Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (beca posdoctoral de AYS) y los Institutos Nacionales de Salud (MH085499, EB003832 y OD006831 a DK). Damos las gracias a Bet Friedman y Blinder Pablo de comentarios sobre el manuscrito.

1. Preparativos para la operación i <ol><li> Limpiar los instrumentos quirúrgicos por tratamiento con ultrasonidos en una mezcla de leche Maxizyme y Quirúrgicas en un limpiador ultrasónico. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos antes de cada experimento. </li><li> Asegúrese de que todos los reactivos necesarios y desechables están disponibles. Una lista de los reactivos y desechables se proporciona en la Tabla 2. Los reactivos y material desechable que entran en contacto con los tejidos expuestos deben ser estériles, cuando sea posible. </li><li> Inducir la anestesia. Anestésicos típicos adecuados para estudios de supervivencia se describen en la Tabla 1. Asegúrese de plano quirúrgico de anestesia mediante la comprobación de la falta de reflejo de los pies pizca. La edad óptima de ratón es de 3 a 6 semanas de edad. Los cráneos de los ratones más jóvenes son más suaves y más difícil de fina. Los ratones más viejos tienen más gruesos cráneos que sangran más durante el proceso de adelgazamiento. </li><li> Asegure que el animal en un marco estereotáxico 1. Una lista de equipo quirúrgico se proporciona en la Tabla 2. </li><li> Mantener la temperatura corporaltura a 37 ° C por medio de una retroalimentación regular de la sonda rectal y almohadilla de calor. </li><li> Aplique una pomada oftálmica a los ojos para retener la humedad. </li><li> Afeitar el cuero cabelludo con una navaja de afeitar eléctrica pequeña. </li><li> Limpiar el cuero cabelludo con Betadine, seguido por raspado con 70% (v / v) de alcohol isopropílico. </li><li> Si lo desea, compruebe que la frecuencia cardíaca y la respiración estén dentro del rango normal con un oxímetro de pulso. Para un ratón, estas cifras deben centrarse alrededor de 10 Hz y 2, respectivamente. </li><li> Calentar una parte alícuota de esterilizada por filtración artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF) a 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM de glucosa, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM de MgCl 2, pH 7,4) (todos los productos químicos de Sigma) 2. </li></ol> 2. Montaje de un marco para la cabeza <ol><li> Quitar el cuero cabelludo sobre la superficie del cráneo dorsal entero con un par de pinzas y tijeras quirúrgicas. Recortar la piel lateralmente a los bordes de los músculos temporales a cada lado del cráneo y posterior a los músculos del cuello (fig. 1A). </li><li> Utilizar una hoja de bisturí para eliminar el periostio delgada de la superficie del cráneo. </li><li> Limpie el cráneo con un algodón húmedo aplicador con punta y secar la superficie del cráneo con una corriente de aire de un polvo posible. A continuación, aplicar una capa delgada de pegamento de cianoacrilato a toda la superficie del cráneo. Deje que el pegamento se seque completamente. Esta capa de pegamento es necesario para la adherencia adecuada del cemento dental en pasos posteriores. El pegamento de cianoacrilato no necesita ser esterilizado. </li><li> Coloque un conector de metal a la superficie del cráneo, lejos de la zona de la ventana deseada. Para los preparados anestesiados, una tuerca pequeña puede ser asegurada al cráneo con una gota de pegamento de cianoacrilato, que más tarde puede ser atornillado en la configuración de imagen usando un perno (Fig. 1B, 1L y 1N). Sellar la parte posterior de la tuerca con la cinta para asegurar que el pegamento no entra en los hilos durante la colocación en el cráneo. La tuerca y la cinta debe ser esterilizado<html> en autoclave antes de la cirugía. </li><li> Para la preparación de imágenes despiertan, adjuntar un conector personalizado más rígido con dos puntos de fijación (Fig. 1M y 1N). Haga dos agujeros en el cráneo en el hemisferio contralateral cortical con una fresa de ½ mm de perforación, a continuación, introducir dos # 000 tornillos autorroscantes. Estos tornillos le ayudará a anclar la cabeza montar en el cráneo. Aplicar sólo una vuelta completa del tornillo, con el fin de evitar la aplicación de presión a la corteza subyacente. Luego, coloque la barra de metal cruz personalizado con un pequeño toque de pegamento de cianoacrilato en el cerebelo. Deje que el pegamento de cianoacrilato se seque completamente. Este conector de metal reduce en gran medida los grados de libertad y simplifica el traslado de la campo de la imagen misma en estudios longitudinales. Una barra transversal de ancho ofrece un amplio espacio para la colocación de electrodos y la estimulación de vibrisas. Planes detallados para la generación de la cabeza de montaje personalizado y dispositivo de fijación están disponibles en línea (SICS / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Los tornillos y barras cruzadas deben ser esterilizados en autoclave antes de la cirugía. </li><li> Cubrir la superficie del cráneo completo, excluyendo la ubicación de la ventana, con una capa de cemento dental (Fig. 1C y 1D). Asegurarse de que todos los bordes de la piel expuestas están cubiertas por el cemento. Los componentes del cemento dental no necesitan ser esterilizados. </li></ol> 3. La generación de un pulido y reforzado Diluido y el cráneo (puertos) Ventana <ol><li> Asegúrese de que las rebabas de perforación son nítidas y evitar su reutilización. Utilizando una velocidad baja en el taladro dental, delgada de 2 mm por 2 mm de la región en la corteza somatosensorial con un ½ mm rebabas. Alternar entre mojar el cráneo con ACSF y luego de secar la superficie del cráneo con una suave corriente de aire procedente de un plumero de gas, para la refrigeración húmeda y seca para el adelgazamiento. Para ello es necesario adelgazamiento en la capa esponjosa del cráneo, que puede sangrar, pero puede ser controlled mediante el lavado con ACSF (Fig. 1E). El cráneo empieza a flexionar bajo la ligera presión de la broca cuando está aproximadamente 50 micras, y los vasos piales debe ser visible a través del hueso húmedo (Fig. 1F). En este espesor, pequeñas manchas blancas en el hueso será visible durante unos pocos segundos inmediatamente después de la superficie del cráneo seco se humedece. </li><li> En este punto, el hueso delgado aún más. Utilice una velocidad de perforación más lenta, es decir, 1.000 rpm, lo que se afeita la superficie del cráneo con sólo un ligero toque. Use pequeños movimientos controlados mientras se mantiene el taladro como una pluma y sólo aplicar la fuerza en la dirección lateral. El hueso debe ser ~ de 10 a 15 micras en su espesor final (Fig. 1G). Cuando el hueso es lo suficientemente delgada, las pequeñas manchas blancas en el hueso ya no será visible cuando la superficie del cráneo seco se humedece. </li><li> Pulir la región de ventana con polvo de óxido de estaño. Adjunte una broca de pre-hecho que se ha sumergido en el sellador de silicona del acuario y conelaborado, dejando a un látigo cónico (en el recuadro, la figura. 1H). El látigo de silicona debe ser preparado por lo menos un día antes de la cirugía, y se esteriliza con isopropanol al 70% antes de su uso. Ponga una pizca de polvo en la ventana junto con una gota de ACSF (Fig. 1H). Agitar la suspensión durante la ventana de hasta diez minutos tocando suavemente la punta del látigo en movimiento a la superficie del cráneo. Quitarse el polvo de óxido de estaño a fondo de la ventana con ACSF y secar el hueso completamente con una suave corriente de aire. Irregularidades de la superficie y chips óseos dejados por los adherentes de perforación en los pasos anteriores deben retirarse después del pulido (Fig. 1H y 1I). El polvo de óxido de estaño no necesita ser esterilizado. </li><li> Corte los pedazos cuadrados de ninguna. 0 cubierta de vidrio ligeramente más pequeño que el tamaño de la ventana. Use un escriba para anotar cuidadosamente separados líneas horizontales y verticales en la hoja de la cubierta usando un borde recto. A continuación, coloque el cubreobjetos en una placa de Petri y knock el plato contra un borde de la mesa para separar las piezas de vidrio. La totalidad de placa de Petri se puede entonces en autoclave para garantizar la esterilidad. </li><li> Coloque una cubierta de vidrio de tamaño adecuado cerca de la ventana de secado. Aplique una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato sobre la ventana con la punta de un aplicador de madera rota punta de algodón, y rápidamente empuja la pieza precortada de la cubierta de vidrio encima de la cola. Evitar la creación de burbujas debajo de la cubierta de vidrio. Empuje suavemente la cubierta de vidrio contra la superficie del cráneo, y mantener durante unos segundos (Fig. 1J y 1O). Deje que el pegamento se seque completamente durante 15 minutos. El exceso de pegamento de cianoacrilato se puede quitar de la superficie superior de la cubierta de vidrio con una hoja de bisturí después se secó. Sellar los bordes de la cubierta de vidrio con cemento dental y formar un ligeramente elevado así para retener el agua para la lente de inmersión (Fig. 1K y 1O). </li></ol> 4. Recuperación <ol><li> Colocar el animal en una jaula de la cirugía siguiente tibia. Supervisar ellos animales periódicamente hasta que se recupere completamente de la anestesia. </li><li> Si la preparación está destinada a sobrevivir durante más de un día, que la buprenorfina (0,03 mg por roedores g) para la analgesia. Por lo general la imagen del animal por lo menos un día después de la implantación inicial. </li></ol> 5. Preparación de imágenes <ol><li> Estabilizar el animal en una mesa óptica para formación de imágenes, utilizando el marco como un soporte para la cabeza (fig. 1L y 1M). Un aparato de retención puede hacerse a partir de componentes optomecánicos comercialmente disponible de Qioptiq o Thorlabs. Nuestra placa separada puede ser transportada entre las suites de imágenes quirúrgicas y dos fotones con el animal y todos los dispositivos de monitorización fisiológica ensamblados como una unidad 3. </li><li> Si la imagen del flujo sanguíneo se desea, se inyectan 0,05 ml de 5% (w / v) fluorescente-dextrano colorante disuelto en solución salina estéril a través de la vena de la cola o la vena infraorbitario para etiquetar el suero sanguíneo (Fig. 2A y 2C a 2H </strong&gt;) 4-7. Esto debe hacerse bajo anestesia general. La administración de la vena infraorbitario puede ser más fácil para los principiantes, como soluciones de dextrano es más viscoso. La vena de la cola puede ser difíciles de localizar en los ratones de colores oscuros, y la vena tiende a colapsarse después de una inyección fallado. Para imágenes de vasos con el verde de las emisiones, utilizar un dextrano isotiocianato de fluoresceína. Por emisión roja, utilizar un dextrano Rojo Texas. Con altas dextranos de peso molecular, el colorante se mantendrá en circulación durante varias horas. Alternativamente, los animales con endógenos marcadores fluorescentes pueden tomarse imágenes directamente a la longitud de onda de excitación apropiada de dos fotones. La solución de dextrano se puede congelar en alícuotas para uso futuro. </li><li> Limpie suavemente la superficie de la ventana con un algodón húmedo aplicador con punta. </li><li> Para imágenes prolongado de preparaciones anestesiados, inyectar por vía intraperitoneal de Ringer estéril lactato solución a un volumen de 3 l por gramo cada 2 horas para mantener los fluidos corporales y los requisitos de energía. &lt;/ Li&gt; <li> Cuando los animales de imagen en el estado de vigilia, limitar el reposacabezas a sólo unas pocas horas a la vez para reducir los niveles de estrés. Volver al animal a la jaula de alojamiento entre las sesiones de formación de imágenes para la alimentación y el agua. </li></ol> 6. Los resultados representativos Una ventana éxito permitirá profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie pial durante varios meses. Este método ha sido utilizado para estudiar en el flujo de sangre capilar in vivo 4, 8, activación microglial 8, 9, y la estructura dendrítica en el parénquima cortical 8. En un ejemplo, podemos utilizar dos fotones de imágenes para mostrar el resultado de la vasculatura cortical de un anestesiado Thy1-amarillo proteína fluorescente (YFP) ratón, después de que el suero sanguíneo se etiqueta por inyección intravenosa de Rojo Texas dextrano (Fig. 2A). Vasos durales son a menudo visibles ligeramente por encima de la superficie cortical en la duramadre (Fig. 2C, flecha). Las grandes las arteriolas piales y li vénulase en la superficie cortical (Fig. 2D). Vasos rama penetrante de esta red de superficie y sumergirse en la corteza donde se ramifican en una cama densa capilar que nutre el tejido cortical (Fig. 2E a 2H). Cenadores dendríticas de YFP profunda expresión de las neuronas corticales, una señal endógena a esta línea de ratón, se pueden visualizar al mismo tiempo en un segundo canal 10 (Fig. 2B 2H). La señal de segundo armónico del hueso se recogió en un tercer canal, y puede ser utilizado para medir el espesor del cráneo adelgazado después de la recogida de pilas de imágenes (fig. 2A a 2C). Corticales dinámica vascular se ven profundamente afectados por los anestésicos 11. En un segundo ejemplo, se muestra un video de vasoactividad espontánea recogidos por microscopia de dos fotones de un ratón despierto habituado. Oscilaciones prominentes vasomotores en el diámetro de la luz se ven con una arteriola pial, pero no con una vénula vecino. Esterango basal de vasoactividad se ve disminuida con 4 uretano anestesia. Para cuantificar los cambios espontáneos y evocados en el flujo sanguíneo, utilizamos técnicas adaptadas de la línea de exploración para captar tanto el diámetro vascular y la velocidad de los glóbulos rojos de las embarcaciones individuales. Los recursos detallados sobre técnicas cuantitativas de imagen del flujo sanguíneo utilizando la microscopia de dos fotones están disponibles 3, 12. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> Figura 1. Procedimiento para una ventana Puertos. (K a) Las imágenes de los pasos secuenciales en el procedimiento para la generación de una ventana de Puertos. Véase el texto para obtener instrucciones detalladas. β = bregma y lambda = λ. (L) y la tuerca del perno del sistema para asegurar la cabeza durante la exploración de los preparativos anestesiados. (M)-formada montaje cruz la cabeza de barras para los preparativos despiertos. En este ejemplo, un conector se implantó también para las grabaciones electrocorticogram repetidas. (N)Diagrama esquemático que muestra la vista dorsal de la cabeza y la posición de montaje de varios componentes. La tuerca de L utilizado en el panel que se entiende como una alternativa a la barra transversal con dos en el panel de M. # 000 tornillos autorroscantes se añaden con el soporte de la barra transversal para una mayor estabilidad en los preparativos de imagen despiertos. (S) Diagrama esquemático que muestra la sección transversal de una ventana PUERTOS. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> Figura 2. Imágenes de dos fotones de la estructura vascular y neuronal en la corteza del ratón. Todas las imágenes se recogieron a través de una ventana de puertos en un ratón Thy1-YFP menos 2 días después de la implantación de los 10. Proyección máxima de más de 150 micras de tejido en la orientación coronal que muestra el cráneo adelgazada en relación con la vasculatura (A) y dendritas (B). El hueso (azul) se detectó mediante la recopilación de la fluorescencia del segundo armónico en la emisión de 450 nm a 900 nm de excitación <sup&gt; 8. La vasculatura (rojo) se marcó por vía intravenosa inyecta 70 kDa Rojo Texas dextrano 6. Los campos dendríticas de las neuronas (verde) son endógenos a la línea de ratón transgénico Thy1-YFP. (CH) proyecciones máximas de más de 50 micras de tejido en la orientación horizontal a diferentes profundidades por debajo de la PIA. Los datos son de la pila de la misma imagen se muestra en los paneles A y B. vasos durales puede ser visible justo por encima de la superficie cortical (flecha en C). Abreviaturas ACSF = artificial líquido cefalorraquídeo PUERTOS = pulido y reforzado con el cráneo adelgazado ventana YFP = proteína fluorescente de color amarillo i Asegúrese de que los procedimientos descritos son aprobados por el local de Atención de Animales institucional y el empleo Comisión.

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No hay nada que revelar.

De dos fotones de imágenes a través de una ventana de los puertos exige la transmisión a través del hueso adelgazado y la duramadre, que atenúa la luz del láser, y añade las aberraciones ópticas a mayores profundidades 8. Sin embargo, a pesar de este inconveniente, las profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie pial se puede lograr con 900 nm de excitación. Mayores profundidades de imagen puede ser en principio posible con longitudes de onda de excitación más largos <su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agente </td><td> Ruta de la entrega </td><td> Dosis para el ratón </td><td> Duración </td><td> Notas </td><td> Fuente </td><td> Ref. Ref. </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 ug / g </td><td> 15-60 min </td><td> Estrecho margen de seguridad. Trabajar hasta una dosis adecuada de anestesia lentamente. Suplemento 10% de la dosis de inducción según sea necesario. </td><td> 036093; mayordomo Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> La ketamina (Ketaset) mezclado con xilazina (Anased) </td><td> IP </td><td> 60 mg / g (K) 10 mg / g (X) (mezcla en la misma jeringa) </td><td> 20-30 min </td><td> Xilazina es co-inyectado como un relajante muscular y analgésico. Suplemento sólo ketamina a 50% de la dosis de inducción según sea necesario. </td><td> (K) 010 177, (X) 033 198; Butler, Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> El isoflurano (Isothesia) </td><td> Inhalación </td><td> 4% de media de la concentración alveolar (MAC) para la inducción; 1.2% MAC para el mantenimiento </td><td> 4-6 h. </td><td> Siempre en mezcla de 70% de oxígeno y 30% de óxido nitroso. La anestesia prolongada conduce a la lenta recuperación. </td><td> 029403; mayordomo Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Sugerido agentes anestésicos para los estudios de supervivencia. <table border="1"><tbody><tr><td> TEMA </td><td> EMPRESA </td><td><strong&gt; Catálogo # / MODELO </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Butler, Schein </td><td> 6906950 </td></tr><tr><td> La buprenorfina (Buprenex) </td><td> Butler, Schein </td><td> 031919 </td></tr><tr><td> Isotiocianato de fluoresceína dextrano, 2 de peso molecular MDa </td><td> Sigma </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> El alcohol isopropílico </td><td> Pescador </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Solución de Ringer Lactato </td><td> Butler, Schein </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> La lidocaína solución, 2% (v / v) </td><td> Butler, Schein </td><td> 002468 </td></tr><tr><td> Salina </td><td> Butler, Schein </td><td> 009861 </td></tr><tr><td> Leche quirúrgica </td><td> Butler, Schein </td><td&gt; 014325 </td></tr><tr><td> Rojo Texas dextrano, 70 kDa de peso molecular </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> Butler, Schein </td><td> 035646 </td></tr><tr><td> DESECHABLES </td></tr><tr><td> Carburo de rebabas, tamaño de la punta 2.1 mm </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Aplicadores cottoned punta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> Cubierta de vidrio, no. 0 espesor </td><td> Thomas Scientific </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Pegamento de cianoacrilato </td><td> ND Industrias </td><td> 31428 H04308 </td></tr><tr><td> Gas plumero </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> Grip polvo de cemento </td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td> Grip cemento solvente </td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td> Jeringa de insulina, 0,3 ml de volumen, con aguja de calibre 29,5 </td><td> Butler, Schein </td><td> 018384 </td></tr><tr><td> Tuerca y tornillo para asegurar la cabeza </td><td> Digikey </td><td> Nut, H723-ND, perno, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Pomada oftálmica </td><td> Butler, Schein </td><td> 039886 </td></tr><tr><td> Las hojas de bisturí </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> Tornillos, autorroscante # 000 </td><td> JI Morris Empresa </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> De silicona de acuario sellador </td><td> Perfecto Manufactura </td><td> 31001 </td></tr><tr><td> Polvo de óxido de estaño </td><td> Minerales de mamá </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> EQUIPO </td></tr><tr><td> Vidrio escribano </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Carl Zeiss </td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td> Taladro eléctrico alimentado </td><td> Foredom o Osada </td><td> K.1020 (Foredom) o EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> Maquinilla de afeitar eléctrica </td><td> Wahl </td><td> Serie 8900 </td></tr><tr><td> Pinzas, Dumont no. 55 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Comentarios almohadilla de calor regulado </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (termistor rectal, 40-90-5D-02; hcomer almohadilla, 40-90-2-07) </td></tr><tr><td> Vaporizador de isoflurano </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> Oxímetro de pulso </td><td> Starr Ciencias de la Vida </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> Destornillador en miniatura </td><td> Garret Wade </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Marco estereotáxico </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modelo 900 (con la máscara del ratón anestesia y no ruptura de las barras de las orejas) </td></tr><tr><td> Tijeras quirúrgicas, extremo romo </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> Limpiador ultrasónico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Lista de los reactivos específicos, desechables y equipo.

a polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain

En vivo de imágenes de la función cortical requiere acceso óptico hasta el cerebro, sin alteración del medio ambiente intracraneal. Se presenta un método para formar un cráneo pulido y reforzado con adelgazado (puertos) ventana en el cráneo del ratón que se extiende por varios milímetros de diámetro y se mantiene estable desde hace meses. El cráneo está adelgazada para 10 a 15 micras de espesor con un taladro de mano para lograr la claridad óptica, y después se cubrió con pegamento de cianoacrilato y una cubierta de vidrio para: 1) proporcionar rigidez, 2) inhibir la regeneración ósea y 3) reducir la dispersión de luz a partir de las irregularidades sobre la superficie del hueso. Dado que el cráneo no se rompe, la inflamación que puede afectar al proceso objeto de estudio se reduce considerablemente. Profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie cortical se puede lograr utilizando dos fotones de microscopía de barrido láser. Esta ventana se adapta bien para estudiar el flujo sanguíneo cerebral y la función celular en forma de preparados tanto anestesiados y despierto. Además, ofrece la optunidad para manipular la actividad de células utilizando optogenética o para interrumpir el flujo de sangre en los vasos dirigidos por irradiación de circulante fotosensibilizadores.

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A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.7K vistas.  University of California, San Diego. Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Investigación

Neurociencias

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formación extinción durante la ventana de reconsolidación impide una recuperación del Miedo

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; En Vivo</em&gt; Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...