El desarrollo de herramientas selectivas de administración de genes y fármacos para tratar los trastornos neurodegenerativos, requiere la cuantificación y caracterización de la focalización celular, tras la re-administración, o vectores virales, o nanopartículas. Tienen capacidades de rendimiento y multiplexación de citometría de flujo, permite la identificación directa y simultánea de múltiples tipos de células desde el cerebro del ratón y la médula espinal. Demostrar el procedimiento estará Francisco Javier Molina Estévez, un post-doc del Laboratorio alexander.
Después de cosechar el cerebro y la médula espinal de un ratón C57 Black 6 de ocho semanas de edad, coloque los tejidos en pozos individuales de una placa de seis pozos, que contiene dos mililitros de HPSS helado por pozo en hielo. Divida cada tejido cosechado en dos trozos iguales. Y usa tijeras para picar la mitad de cada muestra de tejido en trozos de uno a dos milímetros de grosor.
Cuando todos los tejidos se hayan fragmentado, enjuague previamente una punta de pipeta modificada de 1.000 microlitros en HPSS, y utilice la pipeta para transferir cada suspensión de tejido a tubos cónicos individuales de 15 mililitros. Enjuague los pozos con dos mililitros adicionales de HPSS por pozo. Y tire de los lavados en los tubos cónicos correspondientes de 15 mililitros.
Sedimentar las muestras por centrifugación. Y mezcle 50 microlitros de Enzyme P de un kit de disociación de tejido neural con 1.900 microlitros de Buffer X del kit por muestra. Caliente la mezcla enzimática a 37 grados centígrados durante al menos 10 minutos.
Y aspirar el sobrenadante de cada tubo de recolección de tejido. Cuando la mezcla enzimática esté lista, agregue 1,95 mililitros de la solución a cada muestra. Y suavemente vórtice para volver a suspender los pellets.
A continuación, incubar las muestras en una rueda durante 15 minutos a 37 grados centígrados, y mezclar 10 microlitros de enzima A con 20 microlitros de buffer Y por muestra. Precalienta la segunda solución enzimática a 37 grados centígrados, antes de añadir 30 microlitros de la solución a cada solución tisular al final de la incubación del temblor. Utilice una punta de pipeta de 1.000 microlitros, pre-enjuagado con HPSS para mezclar suavemente cada muestra.
Y devolver los especímenes a la rueda durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, detenga las reacciones enzimáticas con 10 mililitros de HPSS helado. Y sedimentar las muestras por centrifugación.
Al final de la centrifugación, vuelva a suspender los pellets en siete mililitros de HPSS helado por tubo. Y atra vórtice suavemente cada muestra, antes de sostener los tubos sobre hielo. Para la homogeneización del tejido, agregue tres mililitros de HPSS preenfriado al mortero de vidrio preenfriado de una trituradora de tejido dounce, y transfiera la segunda mitad de una de las muestras de tejido cerebral o de la médula espinal cosechadas al mortero.
Macerar suavemente el tejido con 10 golpes de Pestle A, seguido de 10 golpes de Pestle B.Y transferir la mezcla homogeneizada en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Llene el tubo hasta un volumen final de 10 mililitros con HPSS preenfriado para centrifugación. Y vuelva a suspender el pellet en siete mililitros de HPSS fresco con vórtice, antes de sostener la muestra sobre hielo.
Para la eliminación de escombros, agregue tres mililitros de solución isotónica Pre-enfriada de Percoll a cada muestra digerida u homogeneizada. Y vórtice suavemente las muestras para asegurarse de que se mezclan homogéneamente. A continuación, centrifugar las muestras y retire cuidadosamente el disco blanquecino de escombros y mielina flotando en la superficie de la solución.
Cuando los escombros hayan sido desechados, recoja todos los microlitros excepto los últimos 100 del sobrenadante de cada tubo sin molestar los pellets. Vuelva a suspender cada pellet en un mililitro de solución FACS BL para transferirlos a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros. Después de esta integración con la solución Percoll, es importante eliminar el disco de escombros y el sobrenadante con mucho cuidado sin desalojar el pellet celular para evitar la pérdida de la muestra.
Después de la centrifugación, aspirar cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo, y volver a suspender los pellets en 350 microlitros de FACS BL fresco por tubo. Para el análisis citométrico de flujo de los tipos de células aisladas, incubar las muestras con cinco microgramos por mililitro de bloque FC por tubo durante 10 minutos a cuatro grados centígrados antes de añadir el anticuerpo adecuado a cada tubo de acuerdo con el protocolo permanente descrito en la tabla. Vórtice cada tubo durante cinco segundos para mezclar.
Y coloque las muestras a cuatro grados centígrados durante 15 minutos protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave las muestras con un mililitro de PBS por tubo y centrífuga. Vuelva a suspender los pellets en el volumen adecuado de estreptavidina por tubo.
Después de la mezcla de vórtices, incubar las muestras durante 10 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz. Y lave las células con un mililitro de PBS por tubo como se ha demostrado. Después de desechar los sobrenadantes, vuelva a suspender los pellets en 300 microlitros de FACS BL fresco por tubo.
Y etiquete cada muestra con cinco microlitros de 7-AAD. A continuación, almacene las muestras a cuatro grados centígrados protegidos de la luz hasta el análisis citofluorométrico. El método de homogeneización produce un mayor rendimiento celular tanto del cerebro como de la médula espinal en general, pero la mayoría de las células recuperadas suelen estar muertas, lo que resulta en una sola y un 14% sanada de células viables del cerebro, y aproximadamente 10% sanada de la médula espinal.
Por el contrario, el método de digestión de la papaína resulta en una mejor preservación general de la viabilidad celular. El análisis de las suspensiones cerebrales y de la célula de la médula espinal con una citometría biflujo de nueve colores, revela la presencia de CD45+CD11b+microglia, y macrófagos. Y CD45+CD11b-linfocitos en ambos tejidos.
Las poblaciones de células CD45 pueden ser discriminadas de acuerdo con su positividad para los marcadores de astrocitos u oligodendrocitos, o la expresión de marcadores de superficie ferional y endotelial. Utilizando el método de homogeneización, entre el 32 y el 38% de las células viables son de origen hematopoyético. Mientras que el método de digestión enzimática resulta en la adquisición de una fracción muy grande de una célula CD45 no hematopoyética.
Sorprendentemente, CD45+CD11b+microglia y macrófagos representan la fracción celular viable más abundante con el método de homogeneización. El método de digestión, sin embargo, produce una representación más heterogénea de los tipos celulares, incluyendo astrocitos, oligodendrocitos, células endoteliales y neuronas. Este protocolo es versátil y podría aprovecharse para varias aplicaciones posteriores, como la cuantificación o el aislamiento de subpoblaciones de células específicas, cultivo primario o análisis bioquímico o secuenciación de ARN.
Hemos implementado este protocolo para evaluar la expresión génica y las firmas funcionales de diferentes poblaciones del SNC durante esta progresión, o después del tratamiento en un modelo de ratón de esclerosis lateral endotrófica.
