<p class="jove_content"&gt; Los autores desean agradecer a Jennifer Strange y Bauman Greg por su ayuda con el análisis de citometría de flujo y clasificación. Este trabajo fue apoyado por el Número de Subvenciones del NIH 2P20 RR020171 de la CNRR y por la Universidad de Kentucky de los fondos de inicio de FM; GIE reconoce el apoyo de la Beca de Postgrado y la Beca Presidencial de Oportunidades de Kentucky.</p

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de capa leucocitaria <ol><li> Adquirir una unidad de la capa leucocitaria del hospital o las inmediaciones del centro de sangre. Nuestro banco de sangre nos da alrededor de 40-60 ml de la capa leucocitaria obtenida por unidad de donantes de sangre normales. </li><li> Verter la sangre en un frasco de vidrio esterilizado 500 ml que contiene PBS estéril para diluir la capa leucocitaria. El volumen final de PBS + capa leucocitaria debe ser de 250 ml. </li><li> Llenar diez tubos cónicos de 50 ml cada uno con 20 ml solución Lymphoprep. </li><li> Suavemente superponer la solución Lymphoprep con 25 ml de la capa leucocitaria diluido, teniendo cuidado de no molestar a la solución Lymphoprep. </li><li> Derivado tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente a 500 x g. Asegúrese de apagar el freno de la centrífuga, por lo que no se perturbe la fracción de linfocitos. </li><li> Recoger las PBMC en la interfase entre la Lymphoprep y las capas medias de plasma con una pipeta. Aspirar el plasma de media hasta alrededor de 1 mltodavía cubre la capa de la capa leucocitaria que contiene las CMSP. Utilice una pipeta de 10 ml para transferir PBMCs ml a un tubo de nuevo 50. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS y después se resuspenden las células en 50 ml de medio RPMI frío para el recuento en un hemocitómetro. La recuperación típica es de 8 x 10 8 - 1 x 10 9 PBMCs. </li></ol> Este procedimiento puede ser reducido para pequeños volúmenes de sangre. La dilución de muestras de sangre entera es de 1:1 en PBS. 2. Selección magnética negativa de las células CD4 + Total de células T, CD4 + CD45RA + células T ingenuas o CD4 + CD45RO + células T de memoria de PBMC usando kits EasySep enriquecimiento (Tecnologías de la célula madre) Pasos a seguir para 1 x 10 8 a 4.25 x 10 8 PBMCs. <ol><li> Resuspender las PBMC a una concentración final de 5 x 10 7 por ml en PBS que contenía 2% de FBS y EDTA 1 mM. Mueva las células a un nuevo tubo de polipropileno 14 ml de fondo redondo. <ol class = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> Aislamiento del total de linfocitos CD4 + células T humanos por parte de la selección negativa: añadir CD4 + humanas de células T Cóctel de enriquecimiento de anticuerpos (50 l por ml de PBMCs), mezcla y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aislamiento de células T humanas no tratados previamente por selección negativa: añadir 50 l de anticuerpo anti-CD45RO por ml de suspensión de células PBMC, mezclar e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Añadir un cóctel de enriquecimiento incluye en el kit (50 l de por ml de CMSP), mezcla y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> El aislamiento de las células T de memoria por selección negativa: añadir CD4 humano de células T de memoria + cocktail de enriquecimiento de anticuerpos (50 l por ml de PBMCs), mezcla y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Mezclar bien para partículas magnéticas igualmente distribuirlos a lo largo de la solución. ¿Es nanopartículas no vórtice del juego de ingenuo. </li><li> Añadir las partículas magnéticas (100 l por ml de PBMCs para CD4 + totales y selección ingenuo células T, 50 l por ml de PBMCs para la selección de células T de memoria). Mezclar pipeteando suavemente 2-3 veces y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para la selección de células T ingenuas o 5 minutos para CD4 de memoria o total + selección de células T. </li><li> Añadir PBS que contenía 2% de FBS y 1 mM de EDTA para llevar el volumen hasta 10 ml por tubo. Mezclar suavemente pipeteando 2-3 veces antes de colocar el tubo sin tope salarial en la plata del imán EasySep durante 5, 10 o 2,5 para el total de CD4 + T cells, subconjuntos ingenua y la memoria, respectivamente. </li><li> Con el tubo aún en imán EasySep, vierta el líquido en un tubo nuevo de 50 ml para aislar las células de interés. </li><li> Repita los pasos 2.5 y 2.6 para una mejor recuperación. </li></ol> 3. Condiciones de cultivo celular para inducir células T reguladoras <ol><li> El día antes de los pasos 1 y 2, las placas de cultivo de tejidos capa por primera diluyendo anticuerpo anti-CD3 (OKT3 clon) a una concentración de 1 mg / ml en PBS estéril. Para una placa de 6 pocillos agregar 2 ml de PBS + anti-CD3 por pozo, por una placa de 12 y agregar 1 ml o una placa de 24 pocillos añadir 500 ml por pocillo. Mantener la placa revestida a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Para preparar el medio de polarización mediante la adición de 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml y 50 mM mercaptoetanol β-a RPMI-1640 suplementado con pre-2,06 mM Glutamax-I y 25 mM tampón HEPES. A continuación, agregue 2 ng / ml de TGF-β y 5 ng / mL de IL-2. Aquí, uno puede agregar ligandos o inhibidores de interés para los medios de comunicación. Resuspender las células de la etapa 2 en una concentración de 2 x 10 6 células / ml de medio de polarización. </li><li> Pre-caliente las placas a 37 ° C y aspirar el PBS de anti-CD3 recubiertos pozos antes de añadir las células. Añadir 4 ml por pocillo de la suspensión celular para una placa de 6 pocillos, 2 ml de células de una placa de 12 o bien 1 ml de células de un 24 pocillos. Rellena los pozos vacíos con PBS para reducir la evaporación de lamedios de comunicación. Incubar durante 3 días a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> El recubrimiento posterior el día 3, la desaceleración placa en una centrífuga durante 5 minutos a 500 x g. Sin perturbar las células T en la parte inferior de la placa, retirar la mitad de los medios de comunicación y reemplazar con medio fresco. Alternativamente, si el bien se convierte en hacinamiento con las células (concentración por encima de 3 x 10 6 / ml), se divide el volumen en partes iguales en otra placa recubierta con anti-CD3 y añadir medio fresco de nuevo hasta el volumen original. Incubar durante dos a tres días más a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> 4. Fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de tres poblaciones de células T <ol><li> Preparar FACS tampón de lavado mediante la adición de 0,5% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) y 2 mM de EDTA a PBS estéril. Tampón a 4 ° C a hacer frío. </li><li> Eliminar las células de cultivo de células bien y enjuagar cada pocillo con 2 ml de PBS para asegurar la recuperación de células completa. Coloque todas las células en tubos de 50 ml de polipropileno y centrifugar a 500 xg durante 10minutos a 4 ° C. </li><li> Contar las células en un hemocitómetro para determinar la densidad celular. </li><li> Lugar 3.5 x 10 5 células por tubo en cuatro diferentes redondo de 5 ml tubos de la base de poliestireno para los controles de compensación. Coloque las células que quedan en tubos de 50 ml de polipropileno, no más de 35 x 10 6 células por tubo. </li><li> Centrifugue las células durante 5 minutos a 4 ° C y los medios de comunicación aspirado. Resuspender las células se ordenan en 90 l de tampón de lavado en frío por 1 x 10 6 células. Resuspender en 100 l de tampón de lavado en frío de los tubos de control de compensación. </li><li> Para las células para ser ordenados, combine 2 l de anti-CD25-PE, 3 l de anti-CD45RA-PE-Cy5 y 1 l de anti-CD127-APC por 1 x 10 6 células. Añadir ningún anticuerpo para el tubo de compensación primer control, 2 l de anti-CD25-PE para el segundo tubo, 3 l de anti-CD45RA - PE-Cy5 al tercer tubo and1 l de anti-CD127-APC para el cuarto tubo. Incubar todos los tubos en hielo durante 45 minutos en la oscuridad. </li><li&gt; Añadir 10 ml de tampón de lavado en frío a las células para ser ordenados y 1 ml a los tubos de compensación de control. Centrifugar todas las células a 500 xg durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Aspirar células de amortiguamiento y resuspende a una concentración de 1 x 10 7 células por ml de tampón de lavado. Añadir 1,5 l de DNasa II por ml de células antes de filtrar a través de un filtro de células 40 mM de nylon. Mueva células a múltiples tubos de 5 ml de polipropileno de fondo redondo con no más de 3,5 ml por tubo. Resuspender las células de compensación de control en 300 L de tampón de lavado. </li><li> Ajuste la compensación en el citómetro de flujo para reducir al mínimo la detección MoFlo cruz por el PE, APC y los filtros de PE-Cy5. Establecer las puertas para ordenar iTregs (CD25 CD127 Hola -/LOW CD45RA - las células), no tratados previamente (CD25-CD45RA +) y memoria (CD25 - CD45RA -) las células T en 5 ml de fondo redondo tubos de poliestireno que contienen 1 ml de suero de ternera recién nacida. </li></ol> 5. Supresión de ensayo <ol><li> Haga Supprmedios ESIÓN de ensayo mediante la adición de 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 5 ng / ml de IL-2 y 2 ng / ml de TGF-β a AIM-V. </li><li> El día del ensayo, purificar heterólogos CD4 + células T de la capa leucocitaria, como se indica en los pasos 1 y 2. Estas serán las células diana para el ensayo de supresión y no contiene células CD25 + Treg, como puede verse en la Figura 2, el día 0. </li><li> Las células que lleven CellTrace kit como las instrucciones del fabricante, excepto con sólo 1 l de solución al 5 mM de existencias por ml de células en lugar de l 2. Mantener fuera de la luz directa, añadir 18 l de DMSO la suministrada por el kit CellTrace a un vial de CFSE para hacer una solución madre 5 mM. Resuspender el número requerido de células diana (hasta un máximo de 1 x 10 7) en precalentado PBS + 0,1% (w / v) de BSA a una concentración final de 1 x 10 6 células / ml. Añadir 1 l de la CFSE 5 mM por ml de las células y se incuba en un baño de agua 37 ° C durante 5 minutES. Añadir 5 volúmenes de medio RPMI completo, enfriado con hielo con FBS al 10% para saciar tinción y se incuba en hielo durante 5 minutos. Lave las células dos veces más con el frío RPMI completo y volver a suspender las de 1 x 10 5 células por cada 100 l de medio de ensayo de supresión. </li><li> Treg cuentas inspector de extinción se encuentran en una concentración de valores de 2 x 10 7 perlas / mL. Pellet un número de perlas igual al número total de células por experimento por centrifugación rápida en un tubo eppendorf. Lavar perlas una vez con RPMI y re-sedimento. Después de la aspiración de RPMI, perlas de volver a suspender de modo que la cantidad apropiada de perlas por pocillo en 8 l de medio de ensayo de supresión. </li><li> Para una placa de cultivo de 96 abajo y todo el tejido, añade manchadas CFSE células (1 x 10 5 células / ml), cuentas del inspector y las células polarizadas y ordenados (1 x 10 5 células / ml) en los medios de comunicación frescas supresión de ensayo a un objetivo deseado (manchada CFSE): efector (ordenados) relación en un volumen final de 200 l. Todas las condiciones se establecen por triplicadoCates. </li><li> Preparar el primero de dos condiciones de control mediante la adición de 100 l de células teñidas CFSE, 8 l de perlas inspector y 1 x 10 5 de células frescas, no teñidas en 92 l medio ensayo supresor por pocillo. Preparar el segundo control con los mismos componentes celulares como las anteriores pero sin Treg cuentas de los inspectores. </li><li> Cubrir la placa en papel de aluminio y se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2 durante cinco días. </li><li> En la oscuridad, muestras de células de cada pocillo por pipeteado y el lugar en un redondo de 5 ml tubo de poliestireno inferior. Centrifugar las células a 500 xg durante 5 minutos a 4 ° C, medios aspirado, y resuspender en 300 l FACS frío tampón de lavado de la etapa 4. Analizar los primeros 3 x 10 4 + CFSE eventos en vivo de la puerta de linfocitos que representa las células diana en un histograma con el software Cell Quest. </li></ol> 6. Los resultados representativos Ejemplo de pseudocolor de citometría de flujo salpican las parcelas durante un tiempo de cinco días-COUdiferenciación RSE iTreg de seguimiento basado en la relación co-expresión de CD25 con FoxP3, CTLA-4 y CD45RA puede verse en la Figura 2. El histograma de la figura 3 muestra un ensayo de supresión con éxito en el que, ordenados iTregs (CD25 Hi CD45RA - CD127 células -/LOW). Son sólo el subconjunto de un cultivo de cinco días que ha adquirido la capacidad reguladora / supresor de la Figura 4 muestra la inducción de células T reguladoras de un grupo de células T ingenuas (paneles superiores) y un grupo de células T de memoria (paneles inferiores), después de cinco días de cultivo en medio iTreg estándar. CFSE tinción de las células iniciales demuestran que tanto las células T vírgenes (panel superior derecho) o de la memoria (panel inferior derecho) se diferencian para iTregs (más altas que expresan las células FoxP3) sólo después de varias rondas de división celular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de procedimiento experimental. PBMCs are separado de la sangre periférica humana mediante centrifugación en gradiente de antes de la selección magnética negativa de las células CD4 + CD25 - las células T. Después de cinco a seis días en cultivo, las células se someten FACS y se co-incubaron con células heterólogas CFSE diana marcadas para medir la actividad supresora. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> Figura 2 purificada CD4 + CD25 humanas primarias -. Las células T se cultivan en iTreg medio. Una parte alícuota de las células se recogieron sólo después del aislamiento (día 0) y en los días 1, 3 y 5 de cultivo celular para controlar el progreso de CD45RA, FoxP3, CTLA 4-CD25 y marcadores. El perfil corresponde a iTreg CD45RA -, FoxP3 Hola, CTLA-4 y CD25 Hi Hi (resaltado en la ventana en el gráfico). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> Figura 3. Purificada CD4 + CFSE laBeled células (1 x 10 5 / pocillo) se cultivaron con Treg cuentas de supresión de los inspectores en la presencia de células ordenados ingenuo, la memoria o iTreg (3 x 10 4 / pocillo). Después de cinco días, las células se recogieron y el perfil CFSE de las células teñidas se analizaron por citometría de flujo. La presencia de células iTreg suprime completamente la proliferación de células T CD4 +. Los números son indicativos de porcentaje de células marcadas CFSE que han sido sometidos a la división. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> Figura 4 humana purificada primaria ingenuo. (CD4 + CD25 - CD45RA +) y memoria (CD4 + CD25 - CD45RO +) las células T están manchadas con CFSE y cultivadas en iTreg medio. Después de cinco días, las células se fenotipo y estimaron las tasas de división celular. Como se indica en la Figura 2, el subconjunto iTreg diferenciarse de ambos subconjuntos corresponde aCD45RA - CD25 Hi Hi FoxP3 y CTLA-4 de alta (estos dos últimos no se muestra). Perfiles comparativos de tinción CFSE identificar iTregs (aquí como la más alta que expresan FoxP3 células T), como las células más proliferativas de la cultura durante cinco días.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Si bien la transferencia TREG es una gran promesa terapéutica para combatir el rechazo del injerto autoinmunidad y otros trastornos inmunes o inflamatorias mediadas, métodos para su generación eficiente y el mantenimiento estable todavía no se han desarrollado. Dado que sólo el 1-5% de la circulación de las células T son células T reguladoras, su expansión controlada y la diferenciación supera esta escasez como un importante elemento de disuasión de la aplicación de células T reguladoras en la clínica. Por...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Mantener a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> Refrigerada de sobremesa Centrífuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Bright-Line Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Humanos células T CD4 + Kit de enriquecimiento </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep CD4 + de memoria Humanos de las células T del kit de enriquecimiento </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Humanos ingenuo CD4 + células T del kit de enriquecimiento </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td> The Big Easy Mag EasySepneto </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 18001 </td><td> Plata </td></tr><tr><td> Redondo de 5 ml tubos de la base de poliestireno </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Tubos de centrífuga de polipropileno </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 de polipropileno ml de fondo redondo de Tubos </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Tubos de centrífuga de polipropileno </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> Humano anticuerpo anti-CD3 </td><td> Bio X de la célula </td><td> BE0001-2 </td><td> Clon: OKT3 </td></tr><tr><td> 24 de poliestireno de cultivo celular Plata </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 Pues bien tejido de fondo redondo cultivo en placa </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 con Glutamax-I y tampón HEPES </td><td> Gibco </td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Suero fetal bovino (SFB) </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> Humana Recombinante TGF-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Humana Recombinante de IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de Suero Bovino (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Clon: 4E3 </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Clon: HI100 </td></tr><tr><td> Ratón anti-humano CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Clon: MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNasa II </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo citómetro de flujo </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo Software </td><td> Árbol Star, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cell Quest Pro Software </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternera recién nacido </td><td> Gibco </td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CFSE CellTrace Proliferación Celular Kit </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg perlas de supresión de Inspector </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 mM de nylon cepa celularer </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

El desarrollo y mantenimiento de las células CD4 + inmunosupresores células T reguladoras (Tregs) contribuir a la tolerancia periférica necesaria para permanecer en homeostasis inmunológica con la gran cantidad de antígenos propios y comensales en y sobre el cuerpo humano. Las perturbaciones en el equilibrio entre las células T reguladoras y células T inflamatorias convencionales puede resultar en la inmunopatología o el cáncer. Aunque la inyección terapéutica de Tregs ha demostrado ser eficaz en modelos murinos de la colitis 1, diabetes tipo I 2, la artritis reumatoide y enfermedad de injerto contra huésped, 4 varias diferencias fundamentales en humanos versus ratón TREG biología 5 hasta ahora ha impedido el uso clínico. La falta de número suficiente, la pureza, la estabilidad y la especificidad de recalada terapéutico Tregs necesaria una plataforma dinámica de desarrollo TREG humana en la que para optimizar las condiciones para su expansión ex vivo 6. Aquí Describe un método para la diferenciación de las células T reguladoras inducidas (iTregs) a partir de un solo donante de sangre periférica humana que se puede dividir en cuatro etapas: el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, la selección magnética de células T CD4 +, en el cultivo celular in vitro y activadas por fluorescencia clasificación de células (FACS) de subconjuntos de células T. Puesto que la transcripción TREG firma factor de forkhead P3 caja (FoxP3) es un factor de transcripción inducida por activación en los seres humanos 7 y ningún otro marcador único existe, un panel de combinatoria de marcadores debe ser utilizado para identificar las células T con actividad supresora. Después de seis días de cultivo, las células de nuestro sistema pueden ser demarcadas en las células T ingenuas, las células T de memoria o iTregs en función de su expresión relativa de CD25 y CD45RA. Mientras que las células T ingenuas de memoria y tienen diferentes informes sobre las necesidades de polarización y plasticidades 8, pre-clasificación de la población de células T inicial en CD45RA + y CD45RO + subconjuntos puede be utiliza para examinar estas discrepancias. De acuerdo con los demás, nuestra CD25 Hola CD45RA - iTregs expresar altos niveles de FoxP3 9, GITR y CTLA 4-11 y bajos niveles de CD127 12. Tras FACS de cada población, las células resultantes pueden ser utilizados en un ensayo supresor que evalúa la capacidad relativa para retardar la proliferación de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-etiquetados células T autólogas.

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

23.9K vistas.  University of Kentucky. Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.