The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O&#8217;Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

NOTA: Este protocolo requiere el uso de muestras de sangre periférica de voluntarios humanos. Todas las investigaciones con seres humanos debe ser revisado y aprobado por un Estudios Humanos Junta de Revisión Institucional para garantizar el cumplimiento de la Declaración de Helsinki (2013) y la Portabilidad del Seguro de Salud y la Ley de Responsabilidad de 1996. 1. Aislamiento de células T de sangre entera <ol><li> Antes de comenzar, calentar el medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente. Alícuota 4 ml de medio de gradiente de densidad en 2-4 estériles de 15 ml tubos de centrífuga cónicos (1 tubo será utilizado por cada 10 ml de volumen total de sangre diluida). </li><li> Obtener 10-20 ml de sangre en aerosol heparina 1-2 de sodio revestido (verde-top) tubos de extracción de sangre venosa. Recoger muestras humanas bajo la supervisión de personas capacitadas y de acuerdo con una Junta de Revisión Institucional protocolo aprobado. </li><li> Limpiar el exterior de los tubos con etanol al 70%. Retire con cuidado la parte superior de la fillenada tubos de recogida y decantar la sangre en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. </li><li> Añadir 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a cada tubo de recogida de sangre. Recoger el PBS, añadir a la sangre entera se decanta, y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 25 mu l T humanas de enriquecimiento celular Cocktail / 2 ml de volumen total. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Usando una pipeta de 10 ml, la capa de hasta 10 ml de la 1: 1 sangre diluida suavemente en la parte superior del medio de gradiente de densidad. Tenga cuidado de no perturbar la superficie del medio de gradiente de densidad. </li><li> Sangre en capas Centrifugar y medio de gradiente de densidad a 1.200 xg durante 20 min a 20 o C. </li><li> Sacar los tubos de la centrífuga, teniendo cuidado de no alterar la interfaz entre el medio de gradiente de densidad y la capa de leucocitos en la interfaz entre el medio de gradiente de densidad y el plasma diluido. Con una pipeta de 5 ml, recoger cuidadosamente la capa leucocitaria y traslado a un nuevo 50 ml bañera cónico estérile. </li><li> Añadir PBS para llevar el volumen de la PBL recogidos a 50 ml y mezclar suavemente. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar. </li><li> Resuspender las células sedimentaron en 10 ml estéril citometría de flujo de la clasificación tampón (PBS filtrada de forma estéril que contiene 1% de BSA). Muestra de 10 l de suspensión celular, se diluye 1:10 (añadir a 90 l) de azul de tripano para contar las células utilizando un hemocitómetro (rendimiento esperado 1-4 x 10 6 células / tubo de sangre total). <ol><li> Eliminar 1 ml alícuota, traslado al tubo de 5 ml, y mantener en hielo para el análisis de las células T no etiquetados por tetrámero. Mantener la suspensión de células en hielo. </li></ol></li></ol> 2. Enriquecimiento magnética de las células T específicas de aloantígeno- <ol><li> Diluir aloantígeno pMHC tetrámero a 1: 100 en tampón de tipo estéril. </li><li> Centrifugar la suspensión celular (9 ml del paso 1,11) a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar. </li><li> Añadir 50 l de diluirse aloantıgeno pMHC tetrámero de peletizadocélulas (hasta 10 7 células). Mezclar por pipeteo suave. Transferir a un tubo de 5 ml estéril. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2 ml de tipo buffer. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar. </li><li> Resuspender las células en 100 l de tampón especie. Añadir 10 l de cóctel de selección de biotina y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 5 l Magnetic nanopartículas y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2,5 ml especie de amortiguamiento y se mezclan suavemente con la pipeta. Quite 100 l alícuota, traslado al tubo de 5 ml, y mantener en hielo para el análisis de las células pre-enriquecimiento. </li><li> Coloque el tubo de 5 ml que contiene la suspensión celular en el imán de separación de células. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidado la tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, decantar el contenido del tubo en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo aeliminar las últimas gotas de líquido. </li><li> Retire el tubo del imán. Añadir 2 ml de tampón de tipo frío y mezclar suavemente con la pipeta. Muestra de 10 l de suspensión celular, diluir 1: 2 (añadir a 10 l) de azul de tripano para contar las células utilizando un hemocitómetro. </li></ol> 3. Preparación de las células T de células Individual Citometría de Flujo clasificación de células <ol><li> Añadir tampón de tipo frío a todos los tubos de células (tetrámero no marcado, marcado con tetrámero-un enriquecido, y tetrámero marcado enriquecido) para llevar el volumen a 3 ml. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C y el tampón de decantación para recuperar las células. </li><li> Resuspender las células sedimentadas en 25 l de tampón especie frío. Añadir 5 l bloque Fc humana. Incubar en hielo durante 20 min. </li><li> Preparar anticuerpos para la clasificación de citometría de flujo. Mezclar 15 l de tampón especie, 15 l anti-CD5, 15 l anti-CD14, y 15 l anti-CD19. </li><li> Añadir 20 l de mezcla de anticuerpos a cada tubo de las células. Incubar en hielo durante 20 min. </li><li> Añadir 2 ml de tampón de tipo frío a cada tubo. </li><li> Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C y el tampón de decantación para recuperar las células. </li><li> Resuspender las células a una concentración de 1 -2 x 10 6 células / ml en tampón de clasificación. </li><li> Alícuota de 100 l de medio de cultivo de células humanas T (DMEM de Iscove suplementado con 2 mM Glutamax, HEPES 10 mM, 50 mg / ml de gentamicina, 50 mM 2-mercaptoetanol, 10% suero AB humano inactivado por calor, y 2,5 humana recombinante ng / ml IL-2) a cada pocillo de una placa redonda de 96 pocillos de cultivo celular de fondo. Mantener en hielo. </li></ol> 4. Aislamiento de células T tetrámero marcado por celda individual Citometría de Flujo Clasificación <ol><li> Establecer citometría de flujo para identificar los parámetros de compuerta aloantígeno-pMHC tetrámero células T marcados (Figura 2.A). Utilice la fracción tetrámero pre-enriquecimiento etiquetados para establecer gating estrategias para eliminar dobletes, puerta de linfocitos, las células que expresan CD19 excluir B y CD14expresando monocitos, e identificar las células T mediante la expresión CD5. Utilice la muestra no etiquetada con tetrámero como una fluorescencia menos uno de control para establecer la gating para la identificación de las células T tetramer vinculante (con 0% de CD5 + CD14 - CD19 - células de la muestra no etiquetada por tetrámero deben caer dentro de esta puerta) . NOTA: Gating estrategias que no son adecuadamente rigurosas dará como resultado el aislamiento de células no T o células T que no son específicas de antígeno, mientras que las estrategias de compuerta excesivamente restrictivas se reducirá el número de células T aisladas. </li><li> Programar los parámetros de la placa de la célula única especie. Dirigir el clasificador para colocar un CD5 + CD14 - CD19 - tetrámero + células en cada pocillo. Dirigir el plato creado para contener 1 pocillo de control negativo (no hay células ordenadas en el pozo) y 1 control positivo también (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetrámero - células) en cada fila (figura 2.B </strong&gt;). </li><li> Uso de la citometría de flujo establecido gating estrategia y la configuración de la placa, aislar células individuales de unión tetrámero-T directamente en la placa de 96 pocillos usando un clasificador de células por citometría de flujo. </li></ol> 5. Cultura y expansión de clones aloantígeno-específicos de células T <ol><li> Después de la finalización de la clasificación de células, la placa se centrifuga a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Lugar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li><li> Vortex estimulantes microperlas anti-CD3 / anti-CD28 durante 30 segundos para volver a suspender cuentas. </li><li> Calcular el volumen de perlas de activador necesarios para la estimulación de las células T recogidas (0,5 l de microperlas de activador / pocillo). Traslado volumen calculado de cuentas estimuladoras a un tubo de 5 ml estéril. Añadir 1 ml de medio de cultivo de células T humanas y de vórtice. </li><li> Coloque el tubo con la suspensión de microperlas en imán. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidadola tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, contenido del tubo de decantación en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo. </li><li> Retire el tubo del imán. Añadir medio de cultivo de células humanas T (100 medianas l / 0,5 l de microperlas añaden inicialmente). </li><li> Alícuota de 100 l de suspensión de perlas activador a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li><li> Monitorear el crecimiento celular diariamente por examen microscópico. Pequeños grupos de células proliferantes pueden ser observados microscópicamente después de 5 - 7 días de cultivo (Figura 3.A). NOTA: Visualización de cultivos de células T en este punto puede ser difícil, y la ausencia de grupos de células observables en esta etapa puede no ser indicativo de una falta de células T en crecimiento. </li><li> A los 14 días después del aislamiento de células, cultivos de alimentación retirando cuidadosamente 100 l de los medios de comunicación fuera de la parte superior de la cultura y la reemplazan con 100 μ; L fresco T humano medio de cultivo celular. Continuar la incubación de placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li><li> Monitorear el crecimiento celular diariamente por examen y evaluación de el color del medio de cultivo microscópico. Grupos de células grandes deben ser visibles al microscopio 2 - 3 días después de que el cambio de medio. Macroscópicamente, los sedimentos celulares deben ser visibles durante los 14 días siguientes al cambio de medio. </li><li> A los 28 días siguientes de aislamiento de células, identificar clones que crecen por el examen microscópico. Transferir el volumen 200 l de los cultivos en placas de 96 pocillos de crecimiento positivo a pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos que contenía 200 medio de cultivo de células T humanas l. </li><li> Añadir 100 l que contenían 12,5 l de microperlas anti-CD3 / anti-CD28 estimuladoras (preparada como se describe en las secciones 5.2 a 5.6). Incubar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li><li> Monitorear el crecimiento del cultivo a diario por ex microscópicaaminación y evaluación de el color del medio de cultivo. Cuando el cultivo de células T alcanza&gt; 2x10 6 / ml (típicamente 3-5 días después de la re-estimulación, se puede estimar por el día en que los medios de comunicación comienza girando amarillo paja), la cultura transferencia a un pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos y añadir 500 l medio celular humana T. </li><li> En 10 a 14 días seguir re-estimulación, recoger 200 l de cultivo de células T para evaluar aloantıgeno especificidad por citometría de flujo análisis de pMHC tetrámero de unión (mediante la estrategia de etiquetado y la compuerta se describe en las secciones 3 y 4.1). </li></ol> 6. A largo plazo Re-estimulación y Cultura de clones de células T <ol><li> Continuamente re-estimular y expandir los cultivos de células T clonales con la especificidad deseada puede ser cada 14 días. Recoger cultivos de células T en un tubo de 5 ml estéril a 14 días después de la última estimulación microperlas anti-CD3 / CD28. Combinar múltiples pocillos de la misma clon de células T en un solo tubo, hasta un volumen de 2,5 ml. </li&gt; <li> Añadir medio para llevar el volumen final a 2,5 ml y mezclar suavemente por pipeteado. </li><li> Coloque el tubo de 5 ml que contiene el cultivo de células T en el imán de separación de células para eliminar microperlas de edad del cultivo. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Retire con cuidado la tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, decantar la suspensión de células en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo para eliminar las últimas gotas de líquido. </li><li> Añadir medio para llevar el volumen final a 4 ml. Muestra de 10 l para contar las células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Recuperar las células T mediante centrifugación a 600 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Decantar el sobrenadante. Resuspender las células T en 10 6 células / T humanas medio de cultivo celular ml. Transferir 1 ml de alícuotas a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. </li><li> Vuelva a estimular las células T mediante la adición de 100 medios de comunicación l que contenía 12,5 l de estimulante anti-CD3 / amicroperlas nti-CD28 (como se describe en las secciones 5.2 a 5.6). Se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4++T+cell+responses.">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This ...

Los linfocitos T son componentes críticos del sistema inmune adaptativo. Las células T son responsables de mediar no sólo directamente respuestas inmunes protectoras a los agentes patógenos a través de una variedad de mecanismos efectores, sino también mantener activamente la auto-tolerancia inmunológica y dirigir las respuestas de otras células en el sistema inmune. Estas funciones están dirigidas a través de un número de señales integradas, incluyendo receptores de células T (TCR) de la ligación, citocinas y quimiocinas, y los metabolitos 1. De estas señales, el TCR es de particular importancia, ya que proporciona la especificidad característica que define el papel de la célula T en la inmunidad adaptativa. Un TCR interactúa con antígenos peptídicos lineales presentados por MHC (HLA ortólogo humano) moléculas (complejos pMHC) de una manera altamente específica y sensible para proporcionar las señales que inician la función efectora de células T. Los parámetros bioquímicos de las interacciones de TCR con ligandos pMHC proporcionan no sólo la especificidad para Tactivación de las células, sino que también tiene un impacto cualitativo en función de la célula posterior T2. Por lo tanto, el estudio de la función de las células T a menudo requiere el examen de las respuestas de las células T clonales con especificidad antigénica definida. El compartimiento humana de células T, que contiene aproximadamente 10 12 células T αβ, contiene un estimado de julio 10 a agosto 10 αβTCRs distintas 3-4. Este diverso repertorio ofrece oportunidad para el reconocimiento de la gran variedad de péptidos de patógenos potenciales que requeriría una respuesta de células T para la inmunidad protectora. Se estima que la frecuencia de células T en respuesta a un antígeno extraño dado presentado por auto-MHC es del orden de 10 -4 a 10 -7 en ausencia de respuesta inmune antes de que el antígeno 5. El repertorio de células T naive está determinada por la selección tímica para asegurar la capacidad de reconocer auto-MHC presentación de antígenos peptídicos y límite reaccionanividad contra antígenos auto-péptido, la maximización de la utilidad potencial para mediar la inmunidad protectora 2. Sin embargo, en violación de esta diseñado reactividad, una frecuencia relativamente grande, 10 -3-10 -4, de las células T de individuos inmunológicamente ingenuos responder a la estimulación con células alogénicas, reconociendo tanto las moléculas MHC extranjeros así como los péptidos endógenos que presentan 6. El reconocimiento de ligandos pMHC alogénicos es estructuralmente similar al reconocimiento de antígenos extraños presentados por auto-MHC; el TCR hace interacciones bioquímicas críticos tanto con la molécula MHC alogénico, así como el péptido presentado 7. La naturaleza robusta de la respuesta de las células T alogénicas a resultados de la estimulación de la diversidad de los complejos pMHC presente en la superficie de las células alogénicas 8. Se estima que cada MHC presenta aproximadamente 2 x 10 4 diferentes antígenos peptídicos endógenos 9. Este breadth de la respuesta a la estimulación alogénica es un aspecto significativo de la patología clínicamente relevantes, tales como el rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped (EICH), como resultado de alorreactividad de células T. Estudio de células T respuestas alorreactivas humanos se ha basado tradicionalmente en el examen de las respuestas policlonales de células T vírgenes después de la estimulación con células alogénicas. La estimulación repetida con la misma línea celular alogénico combinado con análisis de dilución limitante es capaz de generar células T clonales con el reconocimiento alogénico HLA definida de 10. Sin embargo, este enfoque es problemático para el examen de las respuestas a ligandos pMHC alogénicos individuales, como el repertorio amplio y diverso de complejos pMHC endógeno presente durante un determinado alogénico HLA estimula un amplio repertorio de células T. Esta estimulación población mayor y la limitación de la dilución enfoque requeriría de cribado de un gran número de clones para aislar células T con la deseada Reactividad contra un único ligando pMHC. Además, la frecuencia de células T que responden a un ligando pMHC alogénico individual es relativamente baja entre las poblaciones de células T ingenuas, que presenta una barrera para la generación eficiente de clones de células T humanos que responden a un antígeno dado. La identificación y el aislamiento de las células T específicas de antígeno de las poblaciones policlonales se han habilitado por el desarrollo de fluoróforo marcado pMHC multímeros 11. Este enfoque utiliza antígenos peptídicos específicos cargados en moléculas MHC solubles biotiniladas recombinantes, que se etiquetan mediante la unión a un fluoróforo marcado con estreptavidina. La multimerización de pMHC aumenta la avidez, la compensación de la afinidad del TCR intrínsecamente baja (M) para ligandos solubles pMHC. Las células marcadas pueden ser identificados y aislados por citometría de flujo. Sin embargo, este enfoque todavía está limitado por la baja frecuencia de células T específicas de antígeno entre las poblaciones de células T vírgenes, que son típicamenteórdenes de magnitud menor que el límite de la identificación y la cuantificación precisa en la mayoría de los citómetros de flujo. Para abordar esta limitación, un método de etiquetado tetrámero pMHC y posterior enriquecimiento perla magnética para las células tetrámero marcado ha sido desarrollado 12. Este método ha demostrado una detección fiable, enumeración, y el aislamiento de células T específicas de antígeno de baja frecuencia. Este protocolo describe un protocolo eficaz para la generación de clones humanos de células T que responden específicamente a ligandos pMHC alogénicos individuales. El protocolo se aplica pMHC (HLA) etiquetado multímero y enriquecimiento para el aislamiento de células T humanas-aloantígeno específico con citometría de flujo de células de clasificación y un método robusto para el cultivo in vitro de células T humanas para permitir la producción de clones de células T de células clasificadas individuales ( visión general en la Figura 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm</td>
			<td style="width:223px;">Becton, Dickenson and Company</td>
			<td style="width:119px;">366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Lymphoprep</td>
			<td style="width:223px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:273px;">Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit</td>
			<td style="width:223px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dulbecco&#39;s PBS, 1x without Ca or Mg</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E6635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Fluorophore-labeled pMHC tetramer</td>
			<td style="width:223px;">NIH Tetramer Facility</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EasySep Biotin Selection Kit</td>
			<td style="width:223px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EasySep Selection magnet</td>
			<td style="width:223px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:273px;">TruStain FcX Human Fc blocking solution</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">422301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">300621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-CD14 FITC (clone HCD14)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">325603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-CD19 FITC (clone HIB19)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">302205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Iscove&#39;s DMEM, without b-ME or L-glutamine</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">15-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HEPES</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">b-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Glutamax</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Gentamicin sulfate (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:223px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GT-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Human AB serum, male donor</td>
			<td style="width:223px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Recombinant human IL-2</td>
			<td style="width:223px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF 200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Media</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cell sorting buffer</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:223px;">1 L</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">BSA</td>
			<td style="width:223px;">10g</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">EDTA (0.5 M)</td>
			<td style="width:223px;">2 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Human T Cell Culture Medium</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Iscove&#39;s DMEM</td>
			<td style="width:223px;">351.6 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Heat-inactivated human AB serum</td>
			<td style="width:223px;">40 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HEPES (1 M)</td>
			<td style="width:223px;">4 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Glutamax (100 x)</td>
			<td style="width:223px;">4 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:223px;">0.4 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">b-mercaptoethanol (14.3 M)</td>
			<td style="width:223px;">1.4 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Recombinant human IL-2 (1 mg/ml)</td>
			<td style="width:223px;">1 ml</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human alloantigen-specific t cells from peripheral blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

Este protocolo describe la generación de cultivos de células humanas T clonal con aloantígeno especificidad definida a través de un enriquecimiento de perla magnética y flujo de una sola célula de clasificación de citometría de estrategia. La Figura 1 proporciona un esquema del proceso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> Figura 1: Visión general de Protocolo El protoco...

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Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.8K vistas.  University of California, San Diego. This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.