Este protocolo demuestra cómo la microscopía In Vivo Two-Photon se puede utilizar para realizar visualizaciones repetitivas de la dinámica celular, en la misma ubicación cerebral durante períodos de tiempo prolongados. La ventaja de esta técnica es que, hace posible la imagen de los cambios a largo plazo en los elementos celulares del cerebro, incluyendo la disposición, morfología, y las interacciones físicas entre diferentes tipos de células del SNC. Esta técnica puede ser especialmente útil para provocar interacciones células celulares, dinámica celular y cambios morfológicos durante la plasticidad cerebral y la neurodegeneración.
Comience preparando a un adulto juvenil o joven, de cuatro a 10 semanas de edad, un ratón de heterocigoto CX3CR1 GFP, que pesa de 17 a 25 gramos, para una implantación de ventanas craneales. Después de anestesiar el ratón, utilice una recortadora de pelo para afeitarse el cabello en su cabeza, entre las orejas, aproximadamente, desde el nivel de los ojos, hasta la parte superior de la región del cuello. Mueva el ratón a la estación de cirugía estereotáctica, cono nasal y estabilice su cabeza usando barras para los oídos.
Mantenga el ratón en la almohadilla de calentamiento, durante todo el procedimiento. Lubricar ambos ojos con ung mento de aceite, luego inyectar 100 microlitros de 0.25%bupivacaína, y 100 microlitros de cuatro miligramos por mililitros de dexametasona, por vía subcutánea en el sitio de la incisión. Espere al menos cinco minutos antes de continuar.
Sangra la cabeza rapada, con tres hisopos alternos de betadina y 70% de alcohol. Luego haz una incisión del cuero cabelludo de línea media con una cuchilla quirúrgica o unas tijeras. Se extiende desde la parte posterior de la región del cráneo, entre las orejas, hasta el área frontal entre los ojos.
Corte la piel restante para exponer el cráneo. Sangra el tejido conectivo situado entre el cuero cabelludo y el cráneo subyacente con peróxido de hidrógeno al 3%, y localiza el área cerebral para ser imagen con coordenadas estereotácticas. Taladre una abertura circular, aproximadamente cuatro milímetros en el cráneo, usando una broca dental.
Durante la perforación, regularmente humedeció el cráneo con solución salina estéril y hisopos de algodón para enfriar el cerebro. Limpie los restos óseos y ablanda el hueso del cráneo. Cuando haya terminado, retire cuidadosamente esta porción del cráneo con fórceps puntiagudos.
Después de retirar el cráneo, coloque cuidadosamente un pequeño vaso de cubierta, humedecido con solución salina en la craneotomía. Seque el exceso de solución salina con una toallita estéril. Usando un aplicador puntiagudo, aplique pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana, y permita que se adhieran al cerebro y al cráneo.
Aplicar el pegamento de imprimación al resto del cráneo, y curarlo con una luz de curado durante 20 a 40 segundos. Crea un pozo alrededor de la ventana con el pegamento final, y cúguelo con una luz de curado durante 20 a 40 segundos. Pega una pequeña placa de cabeza en el cráneo, en el hemisferio contralateral, la craneotomía, con el pegamento de imprimación, y luego con el pegamento final, curando ambos durante 20 a 40 segundos.
Después de que el ratón se despierte, inyecte una dosis subcutánea de buprenorfina SR como analgesia postoperatoria, que será suficiente durante 72 horas. Revive el ratón con alimentos de sal extra para facilitar una recuperación saludable. Las imágenes se pueden realizar tan pronto como dos semanas después de la cirugía de implantación.
Utilice tornillos para montar la placa de cabeza en la etapa del microscopio de dos fotones, que debe mantenerse a 35 grados centígrados con una placa de calentamiento. Inyectar el ratón por vía subcutánea con 100 microlitros de tinte para los vasos sanguíneos, como Rhodamine B.Limpie suavemente la superficie de la ventana craneal con un hisopo de algodón, enloquecido en 70%etanol. Ponga unas gotas de agua o solución salina en la ventana y baje la lente objetivo en la solución.
Asegúrese de que el láser está apagado a medida que el objetivo está bajando, y dibuje un mapa del curso para denotar los principales puntos de referencia de los vasos sanguíneos, mientras mira a través del ocular. Utilice este dibujo para identificar las regiones específicas durante las imágenes de dos fotones. Recopile imágenes de células fluorescentes y vasos utilizando imágenes de dos fotones.
Consulte el manuscrito de texto para los parámetros de imagen, tome notas cuidadosas con las coordenadas adecuadas para asegurarse de que las regiones precisas se pueden revisar para obtener una imagen posterior. Dibuja como varios campos de visión en esta sesión inicial de imágenes, Al final de la toma de imágenes, saca el ratón del escenario, permite que se despierte de la anestesia y devuélvalo a su jaula de inicio. Utilice las notas e imágenes obtenidas para volver a tomar imágenes de las áreas durante las sesiones posteriores.
Este protocolo se utilizó para visualizar Microglial Dynamics In Vivo, en ratones de línea YFP-H de Taiwán. Dendritas específicas, sirvieron como puntos de referencia estables para el mapeo fino de las regiones cerebrales. Mientras que las dendritas son un establo, algunas microglia se mueven diariamente.
Los ratones TRANS3CR1/GFP transgénicos individuales, se utilizaron para seguir la microglia durante un máximo de ocho semanas. Las inyecciones de rhodamine B, se utilizaron para etiquetar la vasculatura, durante cada sesión de diagnóstico por imágenes. Mientras que la vasculatura permanece fija estable, la microglia es dinámica.
Los ratones CX3CR1/GFP, se utilizaron para seguir la microglia antes y después de las convulsiones graves. Se mantuvo la estructura del lecho vascular, pero la red celular microglial y el paisaje de la posición eran transitorios. Se observaron mayores cambios en las 24 a 48 horas posteriores a las convulsiones.
Se utilizaron ratones dobles transgénicos CX3CR1/GFP y NG2DS-Red, para rastrear microglia, y NG2 a células positivas en Vivo. Sin etiquetar la vasculatura, se identificaron microglia, así como parásitos asociados a los vasos, y células precursoras de oligodendrocitos, o OPC. Los parásitos tienen procesos alargados que siguen a lo largo de la pared vascular, y los OPC suelen mostrar cuerpos celulares más grandes que residen en el parénquima cerebral, lejos de la vasculatura.
Cuando se utilizó rhodamine B, la fluorescencia más brillante de los parásitos se podía distinguir de la fluorescencia más débil de la rodamina luminal, a pesar de la excitación similar durante la toma de imágenes. Las imágenes diarias mostraban que los parásitos estaban posicionados de forma estable, mientras que los OPC y la microglia eran dinámicos. Es importante hacer una observación cuidadosa del área que se está visualizando, dibujar un mapa representativo que sea lo más preciso posible, y denotar los pasos dados para llegar a los otros lugares con respecto al punto de partida.
En las sesiones de imágenes posteriores, estos pasos, los mapas dibujados a mano y las imágenes tomadas anteriormente, serán críticos para identificar las mismas ubicaciones repetidamente. Esta técnica ha permitido a los investigadores dilucidar interacciones neuro-glial, interacciones neuro-inmunes, y dinámica neurocélula de largos períodos de tiempo tanto en la salud como en la patología.
