Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.

1. Configuración básica Antes de proceder a la cultura de la célula <ol><li> NeuroCult Medio Basal y NSC NeuroCult Suplementos NSC proliferación se mezclan en una proporción 9:1, respectivamente, para hacer medio completo NSC. </li><li> Un baño de agua 37 ° C se utiliza para calentar el medio. </li><li> Cantidad apropiada de calor inactiva suero fetal bovino (FCS) se descongela. </li><li> Cantidad apropiada de las soluciones madre de factor de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF a 10 g / ml), factor de crecimiento básico de fibroblastos (b-FGF en 10 g / ml) y 0,2% de solución de heparina en tampón fosfato salino (PBS) se descongelan. </li><li> Frascos de cultivo de tejidos (T25, T75 y T175 o) son necesarios para la expansión del Consejo de Seguridad Nacional y la diferenciación. </li><li> El cultivo de tejidos tratados 96 y placas de 24 pocillos y cubreobjetos de vidrio se necesitan para el revestimiento con células seleccionadas. </li></ol> 2. El aislamiento, y Expansión (pases) de NSCs <ol><li> Madre neuronales y progenitores se aislaron y expandieron a partir del ratón blluvia como se describe en protocolos separados 1, 2 3. </li><li> Cuando el neuroesferas (neuroesferas primarias o passaged) están listos para el subcultivo (150-200 micras de diámetro), las esferas medio que contiene se transfiere a un tamaño apropiado estéril tubo de cultivo de tejidos, y se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> El medio sobrenadante se retira y las esferas se re-suspendió en 1 ml de pre-calentado 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Después de la incubación en un baño de agua 37 ° C durante 2-3 min, un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se añade a la suspensión de células para detener la actividad de la tripsina. </li><li> Para garantizar que la tripsina ha sido completamente inactiva, la suspensión celular se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces. </li><li> Después de centrifugación a 800 rpm (110 g) durante 5 min, el sobrenadante se retira y las células se re-suspendió en 1 ml de medio completo NSC. </li><li> 10ul de la suspensión celular se mezcla con 90 l de trypan azul para realizar un recuento de células. Nota: Otros diluciones apropiadas de células también puede ser utilizado. </li><li> Las células se utilizan entonces para subcultivo 1, 2 o para la diferenciación como se describe a continuación. </li></ol> 3. Diferenciación de células madre neurales y células progenitoras, el ensayo de neuroblastos (NBA) <ol><li> Las células resultantes de neuroesferas disociadas se sembraron a una concentración de 2-3 x 10 5 células / ml en el medio completo NSC suplementado con 20 ng / ml de EGF, 10 ng / ml de bFGF, 1 l / ml de 0,2% y 5% de heparina inactivado por calor FCS en un frasco de cultivo de tejido del tamaño apropiado. 5 ml de medio se utiliza para T25, T75 20 ml y 40 ml de matraces T175. Nota: FCS hará que las células se adhieren firmemente al sustrato y no hay necesidad de recubrimiento de los matraces para el cultivo de la NBA. </li><li> Cultoure frascos se incuban en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2 durante 3-4 días. Este período se denomina etapa de proliferación, durante el cual progenie NSC adjuntar al sustrato y proliferar como una monocapa de células. </li><li> Cuando el cultivo se convierte en un 90-95% confluentes, el medio de cada matraz se cambia a la completa medio NSC suplementado con 5% de FCS sin factores de crecimiento. </li><li> Frascos de cultivo se incuba de nuevo en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO 2 durante otros 3-4 días. Este período se denomina etapa de diferenciación, durante el cual los progenitores neuronales aparecen en la parte superior de una monocapa de astrocitos y proliferan para hacer colonias de células inmaduras neuronales. En el día 4-5 de la etapa de diferenciación, la cultura está listo para el aislamiento de las células de neuroblastos que utilizan la tecnología de citometría de flujo. </li></ol> 4. De preparación de células para citometría de flujo Trypsinización <ol><li> El cultivo de diferenciar progenie NSC en días 4-5 de la etapa de diferenciación se lava una vez con una cantidad apropiada de PBS (2 ml para T25, 4 ml para T75 y 8 ml para T175 matraz) para eliminar FCS a partir del cultivo. Nota: FCS bloques de tripsina-EDTA actividad. </li><li> A continuación, una cantidad suficiente de pre-calentado 0,05% de tripsina-EDTA (2 ml para T25, T75 4 ml para y 8 ml para T175 matraz) se añadió a cada matraz para cubrir la monocapa de células y se incubaron durante 1-2 minutos en un 37 ° C humidificado incubadora. </li><li> El matraz se observa bajo el microscopio para evaluar el efecto de tripsina-EDTA en el cultivo. El matraz se mantiene entonces con una mano y golpeó firmemente con la otra mano para desalojar las células de la parte inferior del matraz. </li><li> Volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se añade al matraz para saciar actividad de la tripsina. La suspensión celular se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurar la inactivación de tripsina y para lograr una sola célula homogéneasuspensión. Nota: Como alternativa, el medio suplementado con 5% de FCS se podría utilizar para apagar la actividad de la tripsina. </li><li> Para quitar no disociadas grumos, la suspensión de células se hace pasar a través de un filtro de malla 40-micras de tamaño. </li><li> La suspensión de células se centrifuga a 800 rpm (110g) durante 5 min, el sobrenadante se retiró y las células se resuspenden en un volumen apropiado de medio completo NSC. </li><li> El volumen final de la suspensión celular se ajusta de modo que la densidad celular no exceda de 2-3x10 6 -cells/ml. Alta densidad celular puede causar un bloqueo en el flujo de la citometría de flujo de la máquina. </li><li> Si a usted le gustaría aislar a las células neuronales solo en base a sus propiedades físicas, ahora se puede proceder a la clasificación FACS como se describe en la parte 4. </li><li> Antes de su clasificación, yoduro de propidio (PI, Sigma, 500 ug / ml en PBS) se añade a una concentración de 1 l / ml de suspensión celular para excluir las células muertas. </li></ol> Vivo cell inmunomarcación Para lograr una mayor pureza de las células neuronales, cosechado sola célula de la cultura NBA se pueden teñir para PSA-NCAM (un marcador de principios de progenitores neuronales inmaduras) y después las células positivas de la población neuronal se puede aislar utilizando la máquina FACS. <ol><li> Después de realizar un recuento de células, la suspensión de células individuales a partir del cultivo NBA se divide en cuatro grupos: <ul><li> Las células solas de grupo, sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (0,5-1 x 10 6 células). </li><li> Las células más PI, sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (0,5-10 x 10 6 células). PI células negativas de este grupo también se pueden clasificar según las características físicas células. </li><li> Secundaria solo (control de isotipo) grupo que también sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (1-2 x 10 6 células). </li><li> Inmunomarcaje grupo (8-10 x 10 6 células) que se tiñe para PSA-NCAM para lograrpurificación adicional de las células neuronales inmaduras. Para excluir las células muertas sobre la clasificación, el PI se añade a este grupo también. </li></ul></li><li> Para iniciar inmunomarcaje, las células se centrifugan a 800 rpm (110 g) durante 5 min. Se elimina el sobrenadante y las células se re-suspendió en 100 l de medio completo NSC. </li><li> Ficoeritrina (PE) conjugado anti-PSA-NCAM anticuerpo se añade en una proporción de 10 l / 5-10 x 10 6 células de la suspensión de células que se tiñeron para PSA-NCAM. De la misma manera, un PE ratón conjugado anticuerpo IgG1 isotipo de control se añade a la suspensión de células de control isotipo. Siga las instrucciones sobre la hoja de especificaciones anticuerpo con respecto a la concentración de anticuerpo que se utiliza. La suspensión celular se mezcla entonces suavemente y se incubaron a temperatura ambiente durante 10-15 minutos en la oscuridad. </li><li> Las suspensiones de células (PSA-NCAM y tubos control de isotipo) A continuación se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min, el sobrenadante se retira y las células son re-suspended en 1 ml de medio completo Consejo de Seguridad Nacional. </li><li> Para eliminar el exceso de anticuerpos no-acotados de las muestras, de 4 pasos se repite 2-3 veces. </li><li> Después de volver a suspender las células en un volumen apropiado de medio, yoduro de propidio (PI, Sigma, 500 ug / ml en PBS) se añade a una concentración de 1 l / ml de las suspensiones de células (células más PI, el control de isotipo y PSA- NCAM-manchado muestras) para excluir las células muertas cuando se analizaron por citometría de flujo. </li><li> 15 ml estériles tubos Falcon que contienen 1 ml de medio completo se preparan para recoger las células ordenados de poblaciones de células diferentes. </li></ol> 5. Fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de las neuronas inmaduras <ol><li> La máquina FACS se establece en función de su manual de instrucciones del usuario a través de la citometría de flujo técnico de expertos instalación. </li><li> Tampón fosfato salino (PBS) o cualquier otra solución adecuada Depending en las instrucciones del fabricante, se podría utilizar como fluido de vaina a 28 PSI a través de una boquilla 90 micras. </li><li> La presión diferencial en el sistema se ajusta de tal manera que la tasa de gatillo tipo no exceda de 2500 eventos por segundo. </li><li> La suspensión de células a partir de las células solas grupo se ejecuta a través de la máquina FACS. </li><li> En primer lugar, las células (los acontecimientos) se trazan en función de su tamaño (dispersión frontal (FSC), la luz) frente a la complejidad interna (dispersión lateral (SSC) de la luz) para distinguir las diferentes poblaciones celulares. Para ello, los parámetros de tensión para el FSC y SSC debe ajustarse de modo que las células se puede ver en la trama citometría de flujo. </li><li> Para excluir grupos de células y jubones, las células se trazan primero basado en el área de dispersión frontal (FSC-A) en función del ancho de pulso de dispersión hacia adelante (FSC-W) y la población de células sola es cerrada ya que la población 1 (P1). Luego, las células P1 se trazan sobre la base de área de dispersión lateral (SSC-A) versus dispersión lateral ancho de pulso (FSC-W) y esta vez las células individuales son gated que la población 2 (P2). Después de haber establecido estos dos puertas consecutivas, grupos o dobletes (ancho de pulso de alta del FSC y de alta anchura de pulso de cooperación Sur-Sur) están siendo excluidos. </li><li> Para excluir las células muertas o dañadas, las células individuales (P2) se trazan sobre la base de la reactividad frente al PI FSC-A y la única población de células vivas es cerrada. </li><li> Soltero células vivas se trazan sobre la base de FSC frente a SSC para distinguir las diferentes poblaciones de células basadas en el tamaño celular y la granularidad interna. En esta etapa, dos poblaciones de células principales son activados con la certificación FSC bajo la CSE baja (P3) y FSC alta CSE alta (P4), las poblaciones de células. </li><li> Para ordenar PSA-NCAM inmuno-reactiva las células neuronales inmaduras de la población del FSC bajo la CSE baja, primera baja de la población FSC cooperación Sur-Sur bajo el control de las células (además de IP y control de isotipo) los grupos se ha trazado sobre la base de inmunoreactividad PE frente a FSC-A y el negativo Las células son cerrada (P5), y luego las células positivas de PSA-NCAMgrupo de manchas son cerrada ya que la población 6 (P6). </li><li> Después de ajustar todas las puertas necesarias, las células de los intereses se clasifican en 15 ml en tubos estériles de cultivo de tejidos que contienen 1 ml de medio de NSC. </li><li> Ordenar las células se centrifugan a 1200 rpm (240 g) durante 5 min. </li><li> El sobrenadante se desecha y el sedimento se resuspendió en un volumen apropiado de medio (dependiendo del tamaño de pellets) y un recuento de células se lleva a cabo. </li><li> Las células se cultivaron entonces en poli-L-ornitina revestidos placas de 96 pocillos a una densidad de 20-30 x 10 3 células / pocillo en 200-250 l de medio completo NSC con 5% de FCS y 20 ng / ml humana recombinante BMP4 5 . </li></ol> Nota: para recubrir 96 pocillos, 100 l de poli-L-ornitina solución de trabajo (1,5 ml de poli-O y 8,5 ml de PBS estéril) se añade a cada pocillo y la placa se incubó en un incubador a 37 ° C durante al menos un hora. A continuación, el poli-O se elimina y cada pocillo se lavó tres veces con PBS estéril(Dejar que el PBS permanecen en el pozo durante 10 minutos cada vez). Utilizar 500 l de poli-L-ornitina solución de trabajo / bien si placas de 24 pocillos se utilizan. <ol start="14"><li> Las células se fijan en diferentes puntos temporales después de la orden usando paraformaldehído al 4% y immunostained de adecuados marcadores de células neuronales y gliales para evaluar el fenotipo de las células seleccionadas de diferentes poblaciones de células. </li></ol> 6. Los resultados representativos En el cultivo de ensayo neuroblasto diferenciación (NBA), células cultivadas en placas adjuntar al sustrato de cultivo de tejidos y crecer como una monocapa. Dependiendo de la densidad inicial de siembra de células, la cultura se convierta en una cultura del 90-95% confluentes después de 3-4 días. En esta etapa, una monocapa de células, principalmente los astrocitos pueden ser visualizados por debajo con células pequeñas y redondas progenitoras neuronales en la parte superior 4,5 (Figura 1). Después de cambiar el medio a un medio de factor de crecimiento libre, las células progenitoras neuronales empezardividiendo rápidamente y generar grupos de células inmaduras neuroblast en la parte superior de la monocapa astrocítico en 4-5 días (Figura 2). Análisis de citometría de flujo de disociar la cultura de la NBA en 4-5 días de la etapa de diferenciación, se muestran dos poblaciones de células principales, bajo el FSC y FSC CSE baja alta alta SSC basado en el tamaño celular (FSC) y granularidad interna (SSC) (Figura 3). Inmuno-fluorescencia análisis de las células ordenados demuestra que las células neuronales se encuentran principalmente en las poblaciones de bajo FSC CSE baja (con más del 75% de ellos expresan β-tubulina III), mientras que las células ordenados de la población de alto FSC cooperación Sur-Sur son en su mayoría de alta GFAP astrocitos inmunorreactivas (Figura 4). Purificación adicional de las células neuronales inmaduras hasta cerca de la homogeneidad (97%) se podría lograr con la selección positiva de PSA-NCAM células de infrarrojos de la población del FSC bajo la CSE baja (Figura3, 4). Enriquecidos células neuronales generados a partir de los aislados de NSCs E14 eminencias ratón ganglionares adquirir un fenotipo GABAérgica y expresa DARPP-32, un marcador de neuronas espinosas medias, la diferenciación (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Neuroblasto cultivo de ensayo a partir de células madre de ratón E14 neuronales en el día 4 de la etapa de proliferación. Este cultivo en monocapa se compone de células planas astrocíticos (puntas de flecha) y debajo de todo el las células progenitoras neuronales (flechas) en la parte superior. Original amplificación; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="Figura 2"/> . Figura 2 neuroblasto cultivo de ensayo a partir de células madre de ratón E14 neuronales en el día 4 de la etapa de diferenciación: un contraste de fase), B) la tinción de inmunofluorescencia. Tenga en cuenta el cúmulo de células neuronales inmaduras (flechas en A </strong&gt; y β tinción tubulina III en B) en la parte superior de la monocapa astrocítico (cabezas de flecha en una tinción, GFAP en B). Original amplificación; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="Figura 3"/> . Figura 3 parcelas representativas de clasificación: A). FSC frente a SSC plan de ordenación antes de la exclusión de dobletes y las células muertas. B, C). Ordenar las parcelas de exclusión de dobletes sobre la base de FSC y SSC ancho de pulso. D). La exclusión de las células muertas y dañadas basado en inmunoreactividad yoduro de propidio. E). FSC frente a SSC terreno después de la exclusión de dobletes y las células muertas, mostrando las dos principales poblaciones de la etiqueta como el FSC, SSC baja baja y las altas poblaciones del FSC SSC alta. F, G). Ordenar las parcelas para aislar PSA-NCAM células inmaduras de infrarrojos de la población de bajos FSC CSE baja. Micrografías de la figura 4. Representante de las células ordenadas de distintas poblaciones un día después de placas. A) FSC baja población de la CSE baja (más del 75% de estas células son las neuronas). B) FSC alta población de cooperación Sur-Sur de alto (la mayoría de estas células son los astrocitos ). C) PSA-NCAM + células ordenados de FSC baja población de la CSE baja (casi todas las células seleccionadas son las neuronas). Aumento original, de 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Clasificar las neuronas inmaduras se diferencien en neuronas GABAérgicas (A) y expresa DARPP-32 (B), un marcador de neuronas espinosas medias.

<ol>
	<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis.">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li><li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient.">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La capacidad de aislar las poblaciones definidas de células neuronales (neuronas, es decir, astrocitos y oligodendrocitos) podría resolver algunos de los impedimentos asociados con la aplicación clínica de células madre neurales (NSC). En primer lugar, nos permite caracterizar completamente la población a partir de las células del donante. En segundo lugar, nos permite utilizar un tipo de célula particular, o una combinación de diferentes tipos de células con una proporción específica, dependiendo de la natu...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Medio Basal </td><td> Medio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC proliferación Suplementos </td><td> Suplemento Medio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina de soja </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * Los HEPES </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * Agua destilada </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Cell colador </td><td> Tamiz </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 frasco </td><td> Cultura de la cerámica </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 frasco </td><td> Cultura de la cerámica </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos </td><td> Cultura de la cerámica </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubos </td><td> Cultura de la cerámica </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Factor de crecimiento </td><td> I + D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Factor de crecimiento </td><td> I + D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Factor de crecimiento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituido en PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Anticuerpo </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-IgG1 de ratón conjugado </td><td> Isotipo del anticuerpo de control </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Factor de crecimiento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituido en PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Factor de crecimiento </td><td> I + D </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-OrnitHine </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Suplemento Media </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Anticuerpo </td><td> Dako </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III tubulina </td><td> Anticuerpo </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Para hacer el dobladillo, mezcle 1 x paquete de 10 l de MEM y 160 ml de HEPES 1M y obtener un volumen de 8,75 L con agua destilada. Ajuste el pH final de 7,4 y almacenar a 4 ° C.

the neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry

Las células madre neurales (NSC) puede aislarse y ampliado en gran escala, utilizando el ensayo neuroesfera y diferenciado en los tres tipos principales de células del sistema nervioso central (SNC), a saber, los astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. Estas características hacen de madre neurales y las células progenitoras de una valiosa fuente renovable de células para estudios in vitro, tales como la detección de drogas, neurotoxicología y electrofisiología y también para la terapia de reemplazo celular en muchas enfermedades neurológicas. En la práctica, sin embargo, la heterogeneidad de la progenie Consejo de Seguridad Nacional, la baja producción de neuronas y oligodendrocitos, y el predominio de los astrocitos después de la diferenciación limitan sus aplicaciones clínicas. Aquí se describe una nueva metodología para la purificación de la generación y posterior de las neuronas inmaduras de la progenie NSC murino utilizando fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de tecnología. Utilizando esta metodología, una población neuronal altamente enriquecido de células progenitoras se puede lograr el ingenioHout cualquier astrocito y la contaminación notable de buena fe Consejo de Seguridad Nacional. El procedimiento incluye la diferenciación de la progenie NSC aislaron y expandieron desde E14 eminencias ratón ganglionares utilizando el ensayo neuroesfera, seguido por aislamiento y enriquecimiento de las células neuronales inmaduras en base a sus propiedades físicas (tamaño y complejidad interna) y fluorescente utilizando la tecnología de citometría de flujo. En general, se tarda 5-7 días para generar neuroesferas y los días 6-8 de diferenciar la progenie Consejo de Seguridad Nacional y aislar altamente purificado las células neuronales inmaduras.

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The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Este protocolo de vídeo demuestra un método novedoso para la generación y la posterior purificación de las células progenitoras neuronales de una fuente renovable de células madre neurales (NSC) en base a su físico (granularidad tamaño e interna) y las propiedades fluorescentes utilizando la tecnología de citometría de flujo.

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

the-neuroblast-assay-an-assay-for-generation-enrichment-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K vistas.  The University of Florida. Este protocolo de vídeo demuestra un método novedoso para la generación y la posterior purificación de las células progenitoras neuronales de una fuente renovable de células madre neurales (NSC) en base a su físico (granularidad tamaño e interna) y las propiedades fluorescentes utilizando la tecnología de citometría de flujo.

Video: The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Investigación

Neurociencias

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Citometría de Flujo Protocolos de superficie y intracelular de antígenos Los análisis de los tipos de células neuronales

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

Enumeración de células madre neurales Usando ensayos clonales

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...