Este trabajo fue financiado por el Instituto de Ontario de Investigación del Cáncer (OICR), la Fundación Terry Fox y la Asociación Americana de Cirujanos Neurológicos.

1. Cultivo de tejido del tumor cerebral <ol><li> Añadir 200 l Liberase descongelado (Roche Applied Science) a 15 ml de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa-ver Tabla 1) y ponerlo en un baño a 37 ° C. Liberase TM es una mezcla de enzimas proteolíticas utilizadas para disociar muestras de tejidos primarios, así como tumorspheres cultivadas. A diferencia de tripsina-EDTA, el método Liberase conserva el antígeno CD133 superficie. Para obtener una muestra de tejido de aproximadamente 0,5 cm 3, usamos 200 l de Liberase. Si el tejido es más pequeño, se utiliza 100 ul. </li><li> Llevar la solución de cloruro de amonio (tecnologías de células madre) a temperatura ambiente. Solución de cloruro amónico suavemente lisa las células rojas de la sangre con un mínimo efecto sobre otras células. No contiene un fijador. </li><li> En el gabinete de seguridad biológica estéril, añadir 5 ml de muestra a LCRa recipiente en forma de remolino para lavar tejidos, luego de pipetear. Este paso sirve para eliminar los glóbulos rojos (RBC). </li><li> Transferencia del tejido de tumor cerebral a un estéril 100 mm Petri dish. </li><li> Con unas tijeras finas o bisturís y pinzas, desagregar tejido de consistencia de lechada. </li><li> Recoja la muestra con una pipeta 10 ml regular o fórceps y fragmentos de transferencia en el tubo que contiene precalentado LCRa con Liberase. </li><li> Colocar en una incubadora agitador (30 rpm) y se puso a 37 ° C, durante 15 min. </li><li> Filtrar el lisado de tejido a través de 70 micras filtro de células en un tubo Falcon de 50 ml. </li><li> Haga girar el filtrado abajo a 280 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar con cuidado el sobrenadante y evaluar el tamaño y el color de la sedimento celular resultante: gránulos que son de color rosa o rojo indican números crecientes de células rojas de la sangre. </li><li> Resuspender el sedimento en 1 ml de PBS. </li><li> Añadir una cantidad apropiada de solución de cloruro de amonio (4-12 ml) en base a tamaño de los gránulos y la contaminación de eritrocitos (la solución de cloruro de amonio es muy suave y cantidades aumentadas no son perjudiciales para las células distintas de las células rojas). </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Células Girohacia abajo a 280 xg durante 5 min. </li><li> Lavar una vez con 10 ml de PBS estéril. </li><li> Resuspender en 5 ml de medio NSC completa (Tabla 2) y la transferencia a un ultra-baja unión de 60 mm placa de cultivo de tejidos (Corning). Utilizamos ultra-bajo placas de cultivo de unión con superficies de hidrogel unido covalentemente que son hidrófilos y con carga neutra, para minimizar la adhesión celular mediada por diferenciación. </li></ol> Durante los primeros días en la cultura, no cambian los medios de comunicación: top-up sólo con 1-2 ml de medio, según sea necesario, y luego continuar a observar los medios de cultivo y el cambio en el color de los medios de comunicación se vuelve ligeramente amarillo. 2. Tumorsphere disociación de Citometría de Flujo <ol><li> Evaluar tumorspheres bajo microscopio: si el tamaño de la esfera es&gt; 100 mm, la disociación se recomienda como esferas más grandes pueden llegar a ser necrótico en el centro. </li><li> Traslado cultura a 15 ml tubo cónico. </li><li> Añadir 2-3 ml estéril PBS para enjuagar la placa de fondo y añadir al tubo cónico. </li><li> Centrifugar a 280 xg durante 5 min. </li><li> Remover el sobrenadante y resuspender en 1 a 2 ml de PBS estéril. </li><li> Añadir 10 l Liberase. </li><li> Incubar en baño a 37 ° C durante 3 min. Retire y evaluar visualmente la suspensión, si matas múltiples visto, triturar suavemente con una punta de pipeta de 1.000 l. </li><li> Si persiste la aglutinación, continuar la incubación durante otras 1-2 min. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 5 ml de PBS estéril y centrifugación a 280 xg durante 5 min. </li><li> Remover el sobrenadante y se resuspende en PBS estéril 500-1,000 l EDTA 2 mM. </li><li> Evaluar el número de células y la viabilidad utilizando azul de tripano. </li><li> Ajustar el recuento de células a 1 millón / ml en PBS EDTA 2 mM. </li></ol> 3. Tinción de la superficie <ol><li> Transferir 100 l de suspensión celular 1x10 6 / ml por prueba, tubos de 12x75 mm de caudal. </li><li> Añadir la cantidad apropiada de anticuerpos. Conjunto combinado de controles de isotipo se debe utilizar para cadaanticuerpo (véase la Tabla 3). </li><li> Incubar durante 30 min en hielo. </li><li> Añadir 2 ml de PBS 2 mM EDTA a cada tubo de flujo. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 4 min, se decanta y blot. </li><li> Resuspender el pellet en 300 l de PBS 2 mM EDTA. </li><li> Añadir 10 l de tinte viabilidad 7AAD a cada tubo y se incuba durante al menos 15 min en hielo. </li><li> Analizar mediante citometría de flujo. </li></ol> 4. Citometría de flujo de Adquisición y Análisis Los detalles específicos de adquisición y análisis de datos de flujo son instrumento-dependiente. Representativas muestras negativas se ejecutan y ajustes del instrumento establecido para Adelante (tamaño) y lateral (granularidad) de dispersión. Este patrón de dispersión permite que el usuario final para ver todas las células en la muestra, incluyendo los desechos. Una región es por lo general dibujado alrededor de las células de interés. (Figura 4a) La configuración se establece entonces para todos los detectores de fluorescencia requerida para colocar las células negativas dentro de la primera década del afparcela intensidad luorescence. Cuando más de un colorante o fluorocromo se utiliza, controles individuales teñidas se debe ejecutar para establecer los valores de compensación de color (sustracción de interferir las emisiones de fluorescencia). Cuando se ejecuta células vivas, un colorante de viabilidad tal como 7-AAD (7-amino-actinomicina D - 488/emission excitación 655) se utiliza y una segunda región dibujado para excluir las células muertas (Figura 4b). Ambas de estas regiones se aplican a cualquier otro análisis de las muestras. 5. Auto-renovación Ensayo El ensayo de clave que se facilita en gran medida por el crecimiento clonal esfera es la prueba in vitro de la capacidad de auto-renovación, el ensayo de dilución limitante. Tumorspheres se disocian y se distribuye en diluciones a una única célula por pocillo, y la tasa de formación de esferas posterior durante 7 días en cultivo se calcula. En el día 7, el porcentaje de pozos que no contiene esferas para cada densidad de placas de células (F 0) se calcula y se trazacontra el número de células por pocillo (x). El número de células necesarias para formar al menos un tumorsphere en cada pocillo se determina desde el punto en el cual la línea cruza el nivel de 0,37 (F = 0 e-x). En una distribución de Poisson de las células, F 0 = 0,37 corresponde a la dilución de una célula por pocillo, de modo que este cálculo (el 37% se cruzan) refleja la frecuencia de clonogénicas células madre en la población de células enteras (Figura 5). 6. Single Cell RT-PCR Las células aisladas de diferentes poblaciones están ordenadas por Beckman Coulter MoFlo XDP en los sitios de reacción en una diapositiva AmpliGrid (Beckman Coulter cat # AG480F). Individual de células RT-PCR se realiza usando AmpliGrid individual One Step RT-PCR (Beckman Coulter cat # OAX04515) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. En resumen, una sola célula se deposita en cada sitio de reacción de una diapositiva AmpliGrid; la presencia de una única célula en cadasitio de reacción confirmó por microscopía. Transcripción reversa (RT) se lleva a cabo inmediatamente después de la clasificación para evitar que la muestra se vea comprometida. La mezcla RT maestro está preparado fresco, de acuerdo con las instrucciones del kit (Tabla 4). Se utilizó 0,03 l de 25 cebadores aleatorios mu M (Promega) por reacción; 1 l de mezcla maestra se añade a la centro de cada sitio de reacción. Esta es inmediatamente recubierto con 5 l de solución de sellado (Beckman Coulter cat # OAX04503). Uso de una diapositiva AmpliSpeed ​​ciclador (Beckman Coulter; cat # OAX04101), los portaobjetos se incubaron a 25 ° C durante 10 min, 42 º C durante 10 min, y 55 ° C durante 45 min. Después de la transcripción inversa, 3 l de DNasa / RNasa libre de agua se añade a cada sitio de reacción, y la mezcla entera se transfirió a un tubo de PCR (1 tubo / sitio). En una placa de PCR, un volumen de reacción de 10 l se utiliza para la PCR cuantitativa: 8 l qPCR mezcla maestra (5 l SYBR Green (Quanta), 1 l de agua, 1 l de 10 mM de avance y mezcla de cebador inverso) más 2 &amp;mu; l de la mezcla de RT. Para la cuantificación en tiempo real, las muestras se ejecutan en un termociclador BioRad usando el siguiente programa: 95 º C durante 10 min, 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 60 seg, 72 ° C durante 60 segundos, seguido por 10 min a 72 ° C y el análisis de curva de fusión. Los valores de Ct se determinaron usando Opticon Monitor 3 (BioRad). Tres genes pueden ser evaluados por célula, incluyendo GAPDH como gen de mantenimiento. La expresión génica se normalizó a la expresión de GAPDH, de acuerdo a la 2-? Ct. Por lo menos una docena de células individuales de la misma población de la misma especie se puede utilizar como repeticiones biológica para compensar la falta de repeticiones técnica. 7. Los resultados representativos La figura 1 muestra una imagen de resonancia magnética (IRM) de un paciente con un representante GBM. Muestras de tumores cerebrales son obtenidos a partir de pacientes que consienten inmediatamente después de la cirugía, según lo aprobado por las Ciencias de la Salud de Hamilton / McMaster Health Sciences Junta Ética de Investigación. Una parte de cada muestra se le da a la neuropatólogo para el diagnóstico clínico de rutina. La muestra restante se procesa como se muestra en la Figura 2. Las células tumorales, una vez sembradas en medios completos de células madre neuronales con factores de crecimiento, tumorspheres forma como se muestra en la Figura 3. Las células tumorales están marcados con marcadores neuronales de superficie de células madre CD133 y CD15 y se analizaron por citometría de flujo como se muestra en la Figura 4. Las células individuales de diferentes poblaciones para, por ejemplo, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- continuación, se ordenan en placas de 96 pocillos (figura 5a) o en diapositivas AmpliGrid (Figura 6a). En la placa de 96 pocillos, las células individuales que poseen la capacidad de auto-renovación (por ejemplo células CD133 +), (Figura 5b), pueden formar tumorspheres (Figura 5c) tras incubación. Un gráfico de la auto-renovación puede ser trazado (Figura 5d) contando el número de esferas formadas por pocillo. Las células individuales ordenados en el sitio de reacción de la corredera AmpliGrid (Figura 6a). El ARN extraído a partir de células individuales se pueden transcribe de forma inversa usando el AmpliSpeed ​​Advalytix (Figura 6b). El cDNA obtenido se utiliza para realizar en tiempo real RT-PCR (Figura 6c). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg" /> Figura 1. Imagen por resonancia magnética (MRI) de un paciente GBM. Resonancia magnética del cerebro de un joven de 16 años de edad con una historia de un mes de dolor de cabeza y una historia de una semana de vómitos, letargo y visión borrosa. Secuencia FLAIR axial muestra una gran bi-hemisférico (&quot;mariposa&quot;) GBM. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg" /> Figura 2. Tratamiento de tumores cerebrales. Muestras de tumores cerebrales son obtaINED consentimiento de los pacientes inmediatamente después de la cirugía. Son disociado mecánicamente como se muestra (a) y son entonces enzimáticamente disociarse en aCSF con Liberase por incubación en una incubadora de 30 rpm balanceo a 37 º C durante 15 min (b). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg" /> Figura 3. Poblaciones BTIC formar tumorspheres en cultivo. Disociadas las células tumorales del cerebro sembradas en medios de comunicación completas de células madre neuronales con factores de crecimiento forman tumorspheres. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg" /> Figura 4. Análisis de citometría de flujo de poblaciones BTIC. (A) hacia delante frente a las propiedades de dispersión lateral proporcionan una imagen de todas las células, incluyendo los desechos (b) Las células que se tiñen con el colorante de viabilidad 7-AAD se excluyen del análisis. (C) La posición de los cuadrantes estadísticos se determina usando controles apropiados isotipo (d) Las células tumorales teñidas con superficie markers CD15-PE y APC-CD133. (D) MoFlo clasificador de células XDP. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg" /> Figura 5. Limitando el análisis de dilución de BTICs revela su capacidad de auto-renovación. (A) Células de diluciones variables se ordenan en 96 pocillos que contienen 200 l de NSC a (b) una única célula por pocillo. (C) Después de un período de incubación de 7 días, se forma un tumorsphere. La morfología de tumorspheres secundarios es idéntica a la de tumorspheres primarios. (D) Los medios de intercepción x-valores se pueden calcular a partir de análisis de dilución limitante para cada subtipo de tumor para revelar el número de células necesarias para formar al menos un tumorsphere por pocillo. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg" /> Figura 6. Análisis de expresión génica de una célula única BTICes posible usar sola célula RT-PCR tecnología. (a) células individuales de una población BTIC se pueden ordenar en portaobjetos AmpliGrid. (B) la síntesis de ADNc se realizó en las células individuales en las diapositivas AmpliGrid utilizando el AmpliSpeed ​​Advalytix. (C) Quantitative PCR en tiempo real se realiza en el cDNA sintetizado a partir de células individuales BTIC. <table border="1"><tbody><tr><td> 2 M NaCl </td><td> 62 ml </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO 3 </td><td> 169 ml </td></tr><tr><td> La glucosa 1M </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,9256 ml </td></tr><tr><td> Purelab Ultra H 2 0 </td><td> 749,84 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 1 fluido cerebroespinal artificial (ACSF) -. 1.000 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Basales de los medios de comunicación </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> 480 ml </td></tr><tr><td> N2 suplemento </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 3,0 g </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína (60 mg / ml) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Factor-1 de la supervivencia neuronal (NSF-1) </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Neuronales medios de células madre. NSC completos medios de comunicación (recién hechas antes de su uso): NSC basales medios + 20 ng / ml de EGF (factor de crecimiento epidérmico) + 20 ng / ml de bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico) + 10 ng / ml de LIF (factor inhibidor de la leucemia) * + 10 l / ml de antibiótico-antimicótico * Factor inhibidor de la leucemia (LIF): Este reactivo de Millipore contiene una interleuquina 6 citoquina de clase, un prOtein que suprime la diferenciación espontánea de células madre que promueven el mantenimiento a largo plazo de los cultivos de células madre. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticuerpos </td><td> Proveedor / CAT # </td><td> l / prueba (en 100 l) </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (control de isotipo) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (Isotipo control) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Anticuerpos de flujo. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen (1 reacción) </td><td> Volumen (48 reacción) </td></tr><tr><td> 2x Single Cell tampón de reacción RT </td><td> 0,50 l </td><td> 30,0 l </td></tr><tr><td> Inhibidor de RNasa (10 U / l) </td><td> 0,02 l </td><td> 1,2 l </td></tr><tr><td> 5X Single Cell RT potenciador </td><td> 0,15 l </td><td> 9,00 l </td></tr><tr><td> Single Cell RT Enzyme Mix </td><td> 0,04 l </td><td> 2,4 l </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> L 0,1 </td><td> 6,00 l </td></tr><tr><td> Nucleasa libre de agua </td><td> completar hasta 1 l </td><td> llevar hasta 60 l </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Composición de RT mezcla maestra para RT-PCR Single Cell (cat # OAX04515).

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sorting:+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence.">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166, 747 (1969).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495 (1975).</li><li>Barrett, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+does+not+predict+tumor+growth+potential+in+mouse+models+of+high-grade+glioma.">Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma.</a> Cancer Cell. 21, 11 (2012).</li><li>Venugopal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+marks+intermediate+precursors+during+differentiation+of+human+brain+tumor+initiating+cells.">Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells.</a> Stem Cell Res. 8, 141 (2012).</li><li>Gerlinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).</li><li>Gilbertson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+signalling+a+change+in+treatment.">Medulloblastoma: signalling a change in treatment.</a> Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).</li><li>Zhu, Y., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+genetic+basis+of+neurological+tumours.">The molecular and genetic basis of neurological tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).</li><li>Maher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+genetics+and+biology+of+a+grave+matter.">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15, 1311 (2001).</li><li>Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+eukaryotic+gene+expression.">Noise in eukaryotic gene expression.</a> Nature. 422, 633 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297, 1183 (2002).</li><li>Maheshri, N., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+noisy+genes:+how+cells+function+reliably+with+inherent+variability+in+gene+expression.">Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).</li><li>Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4, e309 (2006).</li><li>Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+individual+genes+in+eukaryotic+cells+occurs+randomly+and+infrequently.">Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently.</a> Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).</li><li>Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).</li><li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR.">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La hipótesis de las células madre de cáncer 10, basado en el trabajo en la leucemia 21, 11 de cáncer de mama y cáncer cerebral 4,5, sugiere que sólo una fracción relativamente pequeña de las células en el tumor, denominadas células madre de cáncer, poseen la habilidad de proliferar extensivamente y auto -renovación. La mayoría de las células tumorales pierden la capacidad de proliferar y de auto-renovación, ya que se diferencian en células que se convierten en la firma fe...

Los tumores cerebrales son algunos de los cánceres más agresivos y heterogéneos conocidos en los seres humanos. A pesar de su detección temprana y el diagnóstico han sido facilitados por la moderna tecnología de neuroimagen, todavía carecemos de terapias curativas para muchos tumores cerebrales, en particular para los difusas, invasivos o localizados profundamente en el cerebro. Los tumores cerebrales representan la principal causa de mortalidad por cáncer en los niños debido a su naturaleza altamente agresivo e incurable a menudo. El glioblastoma (GBM), el tumor cerebral primario más común en los adultos, es uno de los cánceres humanos más agresivos, temían por su pronóstico uniformemente fatal 1. Este tumor altamente maligno astrocytic (OMS grado 4) por lo general ocurre en los hemisferios cerebrales de los adultos, y también puede ocurrir en niños pequeños y bebés. Su crecimiento es rápido y infiltrante y diagnósticos características patológicas incluyen pleomorfismo nuclear, la proliferación microvascular, necrosis y 2,3. Para los adults con diagnóstico reciente de GBM, la supervivencia media rara vez se extiende más allá de 12 meses 1, con respuestas generalmente pobres a todas las modalidades terapéuticas. Hemos observado que hay muchas similitudes funcionales y genéticos compartidos por las células madre somáticas y células cancerosas, y que las vías moleculares que regulan el desarrollo normal del cerebro están a menudo alteradas en cáncer. En la aplicación de paradigmas madre de biología celular para el estudio de los tumores cerebrales, que fueron los primeros investigadores para identificar prospectivamente y purificar una subpoblación de células de GBMs humanos que presentaban las propiedades de células madre de la proliferación, la auto-renovación y diferenciación in vitro y en 4 5 in vivo. Se aplicaron condiciones de cultivo y ensayos originalmente utilizados para caracterizar normales las células madre neurales (NSC) in vitro 6,7 a múltiples tumores cerebrales pediátricos y adultos, y enriquecido para estas células madre-como por clasificación de células para el marcador de superficie celular CD133 progenitora neural 8 ,9. El CD133 + fracción tumor cerebral contenía células que tenían una frecuencia mucho más alta de la iniciación del tumor que la fracción CD133-en-SCID NOD cerebros de ratón 5,10. Este formalmente establecido que sólo un raro subconjunto de las células tumorales del cerebro con propiedades de células madre son iniciadoras del tumor, ganándose el nombre de &quot;tumor cerebral células iniciadoras&quot; o &quot;BTICs&quot;. La identificación novela de BTICs proporciona nuevos conocimientos sobre la tumorigénesis cerebro humano, dando un fuerte apoyo a la hipótesis de las células madre del cáncer 10-13 como base para muchos tumores sólidos, y establece una nueva diana celular de terapias más eficaces contra el cáncer 14-20. Las terapias que se centran en matar a la mayor parte del tumor puede pasar por alto la rara madre como fracción, permitiendo que el tumor siga creciendo. Las terapias que se centran en matar a la célula madre del cáncer pueden proporcionar un mejor tratamiento y pronóstico de los pacientes con tumores cerebrales. Con el fin de estudiar las poblaciones BTIC, hemos mejorado nuestra culture protocolos para seleccionar específicamente para las poblaciones de células dentro de los tumores cerebrales humanos, que poseen propiedades de células madre. Libre de suero, células madre neurales (NSC) medio permite el mantenimiento de un estado indiferenciado de las células madre, y la adición de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), y factor inhibidor de leucemia (LIF) permite la proliferación de multi-potente, la auto-renovación y ampliable tumorspheres humanos. A continuación, se describen los métodos empleados en el procesamiento de los tumores cerebrales primarios y cultivarlas en un medio de NSC para enriquecer a las poblaciones BTIC. Hemos llamado a nuestro sistema modelo experimental &quot;aislados de pacientes BTIC&quot; para enfatizar el hecho de que estas células se cultivan en sólo mínimamente tallo las condiciones para la celda para seleccionar poblaciones de células madre. immunolabelling posterior de poblaciones BTIC clave para marcadores de células madre tales como CD133 y CD15 y el análisis de citometría de flujo también se describe. A continuación se discute el análisis de dilución limitante,que ayuda en el estudio del potencial de auto-renovación de BTICs. Por último, se explora el análisis de la expresión génica de estas células raras clasificar las células individuales en portaobjetos AmpliGrid y la realización de una sola célula de RT-PCR. Estas técnicas son también aplicables a otros tumores cerebrales, tales como meduloblastoma, ependimoma y gliomas pediátricos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> N2 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> Wisent </td><td> 330-050-EL </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25G </td></tr><tr><td> Factor de supervivencia neuronal -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Factor de crecimiento epidérmico (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Factor inhibidor de leucemia (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Antibiótico / micótica </td><td> Wisent </td><td> 450-115-EL </td></tr><tr><td> Liberase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Solución de cloruro de amonio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

Los tumores cerebrales son típicamente compuesto de células morfológicamente distintas que expresan una variedad de marcadores de linaje neural. Sólo una fracción relativamente pequeña de las células en el tumor con propiedades de células madre, denominadas células tumorales cerebrales iniciador (BTICs), poseen una capacidad de diferenciarse a lo largo de múltiples linajes, auto-renovación, e iniciar los tumores in vivo. Se aplicaron condiciones de cultivo usadas originalmente para normales células madre neurales (NSC) a una variedad de tumores cerebrales humanos y se ha encontrado que este método de cultivo selecciona específicamente para como vástago-poblaciones. Medio libre de suero (NSC) permite el mantenimiento de un estado indiferenciado de las células madre, y la adición de bFGF y EGF permite la proliferación de multi-potente, auto-renovación, y tumorspheres expandibles. Para caracterizar aún más la población BTIC cada tumor, se evalúa marcadores de superficie celular por citometría de flujo. También podemos ordenar las poblaciones de interés para characteriz más específicosación. De auto-renovación ensayos se realizan en BTICs individuales ordenados en placas de 96 pocillos; la formación de tumorspheres tras la incubación a 37 ° C indica la presencia de un tallo o células progenitoras. Varios números de celulares de una población en particular también se pueden clasificar en diferentes pozos para limitar el análisis de dilución, para analizar la capacidad de auto-renovación. También se puede estudiar la expresión diferencial de genes dentro de una población celular particular mediante el uso de células individuales de RT-PCR. Los protocolos siguientes describen los procedimientos para la disociación y el cultivo de muestras humanas primarias para enriquecer poblaciones BTIC, así como la disociación de tumorspheres. También se incluyen los protocolos de tinción para el análisis de citometría de flujo o de la clasificación, los ensayos de auto-renovación, y única célula de RT-PCR.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

La identificación de células tumorales cerebrales iniciador (BTICs), las células raras dentro de una heterogéneos tumorales que poseen propiedades de células madre, proporciona nuevos conocimientos sobre la patogénesis humana tumor cerebral. Hemos mejorado las condiciones de cultivo específicos para enriquecer BTICs, y nosotros usamos la citometría de flujo para enriquecer aún más a estas poblaciones. De auto-renovación ensayos y análisis de transcripción por una sola célula de RT-PCR posteriormente se puede realizar en estas células aisladas.

Procesamiento de tejido primario Tumor cerebral para ensayos con células madre y flujo de Ordenación

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

processing-primary-brain-tumor-tissue-for-stem-cell-assays-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K vistas.  McMaster University. La identificación de células tumorales cerebrales iniciador (BTICs), las células raras dentro de una heterogéneos tumorales que poseen propiedades de células madre, proporciona nuevos conocimientos sobre la patogénesis humana tumor cerebral. Hemos mejorado las condiciones de cultivo específicos para enriquecer BTICs, y nosotros usamos la citometría de flujo para enriquecer aún más a estas poblaciones. De auto-renovación ensayos y análisis de transcripción por...

Video: Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

Preparación de células mieloides supresoras derivadas (MDSC) de ingenuo y de páncreas ratones portadores del tumor mediante citometría de flujo magnético y automatizado de células activadas clasificación (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Investigación

Medicina

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumor primario y aislamiento de células MEF para el Estudio de pulmón metástasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Estrategias de muestreo y procesamiento de las muestras de tejido de Biobanco de porcinos modelos biomédicos

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...