Nuestro protocolo de laboratorio permite la combinación de la edición del genoma humano con la terapia de células T car. El procedimiento de laboratorio es el enfoque con CRISPR-Cas9 para apuntar a hasta tres genes con alta eficiencia. Y, por último, nuestro enfoque puede traducirse en ensayos clínicos en humanos.
Los métodos descritos se pueden aplicar a otras construcciones CAR y genes diana. La base de las técnicas es lo suficientemente robusta como para ser traducida a mayor escala y a colaboradores académicos y de la industria para un mayor desarrollo. Al intentar este protocolo por primera vez, limite el número de grupos en la pantalla de ARN guía para permitir tiempos de incubación precisos.
Adherirse a las condiciones de cultivo y la densidad de siembra como se describe han demostrado ser críticas en nuestra experiencia. Para comenzar, obtenga células mononucleares autólogas de sangre periférica, o PBMC, de donantes voluntarios sanos y aísle las células T CD4 y CD8 positivas utilizando kits de selección de CD4 y CD8 disponibles comercialmente. Combine las células T CD4 positivas y CD8 positivas en una proporción de uno a uno e incube 3 millones de células por mililitro en R10, complementado con 5 nanogramos por mililitro de cada IL7 humana e IL15 humana durante la noche a 37 grados Centígrados.
Al día siguiente, cuente las células T y centrífuga de 5 a 10 millones de células a 300 veces G durante cinco minutos. Deseche todo el sobrenadante y lave el pellet celular en suero reducido mínimo medios esenciales. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de solución de afección nuclear de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Mientras lava las células, prepare una ribonucleoproteína, o complejo RNP, incubando 10 microgramos de nucleasa Cas9 con 5 microgramos de ARN guía único durante 10 minutos a temperatura ambiente. Incluye un simulacro de control sin ARN guía única. Combine las células resescendidas con el complejo RNP y agregue 4.2 microlitros de cuatro potenciadores de electroporación micromolar.
Mezclar bien y transferir a cubetas de electroporación. Electroporar las células usando el código de pulso EH111, luego incubar 5 millones de células por mililitro en R10, complementado con 5 nanogramos por mililitro de IL7 humana e IL15 humana a 30 grados Celsius durante 48 horas en placas de 12 pomos. Después de la incubación, proceda con la activación y expansión de las células T.
Diseñe los cebadores de secuenciación introduciendo la secuencia del amplicón PCR en un software de diseño de imprimación estándar. El software de diseño sugerirá múltiples secuencias de imprimación que son adecuadas para la secuenciación de Sanger. Elija cebadores hacia adelante y hacia atrás que se unan con el amplicón al menos 150 pares de bases aguas arriba o aguas abajo del sitio de corte de ARNg para garantizar una buena calidad de secuenciación alrededor de los indels.
Utilice el análisis TIDE para detectar la eficiencia de knockout a nivel genómico. El algoritmo reconstruye con precisión el espectro de indels a partir de las trazas de secuencia y calcula los valores cuadrados de R. Después de la activación, las células T se expanden en cultivo y se criopreservan para estudios futuros.
Durante la expansión, la duplicación de la población y los cambios de volumen se rastrean en todo el protocolo para las células T CAR simuladas y editadas. No se detectaron cambios significativos en la proliferación y activación durante la expansión. Una vez que las células se criopreservaron, se determinaron los niveles de expresión de CAR para estudios funcionales adicionales tanto para las células T CAR editadas simuladas como para las knockout.
No se observaron cambios significativos. La eficiencia de knockout se puede determinar utilizando múltiples técnicas. En estas parcelas representativas de citometría de flujo, los loci PDCD1 y TRAC se dirigieron utilizando ARN de guía única, mostrando una eficiencia del 90% para el ARN guía único PDCD1 y del 98% para el ARN guía único TRAC a través de múltiples donantes sanos.
Es importante asegurarse de que las proporciones molares de Cas9 y los ARN guía sean precisos. Durante el procedimiento, las células siempre deben mantenerse a cuatro grados centígrados y no dejarse en la solución de electroporación durante largos períodos de tiempo. Después de la preservación de CAR, las células T CAR diseñadas por CRISPR se pueden utilizar para ensayos funcionales in vitro e in vivo, como ensayos de citotoxicidad, producción de citoquinas y modelos de ratón de tumor singenético o xenógrafo.
Nuestro enfoque utilizando la tecnología CRISPR Cas9 ahora se está aplicando a los ensayos clínicos. El enfoque se puede utilizar tanto para el cáncer, como para los trastornos genéticos no malignos, como las hemoglobinopatías, que afectan a millones de niños y adultos en todo el mundo.
