Esta labor fue apoyada por R01 GM088156 y T32 HL007713-18. Nos gustaría dar las gracias a Bill Pennie y Michael Carman de la Universidad de Pennsylvania Investigación Instrumentación Shop por su ayuda en el montaje de nuestro aparato reflejo de enderezamiento.

Todos los procedimientos con animales descritos en el presente documento han sido aprobados por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso de Pennsylvania. 1. Descripción general del aparato de ensayo <ol><li> El aparato de prueba consta de 24 cámaras cilíndricas transparentes de acrílico de 10 cm de largo y 5 cm de diámetro (volumen total de 200 ml). Este tamaño es apropiado para un típico 25 g de ratón adulto. Cámaras tienen puertos en cada extremo para la entrada y salida de gas. El extremo de salida es extraíble de modo que los animales pueden ser fácilmente cargados en la cámara. Aberturas del puerto de gas son cuidadosamente selladas con cinta de teflón, y juntas tóricas de goma se utilizan para sellar el extremo desprendible de las cámaras cilíndricas. </li><li> Cada cámara está montada en un bastidor que se encuentra dentro de un baño de agua. El bastidor se monta de manera que se sumerge sólo la parte inferior de las cámaras (por debajo de las entradas de gas). Para la estabilidad, el extremo posterior de la cámara descansa sobre un soporte de modo que toda la chambER se encuentra en posición horizontal. Esto asegura un contacto uniforme de toda la cámara con el baño. </li><li> Tubo de polietileno conecta un tanque de oxígeno a un vaporizador de anestésico, y luego pasa a través de una L / medidor de flujo 10 min. El tubo se divide en 25 resistencias de pequeño diámetro de igual longitud para garantizar la igualdad de flujo se entrega a cada una de las 24 cámaras y a un analizador agente. </li><li> Líneas de vacío salir de cada cámara en el extremo opuesto de la entrada de gas. Esto promueve el flujo unidireccional que elimina reinspiración de dióxido de carbono exhalado. Las líneas de vacío se combinan en un colector para conectarse a una tubería de aspiración de la casa. Una válvula pop-off a lo largo de la línea principal de vacío asegura condiciones de presión atmosférica dentro de cada cámara. </li><li> El baño se llena con agua suficiente para ponerse en contacto completamente la parte inferior de cada cámara. El agua se hace circular a través del baño y se mantuvo a una constante de 37 º C por una bomba. </li></ol> 2. Controle el sistema antes de la exposición <ol><li> Cdiablos que la temperatura del baño de agua es de 37 ° C en todo el baño. </li><li> El flujo de oxígeno a una velocidad de 5 l / min (200 ml / min por la cámara + analizador de agente). Sumerja cada cámara bajo el agua y buscar burbujas o entrada de agua en la cámara, los cuales son indicativos de fugas. Selle todas las fugas antes de comenzar el experimento. </li><li> Para cada cámara, conectar un medidor de flujo de 500 ml / min en la línea después de la cámara para asegurarse de que los flujos son equilibrados a través de cada una de las líneas de gas 25. Esto asegura que los flujos de entrada de 5 l / min se distribuirán de manera uniforme de modo que cada cámara recibe 200 de flujo ml / min. Cualquier cámara de no recibir el flujo esperado debería tener su entrada y el tubo de salida de comprobar si hay obstrucciones. </li><li> Calibrar el analizador de agente para asegurar una lectura de 0.00% isoflurano cuando el 100% de oxígeno está fluyendo. </li></ol> 3. Implante Transponder Temperatura <ol><li> Una semana antes de la habituación, anestesiar a cada ratón con 2% de isoflurano. </li><li> Esterilizar la zona dorsal del cuello con betadine. </li><li> Inyectar por vía subcutánea transpondedor de temperatura entre los omóplatos utilizando el, aguja estéril del inyector preenvasados. </li><li> Supervisar el sitio de la inyección diaria para la infección y la migración del transpondedor. </li></ol> 4. Habituar Animales Chambers Testing <ol><li> Cuatro días antes de la primera evaluación, coloque todos los ratones en cámaras individuales de 2 horas con 100% de oxígeno que fluye. </li><li> Repita el paso 4.1 al día durante los cuatro días previos a la evaluación para evitar los efectos de confusión de estrés debido a un nuevo entorno. </li></ol> 5. Realizar la intervención farmacológica que desea probar los efectos de la anestesia Sensibilidad <ol><li> Esta intervención puede ser una inyección estereotáxica en una parte específica del cerebro 24, una inyección intravenosa o intraperitoneal 25, o la entrega de un fármaco a un área específica del cerebro a través de la cánula 26. </li><li> Debido a que estos mismos procedimientos pueden cambiar la anestesia la sensibilidad en comparación con un animal no expuestos, un grupo de control adecuado debe someterse al mismo procedimiento con inyecciones de vehículo. </li><li> Asegúrese de que la intervención farmacológica tiene una adecuada acción de larga duración si usted está planeando hacer un gradual aumento y / o disminución de determinación de la sensibilidad anestésica como se muestra en el paso 6 de abajo, de lo contrario, vaya al paso 7. </li></ol> 6. Evaluar Anestésico sensibilidad mediante el gradual CE 50 Determinación de inducción y emergencia <ol><li> Coloca cada animal en cámaras individuales con 100% de oxígeno que fluye. </li><li> Ajustar la concentración de isoflurano al 0,4% * durante 15 min. Durante los últimos 2 minutos de este período, evaluar reflejo de enderezamiento de cada animal por suaves ondulaciones de la cámara hasta que el ratón se coloca sobre su espalda. El reflejo de enderezamiento se considera intacta si y sólo si el ratón es capaz de restaurar todosde sus patas a la baja de la cámara dentro de 2 min. <ol><li> * Tenga en cuenta que el 0,4% de isoflurano es una dosis subhipnóticas en ratones C57BL/6J. Si alguno de los ratones pierden su reflejo de enderezamiento en el primer paso, la dosis inicial era demasiado grande y debe reducirse en los días posteriores. </li></ol></li><li> Registre el estado del reflejo de enderezamiento para cada ratón y escanear cada ratón de los datos de temperatura. Se muestra un registro de plantilla en la Tabla 1. </li><li> Aumenta la concentración de isoflurano por ~ 0,05% durante 15 minutos y repita el paso 7.2. Continúe haciendo esto hasta que todos los animales han perdido su reflejo de enderezamiento. </li><li> Opcional: repita el mismo procedimiento para la disminución de las dosis de isoflurano gradual hasta que todos los animales han recuperado su reflejo de enderezamiento (véase el paso 6.3). </li><li> Para finalizar el experimento, apague el isoflurano y lavar el sistema completo con oxígeno al 100% durante 15 min. Esto ayudará a prevenir la hipoxia como los ratones a recuperarse antes de ser devueltos a sus jaulas y protegerá la experimenter de cualquier exposición anestésico. </li><li> Opcional: si el número de animales o el número de concentraciones anestésicas están limitados por falta de recursos o de tiempo, las estimaciones-en particular de los parámetros de la curva de ajuste de la pendiente-May Hill tener estimación del error poco apreciada, falsamente baja. En tales casos, puede ser necesario repetir la medición de la sensibilidad anestésica describe en los pasos 6.1 a 6.6 en un máximo de dos días experimentales adicionales para obtener totalmente parámetro de la verdadera pendiente de Hill y su correspondiente estimación de errores. </li></ol> 7. Evaluar los cambios a corto plazo en Anestésico sensibilidad con tiempo de emergencia <ol><li> Coloca cada animal en cámaras individuales con 100% de oxígeno que fluye. </li><li> Ajustar la concentración de isoflurano al 1,2%, que corresponde a la inducción ED 99 para los ratones C57BL/6J de tipo salvaje 20. Mantener durante 30-60 minutos dependiendo de la duración esperada de la acción de la intervención aguda. </li><li> Confirmar LORR entodos los animales por suaves ondulaciones cada cámara hasta que los ratones se colocan en la espalda. </li><li> Apague el isoflurano y el flujo de oxígeno al 100%. Mida el tiempo hasta que cada animal recupera su reflejo de enderezamiento. Esto se define por la colocación de las cuatro patas en el suelo de la cámara y se confirmó por la presencia de tres pruebas consecutivas con un reflejo de enderezamiento intacta. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque la evaluación de LORR en un solo ratón es una tarea aparentemente sencilla, sin embargo es esencial para mantener las condiciones fisiológicas idénticas entre los sujetos con el fin de recopilar datos fiables a partir de un grupo de animales. El aparato LORR estrictamente regulados, de alta capacidad que aquí se presenta ofrece una manera de estandarizar los experimentos y maximizar la eficiencia. Siguiendo los principios básicos de la termorregulación y la distribución equitativa de flujo, este sistema p...

La anestesia general se definen por su capacidad de causar un estado reversible de la hipnosis en una amplia variedad de especies, sin embargo, una explicación de cómo una clase tan diverso de drogas puede provocar todo un criterio de valoración singular sigue siendo difícil de alcanzar. Un número de teorías se han postulado largo de los años, a partir de la correlación de Meyer-Overton entre la potencia anestésica y solubilidad en lípidos, que sugirió interrupciones general de membrana como la base para el 1,2 hipnosis. La evidencia más reciente sugiere que los objetivos de proteínas que afectan a la señalización neuronal contribuyen a los efectos anestésicos. Los ratones han demostrado ser un modelo indispensable para la exploración de estas teorías debido a la homología entre murino y capacidad de respuesta anestésico humano. Aunque un ratón no puede ser preguntado por su conciencia subjetiva, bajo anestesia general, ciertos reflejos primitivos sirven medidas de sustitución como útiles de la hipnosis de los roedores. En los primeros días después del nacimiento, los ratones desarrollan una resp enderezamiento reflexivaOnse que éstos no pueden ser colocados de forma pasiva en una posición supina 3. La dosis de la anestesia en la que un ratón pierde su reflejo de enderezamiento se correlaciona bien con dosis hipnóticas humanos 4. Evaluación de la pérdida de reflejo de enderezamiento (LORR) se ha convertido en un estándar de laboratorio ampliamente utilizado para las pruebas de sensibilidad anestésica en ratones, así como una variedad de otras especies, incluyendo rata, cobaya, conejo, hurón, ovejas, perro y 5-8. La dosis de un anestésico que se da en la que LORR se producirá para los miembros de una especie es extremadamente consistente, pero puede ser desplazado significativamente por factores ambientales. Por ejemplo, las ratas privadas de sueño son más sensibles tanto a los anestésicos volátiles e intravenosos 9 y ratas con alta capacidad aeróbica son menos sensibles a isoflurano 10. La hipotermia también se ha demostrado que disminuye la dosis de numerosos anestésicos necesarios para la hipnosis en un gran espectro de especies de 11-14. En ordenpara identificar de forma fiable la dosis de anestésico en el que LORR se produce en un grupo de animales experimentales, es crítico que el entorno de evaluación ser controlado cuidadosamente para minimizar el estrés, mantener euthermia, y entregar cantidades iguales de fármaco para todos los sujetos. Como era de esperar, también se conocen los factores genéticos para alterar la sensibilidad anestésica 15-18. En consecuencia, la consideración cuidadosa debe también tener en cuenta el control de los antecedentes genéticos 19. Hemos desarrollado un aparato que asegura la administración de anestesia gaseosa idéntico a cada uno de 24 ratones, mientras que el mantenimiento de un ambiente constante 37 o C. El diseño cilíndrico transparente de nuestras cámaras de exposición permite una evaluación LORR rápido y fácil integración de las mediciones fisiológicas telemétricos. Este sistema ha sido mostrado para medir con precisión el isoflurano, halotano, y la inducción sevoflurano CE 50 y tiempo de emergencia en ratones de tipo salvaje 20. También hemos utilizadoeste sistema para observar los cambios en la sensibilidad anestésica en ratones con mutaciones genéticas y lesiones hipotalámicas dirigidos 21-23. Aquí se describen dos formas en las que la sensibilidad anestésico puede evaluarse después de una intervención farmacológica utilizando nuestro aparato de ambiente controlado. Fenotipado El estado de equilibrio de la inducción de la anestesia volátil y sensibilidad emergencia requiere 8-10 horas y es en consecuencia la mejor medida para estudios en los que las condiciones experimentales no cambian, como en las intervenciones farmacológicas crónicos o de larga duración. Sin embargo, para los tratamientos de corta acción cuyos efectos disiparse significativamente con el tiempo también presentamos un procedimiento simple para evaluar los cambios en los reflejos de recuperación siguientes microinyecciones estereotácticamente-específicas o tratamientos de drogas intravenosas que impactan significativamente la emergencia anestésico. Estas pruebas representan un pequeño subconjunto de las posibles aplicaciones de este sistema de ambiente controlado, lo que podría ser adaptado para cualquier número de subjECTS de una variedad de especies para recibir cualquier tipo de terapéutica inhalado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="461">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:171px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Oxygen</td>
			<td style="width:88px;">Airgas</td>
			<td style="width:88px;">OX300</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:88px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:171px;">Any volatile anesthetic of interest may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Name of Material</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:171px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Mass flow meter- 10 SLPM</td>
			<td style="width:88px;">Omega Engineering</td>
			<td style="width:88px;">FMA-A2309</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Mass flow meter- 500 SCCM</td>
			<td style="width:88px;">Omega Engineering</td>
			<td style="width:88px;">FMA-A2305</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Anesthetic agent analyzer/gas indicator</td>
			<td style="width:88px;">AM Bickford</td>
			<td style="width:88px;">FI-21 Riken</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Heating water pump</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">13-874-175</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Temperature transponders</td>
			<td style="width:88px;">BMDS</td>
			<td style="width:88px;">IPTT-300</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">RF temperature reader</td>
			<td style="width:88px;">BMDS</td>
			<td style="width:88px;">DAS-6007</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention

Un punto final deseable de la anestesia general es el estado de inconsciencia, también conocida como la hipnosis. Definir el estado hipnótico en los animales es menos sencillo de lo que es en pacientes humanos. Un sustituto de comportamiento ampliamente utilizado para la hipnosis en roedores es la pérdida del reflejo de enderezamiento (LORR), o el punto en el que el animal ya no responde a su instinto innato para evitar la vulnerabilidad de decúbito dorsal. Hemos desarrollado un sistema para evaluar LORR en 24 ratones, mientras que al mismo tiempo cuidadosamente de controlar por factores de confusión potenciales, incluyendo fluctuaciones de temperatura y diferentes flujos de gas. Estas cámaras permiten una evaluación fiable de la anestesia la sensibilidad, medido por la latencia para volver del reflejo de enderezamiento (RORR) después de una exposición al anestésico fijo. Alternativamente, usando los aumentos paso a paso (o disminuye) en la concentración de anestésico, las cámaras también permiten la determinación de la sensibilidad de una población a la inducción (o la emergencia) según lo medido porCE 50 y pendiente de Hill. Finalmente, las cámaras ambientales controladas descritos aquí pueden adaptarse para una variedad de usos alternativos, incluyendo la entrega inhalado de otros fármacos, estudios de toxicología, y la monitorización simultánea en tiempo real de los signos vitales.

La Figura 1 demuestra la utilidad del ensayo LORR por etapas para determinar los efectos a largo plazo de una intervención farmacológica. Ácido iboténico (IBA) es un agonista del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) glutamatérgica que se utiliza a menudo como una excitotoxina para causar lesiones neuronales permanentes. Aquí se inyectó 10 nl de 1% IBA bilateralmente en el área preóptica ventrolateral (POVL) de ratones C57BL/6J una semana antes de la prueba. La mayoría de las neuronas de este...

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Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

La pérdida del reflejo de enderezamiento ha servido durante mucho tiempo como un sustituto de comportamiento estándar para la pérdida del conocimiento, también llamada la hipnosis, en animales de laboratorio. Las alteraciones en la sensibilidad anestésico volátil causadas por las intervenciones farmacológicas pueden ser detectados con un sistema de evaluación de alto rendimiento cuidadosamente controlado, que puede adaptarse para la entrega de cualquier terapéutica inhalada.

La evaluación de cambios en la volátil Anestésico general La sensibilidad de los ratones después de la intervención farmacológica local o sistémica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

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Research

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Pharmacology

Medicine

Unit 1

Local Anesthetics

Drugs for Pain Management: Opioid Analgesics and General Anesthetics

SCIENTISTS IN ACTION

13.5K vistas.  Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania.  La pérdida del reflejo de enderezamiento ha servido durante mucho tiempo como un sustituto de comportamiento estándar para la pérdida del conocimiento, también llamada la hipnosis, en animales de laboratorio. Las alteraciones en la sensibilidad anestésico volátil causadas por las intervenciones farmacológicas pueden ser detectados con un sistema de evaluación de alto rendimiento cuidadosamente controlado, que puede adaptarse para la entrega de cualquier terapéut...

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Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Evaluación de los cambios teratogénicos en un modelo de pez cebra de la exposición fetal al alcohol

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Investigación

Medicina

Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. However, due to the small size of the mouse, technical details of the intraoperative monitoring procedure suitable for the mouse were rarely described. Previously we have reported a monitoring procedure to obtain hemodynamic parameters for rats. Now, we adapted the procedure to acquire systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice, a species ten-fold smaller than rats. This film demonstrates the instrumentation of the animals as well as the data acquisition process needed to assess systemic and hepatic hemodynamics in mice. Vital parameters, including body temperature, respiratory&#160;rate&#160;and heart&#160;rate were recorded throughout the whole procedure. Systemic hemodynamic parameters consist of carotid artery pressure (CAP) and central venous pressure (CVP). Hepatic perfusion parameters include portal vein pressure (PVP), portal flow rate as well as the flow rate of the common hepatic artery (table 1). Instrumentation and data acquisition to record the normal values was completed within 1.5 h. Systemic and hepatic hemodynamic parameters remained within normal ranges during this procedure.
This procedure is challenging but feasible. We have already applied this procedure to assess hepatic hemodynamics in normal mice as well as during 70% partial hepatectomy and in liver lobe clamping experiments. Mean PVP after resection (n= 20), was 11.41&#177;2.94 cmH2O which was significantly higher (P&#60;0.05) than before resection (6.87&#177;2.39 cmH2O). The results of liver lobe clamping experiment indicated that this monitoring procedure is sensitive and suitable for detecting small changes in portal pressure and portal flow rate. In conclusion, this procedure is reliable in the hands of an experienced micro-surgeon but should be limited to experiments where mice are absolutely needed.

This film demonstrates how to acquire systemic and hepatic hemodynamics in mice. The whole monitoring includes acquisition of vital parameters, systemic blood pressure, central venous pressure, common hepatic artery flow rate, and portal vein pressure as well as the portal flow rate in mice.

Monitoreo de Parámetros sistémicos y hemodinámicos hepática en ratones

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

El inducible Modelo BM12 del lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones C57BL / 6 ratones

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the silicone compound, via a 26 G catheter, into the portal or hepatic vein. After silicone injection, organs were explanted and prepared for ex-vivo micro-CT (&#181;CT) scanning. The silicone injection procedure is technically challenging. Achieving a successful outcome requires extensive microsurgical experience from the surgeon. One of the challenges of this procedure involves determining the adequate perfusion rate for the silicone compound. The perfusion rate for the silicone compound needs to be defined based on the hemodynamic of the vascular system of interest. Inappropriate perfusion rate can lead to an incomplete perfusion, artificial dilation and rupturing of vascular trees.
The 3D reconstruction of the vascular system was based on CT scans and was achieved using preclinical software such as HepaVision. The quality of the reconstructed vascular tree was directly related to the quality of silicone perfusion. Subsequently computed vascular parameters indicative of vascular growth, such as total vascular volume, were calculated based on the vascular reconstructions. Contrasting the vascular tree with silicone allowed for subsequent histological work-up of the specimen after &#181;CT scanning. The specimen can be subjected to serial sectioning, histological analysis and whole slide scanning, and thereafter to 3D reconstruction of the vascular trees based on histological images. This is the prerequisite for the detection of molecular events and their distribution with respect to the vascular tree. This modified silicone injection procedure can also be used to visualize and reconstruct the vascular systems of other organs. This technique has the potential to be extensively applied to studies concerning vascular anatomy and growth in various animal and disease models.

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using &#181;CT and histological serial sections.

La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological conditions. Partial hepatectomy also facilitates the increased engraftment and proliferation of transplanted cells by accelerating neovascularization and cell migration towards the liver. Here, we describe a simple protocol for performing 30% hepatectomy and transplantation of cells in the spleen of a non-obese diabetic/severe combined immunodeficient NOD.SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J) mouse. 
In this procedure, two small incisions are made. The first incision is to expose and resect the left lobe of the liver, and another small incision is made to expose the spleen for the intrasplenic transplantation of cells. This procedure does not require any specialized surgical skills, and it can be completed in 5-7 minutes with less stress and pain, faster recovery, and better survival. We have demonstrated the transplantation of hepatocytes isolated from a green fluorescent protein (GFP) expressing mouse (Transgenic C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), as well as hepatocyte like cells of human origin (NeoHep) in partially hepatectomized NOD.SCID mice.

We have described a protocol for performing partial hepatectomy (PHx) and cell transplantation via spleen in NOD.SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J) mice. In this protocol, an incision is made to expose and resect the left lobe of the liver followed by another incision for the intrasplenic transplantation of cells.

Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Mecanismo de Salidroside en la supresión de la migración y proliferación de células MCF-7

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

Autor destacado: Explorando los mecanismos moleculares de Salidroside en el tratamiento del cáncer de mama 

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

Exploración de la acción farmacológica y el mecanismo molecular del salidrósido en la inhibición de la proliferación y migración de células MCF-7

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

Desarrollo de un programa de ejercicios para pacientes con artritis reumatoide

Evaluation of Changes in Hydration and Body Cell Mass with Bioelectrical Impedance Analysis after Exercise Program for Rheumatoid Arthritis Patients

Rheumatoid arthritis (RA) is a debilitating disease that can result in complications such as rheumatoid cachexia. While physical exercise has shown benefits for RA patients, its impact on hydration and body cell mass remains uncertain. The presence of pain, inflammation, and joint changes often restrict activity and make traditional body composition assessments unreliable due to altered hydration levels. Bioelectrical impedance is a commonly used method for estimating body composition, but it has limitations since it was primarily developed for the general population and does not consider changes in body composition. On the other hand, bioelectrical impedance vectorial analysis (BIVA) offers a more comprehensive approach. BIVA involves graphically interpreting resistance (R) and reactance (Xc), adjusted for height, to provide valuable information about hydration status and the integrity of the cell mass.
Twelve women with RA were included in this study. At the beginning of the study, hydration and body cell mass measurements were obtained using the BIVA method. Subsequently, the patients participated in a six-month dynamic exercise program encompassing cardiovascular capacity, strength, and coordination training. To evaluate changes in hydration and body cell mass, the differences in the R and Xc parameters, adjusted for height, were compared using BIVA confidence software. The results showed notable changes: resistance decreased after the exercise program, while reactance increased. BIVA, as a classification method, can effectively categorize patients into dehydration, overhydration, normal, athlete, thin, cachectic, and obese categories. This makes it a valuable tool for assessing RA patients, as it provides information independent of body weight or prediction equations. Overall, the implementation of BIVA in this study shed light on the effects of the exercise program on hydration and body cell mass in RA patients. Its advantages lie in its ability to provide comprehensive information and overcome the limitations of traditional body composition assessment methods.

Autor destacado: Implementación de BIVA para analizar los factores de riesgo de enfermedad en pacientes con baja masa celular corporal 

This protocol assesses alterations in hydration and body cell mass status using bioelectrical impedance vectorial analysis following a dynamic exercise program designed for patients with rheumatoid arthritis. The dynamic exercise program itself is detailed, highlighting its components focused on cardiovascular capacity, strength, and coordination. The protocol details steps, instruments, and limitations.

Evaluación de los cambios en la hidratación y la masa celular corporal con análisis de impedancia bioeléctrica después del programa de ejercicio para pacientes con artritis reumatoide

Rheumatoid arthritis (RA) is a debilitating disease that can result in complications such as rheumatoid cachexia. While physical exercise has shown ...