacial (alcohol ácido) durante varias horas o durante la noche. Las larvas se destiñeron en varios lavados de alcohol de ácido antes de ser transferido a un 1% de KOH: 3% de solución de peróxido de hidrógeno para la compensación adicional de las células de pigmento. El pez cebra tienen que ser por lo menos 4 días de edad para mostrar las estructuras del cartílago, y éstos están mejor definidos en los peces que son 5 o 6 días. </li><li> La muerte celular en embriones de vida se evaluó a través de naranja de acridina (AO). AO no es permeable a las células a las células vivas, y se une al ADN en las células con membranas comprometidas, incluidos los sometidos a la apoptosis y necrosis. Embriones vivos se incubaron con 5 mg / AO ml en PBS durante 1 hora, seguido de 3 lavados en PBS. Los embriones son entonces imágenes utilizando el microscopio confocal. Digital Z-Series imágenes se combinan para crear materiales compuestos. </li></ol> 4. La manipulación del embrión de pez cebra <ol><li> Después de la identificación de genes que se disminuyó la exposición de etanol, es posible tratar de reemplazar mediante la inyección de ARNm diseñado para sustituir el gen que falta. ARNm tope se transcribe a partir de plásmidos de ADN linealizado utilizando ARN polimerasa en kits de transcripción in vitro, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (mMessage máquina, Applied Biosystems). Entre 25-200 pg / nl de ARN se inyecta en 1-2 huevos de pez cebra celulares etapa, en una solución de 0,1 M de KCl. Los embriones se deja entonces para recuperar antes de ser tratados con etanol como se ha descrito anteriormente (Figura 5). </li><li> Para las transcripciones de genes que se incrementan por la exposición al etanol, que puede reducirse, o &quot;derribado&quot; por medio de una tecnología antisentido morfolino. Antisentido morfolinos (AMO) son diseñados por las herramientas de la empresa de genes, y bloquear la traducción del ARN en proteínas, o block la maduración y empalme de ARN, dependiendo de la necesidad de experimentación. Esta acción de morfolinos limitar la cantidad de proteína activa para el gen blanco, un déficit que se puede medir utilizando anitibodies si están disponibles. La eficiencia de los morfolinos empalme de ARN se puede medir por medio de RT-PCR para detectar las cantidades relativas de las transcripciones longitudinalmente y unspliced. Titulante del morfolino puede resultar en dosis-dependiente de la actividad 15. OMAs se diluyen a concentraciones de trabajo (titularse pg a concentración ng) en Danieau solución (58 mM de NaCl, 0,7 mM de KCl, 0,4 mM de MgSO 4, 0,6 mM de Ca (NO 3) 2, 5 mM HEPES, pH 7,6). Inyección se lleva a cabo en la fase 1-2-célula, a continuación, los embriones se permite a desarrollar antes de ser sometido a tratamiento etanol como anteriormente. </li></ol> 5. Los resultados representativos La exposición embrión de pez cebra a los resultados de etanol en una serie de defectos en el desarrollo y genéticos que están relacionados conlos fenotipos encontrado en otros vertebrados. Hemos documentado el desarrollo anormal de los tejidos axiales, incluyendo la notocorda (datos no mostrados 14). El retraso en el desarrollo producido por etanol al parecer conduce a la disrupción de alargamiento apropiada notocorda, dando lugar a una acortado y ocasionalmente interrumpido notocorda (datos no mostrados 14). Este retraso temprano y defecto notocorda probable conduce en parte a las anomalías más adelante en los somitas (Figura 2), que han perdido su fuerte forma cheurón como se ve en los controles no tratados, y están más cerca de los somitas en forma de U característicos de los fenotipos observados cuando sónica de señalización se reduce 14. El ángulo de los somitas se puede medir el uso de software estándar, y aumenta el ángulo de 92,1 ± 4,6 ° en los controles no tratados a 122,6 ± 6,6 ° en los embriones tratados con etanol (p &lt;0,001). Otra consecuencia de la exposición de etanol que podría ser downstream de retraso del desarrollo temprano y posteriores defectos notocorda es una longitud acortada del embrión (Figura 3). Incluso la medición de embriones para tener en cuenta la curvatura producida por la exposición de etanol, la exposición etanol conduce a un tronco acortado que es dependiente de la dosis de etanol se expuso que el embrión (Figura 3E 14). Este hallazgo es similar a la persistencia de la talla de la prepubertad corta en los niños expuestos al etanol durante el desarrollo de 16, 17, lo que sugiere que el modelo del pez cebra es relevante para la comprensión de los defectos de nacimiento humano. Una de las características clásicas de la FAS es una facies clásicas, incluyendo una mandíbula reducida, apertura de los ojos pequeños, y un surco nasolabial liso. Gran parte de estas características están relacionados con una reducción en los tejidos línea media. Se ha demostrado en modelos animales que la exposición a etanol severa conduce a fenotipos aún más pronunciada, incluyendo synopthalmia y ciclopía. Cuando la exposicióncantar embriones de pez cebra a dosis crecientes de etanol, la distancia intraocular (IOD) disminuye de un modo dependiente de la dosis (Figura 4) compatible con la naturaleza del defecto congénito humano. Cyclopia sólo se encuentra con dosis muy altas, pero las dosis más bajas no producen una reducción significativa en el IOD (Figura 4), ​​lo que sugiere que este modelo animal tiene un defecto similar en el desarrollo de la línea media facial 10. Con el fin de comprender el mecanismo subyacente de los defectos, tanto en el cuerpo y la cara producido por la exposición a etanol, se trató de determinar los cambios de expresión génica que se producen temprano en el desarrollo y que razonablemente se puede esperar de contribuir a los defectos de desarrollo posteriores. Esto se hace de dos maneras, la extracción de ARNm a partir de embriones permite una evaluación cuantitativa de los niveles de expresión génica en embriones de etanol tratados en comparación con los controles (Figura 1A). Además, se puede realizar in situhibridación para mirar el patrón de genes, independientemente de si o no la señal se disminuye (Figura 1B-G 18). En este ejemplo, dos genes cuya expresión se disminuye después de la exposición a etanol se muestran, Gli1 y six3b. Cuando se analizó el patrón de in situ para six3b, encontramos una reducción en la extensión espacial de la expresión de este gen (Figura 1 EG) en los embriones expuestos a etanol. Una reducción similar se encontró en el SGC gen (Figura BD). Tanto six3b y el GSC se expresan en los tejidos destinados a contribuir a los tejidos craneofaciales la línea media. Así la reducción de estos genes en 8 HPF es consistente con la reducción de IOD encontrado más tarde, como se muestra en la Figura 4. Una vez que los genes que se ven afectados por el etanol se identifican, hay mecanismos por los cuales puede ser la expresión de ellos aumenta o disminuye. En este particular, EXAMPLE, hemos mostrado 2 genes que han disminuido (Gli1 y six3b) por qPCR. Elegimos para inyectar ARNm para determinar si las inversiones de los cambios genéticos pueden mejorar los resultados. Para este experimento, en lugar de la inyección de Gli1, se optó por inyectar shh, un ligando que aumenta los niveles de Gli1. Para six3b, hemos sido capaces de inyectar six3b sí mismo. No se encontraron cambios cuando se inyectan six3b (datos no mostrados), pero fueron capaces de rescatar fundamentalmente los graves defectos en embriones de pez cebra con el suplemento de shh inyecciones (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig1.jpg" /> Figura 1. La exposición etanol cambia el patrón de principios y los niveles de expresión génica de los genes de desarrollo seleccionados. A) qPCR resultados de los embriones en 8hpf. Los resultados de dos genes se muestran: six3b y Gli1. Los resultados muestran como media de tres experimentos separados,y la dosis de etanol que se muestra es del 2,5%. Ambos genes se reducen de manera significativa desde el control (t-test, p &lt;0,05). BG) La hibridación in situ de 8 embriones de pez cebra HPF. Tanto el SGC y los patrones de six3b se alteran en este momento en comparación con los controles. (Modificado con permiso de Loucks et al. 2007). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig2.jpg" /> Figura 2. Desarrollo somitas se altera en embriones tratados. Estructura de los somitas y los ángulos son examinados a las 48 HPF. En los embriones de control (A), somitas tienen una forma de Chevron y un ángulo agudo. Pez cebra expuesto al etanol tiene más ángulos I o somitas en forma de U, y fuerte menos. (Modificado con permiso de Loucks y Ahlgren 2009). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig3.jpg" /> Figura 3. Tratamiento con etanol reduce significativamente la longitud del cuerpo en el pez cebra.La longitud de los embriones no tratados y etanol-expuesta se midieron a 5 días postfertilización. Una reducción significativa en la duración se observó en todos los embriones tratados (ANOVA, p &lt;0,001). BD. Se observó una reducción ligera pero significativa en la longitud total de embriones tratados con 1,0% y 1,5% de etanol, mientras que una mayor reducción se observó en embriones dosificados con 2,0% y 2,5% de etanol. E. Para controlar las diferencias de tamaño en cada embrague, los embriones de control para cada experimento se normalizaron a 100, y los embriones hermanos tratados expresado como un porcentaje de 100. (Modificado con permiso de Loucks y Ahlgren 2009). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig4.jpg" /> Figura 4. Resultados etanol de exposición en una reducción de la distancia intraocular (IOD) en embriones de pez cebra. A) vistas frontales de los embriones muestran fenotipos de los ojos normales y con fusible. B) Las diferentes dosis de etanol administrada durante 3 horas durante la resolución de la gastrulaciónULTS en disminución de iod, cuando los peces se examinan 24 horas después. Ojos fundidos y ciclopía sólo se ven en la dosis más alta probada (2,4%). * Indica una reducción significativa en comparación con los controles IOD. (Modificado con autorización de Ahlgren, 2004). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig5.jpg" /> Figura 5. Shh-N inyección de ARNm rescata a los grandes defectos producidos por la exposición al etanol de pez cebra. Uno-dos embriones de células se inyectaron con 100 pg / nl shh-N ARNm y la mitad de los embriones inyectados fueron expuestos a las dosis estándar de etanol 4,3 a 24 HPF. Los embriones fueron analizados a las 5 de DPF. Los embriones tratados con 2,0% de etanol exhiben dorsal curvada colas más cortas, las somitas en forma de I, y los defectos de los ojos, incluyendo ciclopía. Rescate de estos fenotipos se ve en 71/76 de embriones inyectados (93%). En estos embriones, el cuerpo es recta, los somitas son en forma de chevron, y los ojos están separados por completo.

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No tenemos nada que revelar.

Los métodos descritos aquí y los resultados mostrados demuestran que la punta del pez cebra cómo se puede utilizar para interrogar a defectos de desarrollo. Debido a la accesibilidad del embrión, elevado número de huevos puestos por cada embrague, y una alta reproducibilidad de los resultados, estos vertebrados son ideales para los estudios teratogénicos. Los peces también pueden ser manipuladas para contener moléculas fluorescentes para usar como un reportero visual para un gen particular o vía de interés 19. En los estudios de etanol, las dosis utilizadas parecen ser bastante alta en comparación con los niveles en sangre de mamíferos alcohol. Sin embargo, estos niveles reflejan lo que está presente en el agua, y no todo el etanol se entrega al embrión. En conjunto, los métodos descritos y detallados anteriormente sugieren que los embriones de pez cebra son muy útiles en el modelado de los defectos congénitos humanos relacionados con la exposición de etanol. Por otra parte, los cambios de expresión génica que se encuentran en el pez cebra han sido confirmados por otrosen los sistemas modelo de mamífero 20, lo que sugiere que los efectos sobre el desarrollo de etanol se conservan a través de los vertebrados. Muchas de las técnicas demostradas anteriormente se puede utilizar con otros insultos ambientales o farmacéutica para detectar rápida y fácilmente teratógenos potenciales y determinar los mecanismos subyacentes que contribuyen a la teratogénesis de una sustancia particular.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tejido ARN kit: 5-Primer PerfectPure </td><td> Fisher Scientific </td><td> FP2302410 </td></tr><tr><td> Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG </td><td> Invitrogen </td><td> 11733038 </td></tr><tr><td> mMessage rendimiento mMachine alta tope kit de transcripción de ARN </td><td> Applied Biosystems </td><td> Depende de la ARN polimerasa en su plásmido </td></tr></tbody></table>

assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure

El síndrome de alcoholismo fetal (SAF) es una manifestación grave de la exposición de embriones de etanol. Se presenta con defectos característicos en la cara y los órganos, incluido el retraso mental debido al desarrollo del cerebro desordenado y dañado. Fetal alcohol trastorno del espectro (EDAF) es un término usado para cubrir una serie continua de defectos congénitos que se producen debido al consumo materno de alcohol, y ocurre en aproximadamente el 4% de los niños nacidos en los Estados Unidos. Con el 50% de las mujeres en edad fértil y notificado un consumo de alcohol, y la mitad de todos los embarazos no planificados es, la exposición involuntaria es un problema constante 2. A fin de comprender mejor los daños producidos por el etanol, además de producir un modelo con el que poner a prueba las posibles intervenciones, hemos desarrollado un modelo de exposición de etanol mediante el desarrollo de embriones de pez cebra. El pez cebra es ideal para este tipo de estudio teratógeno 3-8. Cada pareja pone cientos de huevos, que luego pueden ser recogidos sin dañar el adultopeces. El embrión de pez cebra es transparente y puede ser fácilmente imágenes con cualquier número de manchas. El análisis de estos embriones después de la exposición a etanol a diferentes dosis y tiempos de duración y muestra la aplicación que los defectos graves de desarrollo producidos por el etanol son consistentes con el defecto congénito humano. A continuación se describen las técnicas básicas utilizadas para estudiar y manipular el modelo FAS de pez cebra.

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Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

A fin de comprender los mecanismos moleculares de los daños en el desarrollo inducido por etanol, hemos desarrollado un modelo de pez cebra de la exposición de etanol y están explorando las alteraciones físicas, celulares y genéticos que se producen después de la exposición de etanol<sup&gt; 1</sup&gt;. A continuación, tratan de encontrar las posibles intervenciones y rápidamente ponerlos a prueba en este modelo animal.

Evaluación de los cambios teratogénicos en un modelo de pez cebra de la exposición fetal al alcohol

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

26.1K vistas.  Children's Memorial Research Center. A fin de comprender los mecanismos moleculares de los daños en el desarrollo inducido por etanol, hemos desarrollado un modelo de pez cebra de la exposición de etanol y están explorando las alteraciones físicas, celulares y genéticos que se producen después de la exposición de etanol 1. A continuación, tratan de encontrar las posibles intervenciones y rápidamente ponerlos a prueba en este modelo animal.

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The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

El alcohol polivinílico esponja modelo de implantación

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

Investigación

Medicina

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Ecocardiografía Fetal y Ecografía Doppler de onda pulsada en un modelo de conejo de Restricción del crecimiento intrauterino

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is less straightforward than it is in human patients. A widely used behavioral surrogate for hypnosis in rodents is the loss of righting reflex (LORR), or the point at which the animal no longer responds to their innate instinct to avoid the vulnerability of dorsal recumbency. We have developed a system to assess LORR in 24 mice simultaneously while carefully controlling for potential confounds, including temperature fluctuations and varying gas flows. These chambers permit reliable assessment of anesthetic sensitivity as measured by latency to return of the righting reflex (RORR) following a fixed anesthetic exposure. Alternatively, using stepwise increases (or decreases) in anesthetic concentration, the chambers also enable determination of a population's sensitivity to induction (or emergence) as measured by EC50 and Hill slope. Finally, the controlled environmental chambers described here can be adapted for a variety of alternative uses, including inhaled delivery of other drugs, toxicology studies, and simultaneous real-time monitoring of vital signs.

Loss of the righting reflex has long served as a standard behavioral surrogate for unconsciousness, also called hypnosis, in laboratory animals. Alterations in volatile anesthetic sensitivity caused by pharmacological interventions can be detected with a carefully controlled high-throughput assessment system, which may be adapted for delivery of any inhaled therapeutic.

La evaluación de cambios en la volátil Anestésico general La sensibilidad de los ratones después de la intervención farmacológica local o sistémica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Causas Los quistes en el pez cebra Riñones

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Un ratón fetal Modelo de la piel de la reparación de heridas sin cicatrices

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Model Surgical Training: Skills Acquisition in Fetoscopic Laser Photocoagulation of Monochorionic Diamniotic Twin Placenta Using Realistic Simulators

Fetoscopic laser coagulation of arterio-venous anastomoses (AVA) in a monochorionic placenta is the standard of care for twin-twin transfusion syndrome (TTTS), but is technically challenging and can lead to significant complications. Acquiring and maintaining the necessary surgical skills require consistent practice, a critical caseload, and time. Training on realistic surgical simulators can potentially shorten this steep learning curve and enables several proceduralists to acquire procedure-specific skills simultaneously. Here we describe realistic simulators designed to allow the user familiarity with the equipment and specific steps required in the surgical treatment of TTTS, including fetoscopic handling, approaches to anterior and posterior placenta, recognition of anastomoses, and efficient coagulation of vessels. We describe the skills that are especially important in conducting placental laser coagulation that the surgeon can practice on the model and apply in a clinical case. These models can be adapted easily depending on the availability of materials and require standard fetoscopy equipment. Such training systems are complementary to traditional surgical apprenticeships and can be useful aids for fetal medicine units that provide this clinical service.

Practicing the specific skills required for fetoscopic laser coagulation of monochorionic placental anastomoses on realistic models can aid less experienced surgeons in overcoming the steep learning curve associated with this procedure that is now regarded as the standard of care for twin-twin transfusion syndrome.

Entrenamiento quirúrgico modelo: Adquisición de habilidades en el photocoagulation del Laser Fetoscopic de Monochorionic Diamniotic Twin Placenta utilizando simuladores realistas

Fetoscopic laser coagulation of arterio-venous anastomoses (AVA) in a monochorionic placenta is the standard of care for twin-twin transfusion syndrome ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.