Este trabajo fue apoyado por el Premio Carrera Burroughs Wellcome en las Ciencias Biomédicas (AKM), la Fundación de Becas de Investigación Whitehall (AKM), Beca de la Fundación Sloan (AKM), NIH EY019277 (AKM), y una financiación NEI, Visión Entrenamiento Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Para visualizar las neuronas en el cerebro intacto utilizando microscopía de dos fotones, una preparación donde las neuronas son etiquetados con marcadores fluorescentes se utiliza. En los experimentos que aquí se presenta se utiliza la línea de las buenas prácticas agrarias-M de ratones transgénicos que las etiquetas de la capa de células piramidales 5 1. Capa 5 células piramidales proyecto prolongaciones dendríticas en las capas superficiales, lo que permite la visualización de las dendritas y espinas dendríticas hasta una profundidad de 300 m por debajo del nivel de la PIA. Un enfoque alternativo es a las células de la etiqueta utilizando los marcadores virales (véase Lowery et al., Presentado a JOVE). </li><li> Esterilizar el área de trabajo con 70% de etanol y las herramientas de autoclave para la cirugía aséptica. Cubrir la superficie de operación con vendaje limpio. </li><li> Anestesiar a los ratones con un cóctel de fentanilo (fentanilo 0,05 mg / kg, midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg), seguido de una dosis de la cuarta parte de Avertin (0,0075 mg / ml), utilizando IACUC los procedimientos aprobados. Tratamiento previo a los ratones con el analgésico, la buprenorfina (0,5 mg / kg) administrada por vía subcutánea (SQ). Controlar el nivel de plano anestésico por la reacción de pruebas para pellizcar la cola / dedo del pie. </li><li> Mantener los animales a 37,5 ° C con una manta de calentamiento con un termómetro rectal adjunto. </li><li> Aplique un ungüento oftálmico para los ojos para evitar que los ojos se sequen. Ojos Hood con hoja de papel para proteger los ojos de la fuente de luz durante la cirugía. </li><li> Con la tijera, quitar el pelo de la parte posterior de la cabeza (detrás de las orejas) en los ojos. </li><li> Limpie la parte superior de la cabeza del animal con la aplicación secuencial de etanol al 70%, seguido de lavado y la solución de betadine betadine. </li><li> Hacer una incisión en L-por detrás de las orejas y hasta por el lado derecho o izquierdo de la línea media (dependiendo de en qué hemisferio se creará una imagen) a los ojos. Pliegue de la piel sobre y fuera del lugar de la cirugía. No quite la piel, la piel se sutura después de la sesión de imágenes. </li><li> Con unas pinzas finas tire suavemente de la piel hacia arriba y lejos de su área de interés. </li><li> Raspar suavemente el periostio de la zona expuesta de cráneo con unas pinzas o una hoja limpia de microcirugía. Utilizando un hisopo de algodón, aplique una pequeña cantidad del 10% de cloruro férrico en el cráneo que se seque completamente la membrana periostio y asegurarse de que se ha eliminado por completo. Es importante que el cráneo está completamente seco para asegurar la adhesión adecuada de la cola (ver 11). El uso de fórceps o una hoja de microcirugía, raspar suavemente lejos de membrana seca periostio. </li><li> Aplique una capa fina de pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana de imagen de la placa de acero inoxidable de la cabeza (ver Figura 1) y fijar la placa en el cráneo. </li><li> Con el extremo de un palo de madera, algodón, esponja, aplique el pegamento en las costuras en el interior de la ventana de imagen, asegurándose de llenar todos los huecos entre la placa de imagen y la curvatura del cráneo. </li><li> Coloque una gota de pegamento en el acelerador de la ventana. Rápidamente borrar acelerador de exceso de pegamento con un hisopo de algodón o kim limpiar. El pegamento debe ser completamente solidificado antes de perforar. </li><li> Comiencen a perder masa del cráneo en la ventana de imagen usando un taladro dental identificado con una de 0,7 mm de acero inoxidable fresa. Perforación se alternan con la aplicación ocasional de 0,9% solución salina estéril para evitar que se genere un exceso de calor en el cráneo. </li><li> Delgada ventana de 4x4 mm en el cráneo con movimientos pequeños en toda la superficie del cráneo con un taladro dental. Prueba de la delgadez de la cabeza con unas pinzas de extremos romos. La superficie del cráneo guión un poco con una suave presión. El grosor del cráneo óptimo para la imagen es de entre 10 y 30 micras. </li><li> Cuando el cráneo es fina y limpia la ventana de todos los desechos, el lugar de solución salina en el cráneo. Fotografía de la ventana de imagen con una cámara digital montada en un microscopio de disección. La fotografía y el uso de la vasculatura del cerebro que ayuda a localizar la posición de colocar la placa de imagen para las sesiones de formación de imágenes posteriores. </li><li> Transporte de los animales a la plataforma de 2 fotones. El animal debe permanecer en la manta térmica (con sonda rectal) durante la sesión de las imágenes. Nota: mientras que en la sedación, la temperatura del animal corporal fluctúa mucho en la ausencia de una unidad de calentamiento que resulta en daño cortical o incluso la muerte. </li><li> Un microscopio de dos fotones con un láser Mai Tai, una bomba de 10 W en estado sólido de potencia máxima y una modificación de Olympus unidad Fluoview confocal se utiliza. El sistema está optimizado para obtener imágenes de tejidos profundos y detectores externos se instalan tan cerca del objetivo como sea posible para permitir la detección de la fluorescencia máxima desde el cerebro. Una Olympus LUMPlan fl / IR lente objetivo 20X/0.95NA se utiliza. 0,9% se utiliza durante la exploración para el objetivo de inmersión. </li><li> El uso de este microscopio, y un zoom digital de bajo (x1) identificar un área que contiene las neuronas brillantes etiquetados. </li><li> Utilizando una cámara digital colocada en el microscopio ocular, tomar una fotografía de la superficie de imágenes. Por otra parte, esbozar el patrón de vasos sanguíneos. Esto es necesario para volver aa su vez a la ubicación de imágenes en un mismo punto de tiempo posterior. </li><li> Obtener una pila de bajo aumento (objetivo x20, 512x512 píxeles, 5 m paso) a través de toda la extensión visible del cerebro (generalmente durante ~ 200 micras) que muestra el grado de ramificación dendrítica. Nota: esta imagen bajo aumento se utiliza para localizar el área de la imagen en puntos de tiempo posteriores que tanto los vasos sanguíneos y las dendritas mantener su estructura en los animales jóvenes y adultos. </li><li> Usando software de imagen (Fluoview, v. 5.0, FV300), aumentar la ampliación digital de 8 veces. Ajustar la coordenadas X, Y (pan coordenadas) y si es necesario recoger un montón de gran aumento que muestra la morfología detallada dendríticas incluyendo la ubicación y la estructura de las espinas dendríticas. Tome notas detalladas sobre cada colección de pila, es decir, pan coordenadas, la gama de la colección, el tamaño de z a paso y el número de pasos en la pila. Estas notas se utilizarán al regresar a esta dendrita o axón a un tiempo posterior. </li><li> Siguiente imagen, retire la placa de la cabeza con cuidado separar la placa de la superficie del cráneo. Con unas pinzas, quite cualquier adhesivo residual que queda en el cráneo y limpiar la superficie del cráneo con el 0,9% de solución salina estéril. Suturar la piel sobre el cráneo, usando # 6 hilo de sutura. Limpie el área con el 70% de etanol. Para aliviar el dolor durante la recuperación post-operatoria, la administración de 0,1 mg / kg analgésico buprenorfina, SQ. </li><li> Lugar de los animales en la jaula de limpiar debajo de una lámpara de calor hasta que se despierta y es móvil. Volver a la jaula de los animales originales. </li><li> Para crear la imagen de los animales en un momento posterior (los puntos de una imagen en tiempo puede variar de 2 días a varios meses de diferencia), sacar los puntos o volver a abrir la piel de la cabeza utilizando métodos asépticos que el anterior. El uso de la imagen digital del cerebro vascular (tomadas en la fecha la primera cirugía) para localizar la ubicación de imagen original. Reaffix de acero inoxidable headplate (pasos 10-12). Utilice una hoja de microcirugía para adelgazar suavemente lejos cualquier hueso que podría haber crecido de nuevo entre los puntos de una imagen en tiempo. Si es necesario, delgado, con taladro dental. Ventana de imágenes libres de escombros y aplicar una gota de solución salina 0,9% estéril. </li><li> Llevar animales a la de dos fotones microscopio y localizar campo de la imagen original. Usa la fotografía digital tomada durante la sesión de imágenes de primera ayuda. </li><li> Abra el programa Fluoview y abrir la imagen original bajo aumento. Coloque una hoja de transparencia a la pantalla de la computadora y dibujar el patrón de los vasos sanguíneos principales utilizando una pluma de transparencia. </li><li> Abra la imagen en vivo y realinear los vasos sanguíneos con el modelo esbozado en la película de transparencia. </li><li> Para crear la imagen del zoom de 8x en las estructuras, abrir la pila deseada recogidos de la sesión de imágenes anteriores. Dibuje la estructura (es decir, axonal, dendríticas, gliales) en una película de transparencia, colocada en la pantalla del ordenador. </li><li> Zoom 8x de la imagen en vivo y ajustar el panorama coordenadas para los parámetros de imagen del primer día. Dependiendo de la exactitud de la alineación de la ubicación de bajo aumento, puede ser necesario ajustar también el ángulo de la imagen un poco. Una vez que la estructura deseada se encuentra, coinciden con la estructura de su patrón esbozado una gran ampliación. Recoger el z-stack con el tamaño del paso idénticos y el número de z-stack imágenes para su posterior análisis. </li><li> Repita los pasos 29 y 30 hasta que todas las imágenes de gran aumento se recojan. </li><li> Cuando la imagen está completa, repita los pasos 22-24. Nueva imagen se puede repetir en un máximo de 2 puntos de tiempo separados. </li><li> Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Vivarium y la División de Medicina de Animales de Laboratorio de la Universidad de Rochester, Facultad de Medicina y Odontología, en plena acreditación por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio, Internacional (AAALAC) y están en conformidad con la ley estatal, la legislación federal y la política de NIH. </li></ol> Resultados representante En las buenas prácticas agrarias-M ratones que expresan, un subconjunto de la capa de células piramidales y 5 correspondientes procesos dendríticas pueden ser fácilmente visualizados usando 2-fotón microscopía de escaneo láser (2PLSM) 1. Aquí hemos demostrado una preparación diluida, en el cráneo que se adelgaza el cráneo sobre la ubicación de imagen deseada a ~ 10-30 micras. Se realiza correctamente, el protocolo nos permite visualizar claramente las dendritas corticales y las espinas en la corteza visual intacto para el análisis agudo o crónico (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cabeza de la costumbre y la placa base. (A) Vista superior de la cabeza por encargo y la placa base que se utiliza para la preparación de la cirugía cráneo-diluido. (B) Vista lateral de la cabeza a medida y la placa base. (C, D) esquemática detallada y la imagen de la placa de la cabeza. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Figura 2" /> <strong&gt; Figura 2. Los resultados representativos de 2PLSM después de la preparación del cráneo delgados. (A) Las dendritas imágenes en vivo en la corteza visual de un transgénico GFP-M ratón usando la microscopía de dos fotones. La imagen es una proyección de imagen individuales obtenidos cada 5 m de la pia a una profundidad final de 175 micras. El área de caja en una representa a la región ampliada en (B) y (C) fotografiado en el día 0 (D0) y cuatro días más tarde (D4). (D, E) Mayor aumento de la rama dendríticas en caja de B y C que demuestran espinas estable (cabezas de flecha blanca), perdido / espinas retracción (cabezas de flecha roja) y nuevas espinas (cabezas de flecha verde). Las barras de escala = A. 200 micras, B, C. 20 m, D, E. 5 micras.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

Imágenes crónica utilizando microscopía de dos fotones se está convirtiendo en una técnica cada vez más popular para estudiar los cambios morfológicos se dispararon durante 2-5 plasticidad. Aquí se demuestra una preparación diluida-cráneo de seguir identificado las espinas dendríticas en el cerebro del ratón intacto en día imágenes diferentes. En este protocolo, el cráneo se deja intacta, causando el mínimo daño a la corteza y que resulta en niveles muy bajos de la neuroinflamación que puede...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

Imágenes in vivo utilizando dos fotones microscopía de barrido láser (2PLSM) permite el estudio de las células vivas y los procesos neuronales en el cerebro intacto. La técnica que aquí se presenta permite que la imagen de la misma área del cerebro en varios puntos del tiempo (crónica de imágenes) con resolución microscópica que permite el seguimiento de las espinas dendríticas, que son las pequeñas estructuras que representan la mayoría de los sitios postsinápticos excitatorios en el SNC. La capacidad de resolver bien claramente las estructuras corticales más de varios puntos del tiempo tiene muchas ventajas, especialmente en el estudio de la plasticidad del cerebro en la que los cambios morfológicos en las sinapsis y la remodelación del circuito puede ayudar a explicar los mecanismos subyacentes. En este material de vídeo y complementarias, se muestra un protocolo para la crónica en vivo de imágenes del cerebro intacto con una preparación diluida-cráneo. La preparación diluida-cráneo es un método mínimamente invasivo, lo que evita posibles daños a la duración y / o la corteza, lo que reduce la aparición de una respuesta inflamatoria. Cuando este protocolo se realiza correctamente, es posible seguir con claridad los cambios en las características de la espina dendrítica en el cerebro intacto durante un período prolongado de tiempo.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la crónica<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes del cerebro intacto con una preparación diluida-cráneo.

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K vistas.  University of Rochester. En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la crónica In vivo Imágenes del cerebro intacto con una preparación diluida-cráneo.

Video: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Investigación

Neurociencias

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imágenes de detección de feromonas en una preparación de ratón Vomeronasal aguda lámina de tejido

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; En Vivo</em&gt; Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imágenes funcionales de la corteza auditiva en los gatos adultos el uso de alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

La medición de conectividad en la vía visual primaria en albinismo humano recurriendo a imágenes de tensor de difusión y Tractografía

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...