Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (Postdoc-Stipendium an AYS) und der National Institutes of Health (MH085499, EB003832 und OD006831 zu DK) unterstützt. Wir bedanken uns bei Beth Friedman und Pablo Blinder für Anmerkungen zum Manuskript.

1. Vorbereitung für Chirurgie I <ol><li> Reinigen Sie die chirurgischen Instrumente im Ultraschallbad in einer Mischung aus Maxizyme und Chirurgische Milch in einem Ultraschallreiniger. Autoklavieren chirurgische Instrumente vor jedem Experiment. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Reagenzien und Verbrauchsmaterial zur Verfügung stehen. Eine Liste von Reagenzien und Verbrauchsmaterial ist in Tabelle 2 bereitgestellt. Reagenzien und Einwegartikel, die in Kontakt mit dem freiliegenden Gewebe zu kommen, sollte steril sein, wenn möglich. </li><li> Induzieren Anästhesie. Typische Anästhetika für das Überleben sind in Tabelle 1 beschrieben. Stellen Sie sicher, chirurgische Ebene der Anästhesie, indem Sie für fehlende Zehen Prise Reflex. Die optimale Alter von Maus beträgt 3 bis 6 Wochen alt sind. Die Schädel von jüngeren Mäuse sind weicher und schwieriger zu dünn. Ältere Mäuse haben dickere Schädel, die mehr während der Durchforstung Verfahren wird bluten. </li><li> Sichern Sie das Tier in einem stereotaktischen Rahmen ein. Eine Liste von chirurgischen Einrichtungen ist in Tabelle 2 bereitgestellt. </li><li> Pflegen Körpertemperaturtur bei 37 ° C unter Verwendung einer Rückkopplung geregelt rektale Sonde und Wärmekissen. </li><li> Bewerben Augensalbe in die Augen, Feuchtigkeit zu speichern. </li><li> Rasieren Sie die Kopfhaut mit einem kleinen elektrischen Rasierapparat. </li><li> Reinigen der Kopfhaut mit Betadin, durch einen Abstrich mit 70% (v / v) Isopropyl-Alkohol. </li><li> Wenn gewünscht, prüfen Sie, ob Herz-und Atemfrequenz in einem normalen Bereich mit einem Pulsoximeter sind. Für eine Maus, sollten diese Zahlen Zentrum um 10 und 2 Hz zur Verfügung. </li><li> Wärmen Sie einen aliquoten Teil sterilfiltriert künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) bis 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM MgCl 2, pH 7,4) (alle Chemikalien von Sigma) 2. </li></ol> 2. Montage eines Kopfrahmen <ol><li> Entfernen Sie die Kopfhaut über den gesamten Schädel dorsalen Oberfläche mit einer Pinzette und Scheren. Schneiden der Haut seitlich an den Kanten der zeitlichen Muskeln auf beiden Seiten des Schädels und Schreibenerior zu den Muskeln des Halses (1A). </li><li> Mit einem Skalpell-Klinge, um den dünnen Periost von der Oberfläche des Schädels zu entfernen. </li><li> Reinigen Sie den Schädel mit einem feuchten Wattestäbchen und trocknen Sie die Oberfläche mit einem Schädel Luftstrom aus einem Staub kann. Dann bewerben Sie sich eine dünne Schicht Sekundenkleber auf den gesamten Schädel Oberfläche. Lassen Sie den Kleber gut trocknen lassen. Diese Schicht von Klebstoff ist für eine ordnungsgemäße Haftung der Dentalzement in den nachfolgenden Schritten erforderlich. Die Sekundenkleber muss nicht sterilisiert werden. </li><li> Bringen Sie ein Metall-Stecker an der Kopfoberfläche, weg von der Fläche des gewünschten Fensters. Für narkotisierten Vorbereitungen, kann eine kleine Nuss auf den Schädel mit einem Klecks Sekundenkleber, der später in die Setup-Bildgebung mit einer Schraube (Abb. 1B, 1L und 1N) eingeschraubt werden kann gesichert werden. Verschließen Sie die Rückseite der Mutter mit Klebeband, um sicherzustellen, dass Kleber nicht in die Themen während der Befestigung an der Schädelbasis. Die Mutter und Band sollte sterilisiert werden<html> durch Autoklavieren vor der Operation. </li><li> Für wach Bildgebung Vorbereitungen, fügen Sie eine benutzerdefinierte steifer Verteiler mit zwei Befestigungspunkten (Abb. 1 M und 1 N). Bohren Sie zwei Löcher in den Schädel über der kontralateralen kortikalen Hemisphäre mit einem ½ mm Bohrer Grat, und dann führen zwei # 000 Blechschrauben. Diese Schrauben verankern hilft der Kopf auf den Schädel zu montieren. Tragen Sie nur eine volle Umdrehung der Schraube, um zu vermeiden, Druck auf die darunter liegenden Kortex. Dann fügen Sie die benutzerdefinierte Metall Querstange mit einem kleinen Klecks Sekundenkleber über dem Kleinhirn. Lassen Sie den Sekundenkleber gut trocknen lassen. Dieses Metall-Stecker reduziert die Freiheitsgrade und vereinfacht die Verlagerung von der gleichen Bildfeld in Längsschnittstudien. Eine breite Querstange gibt reichlich Raum für Platzierung der Elektroden und Stimulation der Tasthaare. Detaillierte Pläne für die Erzeugung der Sitte Galgens und Befestigungsvorrichtung sind online verfügbar (SICS / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Die Schrauben und Querstange sollte durch Autoklavieren vor der Operation sterilisiert werden. </li><li> Decken den gesamten Kopfoberfläche, ohne die Position des Fensters, mit einer Schicht von Zahnzement (1C und 1D). Sicherstellen, dass alle freiliegenden Kanten der Haut durch Zement abgedeckt werden. Die Komponenten der Dentalzement müssen nicht sterilisiert werden. </li></ol> 3. Die Erzeugung eines poliert und verstärkt ausgedünnten Schädel (Ports) Fenster <ol><li> Stellen Sie sicher, dass Bohrer scharf sind und Grate zu vermeiden wiederzuverwenden. Mit einer niedrigen Geschwindigkeit auf der Dentalbohrers, dünn ein 2 mm x 2 mm über der Region somatosensorischen Kortex mit einer ½ mm-Fräse. Wechseln Sie zwischen Benetzung der Schädel mit ACSF und anschließendes Trocknen des Schädels Oberfläche mit einem leichten Luftstrom aus einem Gas Staubtuch; nass für die Kühlung, für die Durchforstung und trocken. Dies erfordert eine Ausdünnung durch die spongiöse Schicht des Schädels, die bluten können, aber kann kontrollierened durch Spülen mit ACSF (Abb. 1E). Der Schädel beginnt, unter dem leichten Druck des Bohrers zu beugen, wenn es ~ 50 um beträgt, und der Pia-Gefäße sollten durch nasse Knochen (Abb. 1F) sichtbar. Bei dieser Dicke wird kleine weiße Punkte innerhalb des Knochens sichtbar für ein paar Sekunden unmittelbar nach dem trockenen Schädel Oberfläche befeuchtet ist. </li><li> An diesem Punkt dünnen der Knochen noch weiter. Verwenden Sie einen Bohrer langsamer Geschwindigkeit, also 1000 Umdrehungen pro Minute, die den Schädel rasiert Oberfläche nur mit einem leichten Anflug. Verwenden Sie kleine kontrollierte Bewegungen und halten den Bohrer wie ein Stift und nur mit Gewalt in seitlicher Richtung. Die Knochen werden sollte ~ 10 bis 15 um auf seine endgültige Dicke (Abb. 1G). Wenn die Knochen dünn genug ist, werden die kleinen weißen Flecken im Knochen nicht mehr sichtbar sein, wenn die trockenen Schädel Oberfläche angefeuchtet wird. </li><li> Polieren Sie die Fenster Region mit Zinn-Oxid-Pulver. Befestigen Sie eine vorgefertigte Bohrer, die in Silicon-Dichtstoff Aquarium und mit getauchtengezogen, so dass eine verjüngte Peitsche (kleines Bild, Abb. 1H). Die Silikon-Peitsche sollte mindestens einen Tag vor der Operation vorbereitet werden, und mit 70% Isopropanol vor dem Gebrauch. Geben Sie eine kleine Prise Pulver auf das Fenster zusammen mit einem Tropfen ACSF (Abb. 1H). Schwenken Sie den Brei auf das Fenster, für bis zu 10 Minuten durch leichtes Berühren der Spitze des sich bewegenden Peitsche auf der Kopfoberfläche. Wegspülen die Zinnoxidpulver gründlich aus dem Fenster mit ACSF und trocknen Sie die Knochen gründlich mit einem leichten Luftstrom. Unregelmäßigkeiten der Oberfläche und adhärenten Knochensplitter durch Bohrungen in den vorherigen Schritten nach links sollte nach dem Polieren (Abb. 1H und 1I) entfernt werden. Die Zinn-Oxid-Pulver muss nicht sterilisiert werden. </li><li> Schneiden Sie quadratische Stücke von No. 0 Deckglas geringfügig kleiner als die Größe des Fensters. Verwenden Sie einen Schreiber, um sanft punkten getrennt horizontalen und vertikalen Linien in das Deckglas mit einer geraden Kante. Dann das Deckglas in einer Petrischale und knock das Gericht gegen eine Tischkante, um die Glasstücke zu trennen. Die gesamte Petrischale kann anschließend autoklaviert, um die Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Platzieren Sie eine entsprechend große Deckglas in der Nähe der getrocknete Fenster. Tragen Sie eine kleine Klecks Sekundenkleber auf das Fenster mit der Spitze eines gebrochenen hölzernen Wattestäbchen, und schnell drücken Sie die vorgeschnittenen Stück Deckglas oben auf dem Leim. Vermeiden Sie Blasen unter dem Deckglas. Drücken Sie vorsichtig die Abdeckung Glas gegen den Schädel Oberfläche, und halten Sie für einige Sekunden (Abb. 1J und 1O). Lassen Sie den Kleber gut trocknen über 15 Minuten. Überschüssiges Sekundenkleber kann von der oberen Oberfläche des Deckglases mit einer Skalpell-Klinge entfernt werden, nachdem sie getrocknet wird. Seal die Ränder des Deckglases mit Zahnzement und bilden eine leicht Brunnen, um Wasser für die Tauch-Objektiv (Abb. 1K und 1O) halten angehoben. </li></ol> 4. Erholung <ol><li> Platzieren Sie das Tier in einem warmen Käfig nach einer Operation. Überwachen Sie dieTier in regelmäßigen Abständen, bis sie vollständig erholt aus der Narkose. </li><li> Wenn die Herstellung soll für mehr als einen Tag überleben, bereitzustellen Buprenorphin (0,03 g pro g Nagetier) zur Analgesie. Wir typischerweise Bild des Tieres mindestens einen Tag nach der anfänglichen Implantation. </li></ol> 5. Imaging Vorbereitung <ol><li> Stabilisieren des Tieres auf einer optischen Steckbrett Bildgebung unter Verwendung des Rahmens als Kopfstütze (Abb. 1L und 1M). Rückhaltesystem Vorrichtung können aus kommerziell erhältlichen mechanische Komponenten aus Qioptiq oder ThorLabs werden. Unser separater Platte kann zwischen chirurgischen und Zwei-Photonen-Imaging-Suiten mit dem Tier und aller physiologischen Überwachungsgeräten als eine Einheit 3 zusammengebaut transportiert werden. </li><li> Wenn Blutflußabbildung gewünscht wird, zu injizieren 0,05 ml von 5% (w / v) fluoreszierenden Farbstoff-Dextran in steriler Kochsalzlösung entweder durch die Schwanzvene oder infraorbitalis Vene gelöst, um das Blutserum (2A und 2C 2H kennzeichnen </strong&gt;) 4-7. Dies muss unter Vollnarkose durchgeführt werden. Infraorbitalis Vene Verwaltung möglicherweise einfacher für Anfänger, als Dextranlösungen zäher sind. Die Schwanzvene kann schwierig sein, mit dunklen Mäusen zu suchen, und die Vene dazu neigt, nach einer Injektion nicht verdecken. Für die Bildgebung Gefäßsystem mit grüner Emission, verwenden Sie ein Fluoresceinisothiocyanat Dextran. Für rote Emission, verwenden Sie ein Texas Red Dextran. Bei hohen Dextranen, wird der Farbstoff in Umlauf für mehrere Stunden bleiben. Alternativ können Tiere mit endogenen Fluoreszenzmarkierungen direkt an den entsprechenden Zwei-Photonen-Anregungs abgebildet werden. Das Dextran-Lösung in Aliquots für eine spätere Verwendung eingefroren werden. </li><li> Reinigen Sie das Fenster Oberfläche mit einem feuchten Wattestäbchen. </li><li> Für eine längere Bildgebung von narkotisierten Vorbereitungen, injizieren sterile Ringer-Laktat-Lösung intraperitoneal bei einem Volumen von 3 ul pro Gramm alle 2 Stunden, um Körperflüssigkeiten und Energiebedarf zu erhalten. &lt;/ Li&gt; <li> Bei der Abbildung Tieren im Wachzustand, begrenzen Kopfstütze auf nur wenige Stunden am Stück, um Stress zu reduzieren. Bringen Sie das Tier auf dem Weg nach Hause Käfig zwischen Imaging-Sitzungen für Nahrung und Wasser. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein erfolgreiches Fenster können bildgebende Tiefen bis zu 250 mu m unterhalb der Pia-Oberfläche für mehrere Monate. Diese Methode wurde verwendet, um in vivo Kapillarblutflusses 4, 8, Mikrogliaaktivierung 8, 9, und dendritischen Struktur innerhalb des Rindenparenchym 8 studierst. In einem Beispiel verwenden wir zwei-Photonen-Tomographie, um die kortikalen Gefäßsystem eines anästhesierten Thy1-gelb fluoreszierendes Protein (YFP) Maus zeigen, nachdem das Blutserum durch intravenöse Injektion von Texas Red Dextran (Abb. 2A) beschriftet ist. Dural Schiffe sind oft sichtbar etwas oberhalb der kortikalen Oberfläche in der Dura mater (Abb. 2C, Pfeil). Große pialen Arteriolen und Venolen lie auf der kortikalen Oberfläche (Abb. 2D). Penetrationsgefäß Zweig von dieser Oberfläche Netz und tauchen ein in die Hirnrinde, wo sie in ein dichtes Kapillarbett, die die kortikale Gewebe ernährt (Abb. 2E bis 2H) verzweigen. Dendritische Dorne tiefer YFP kortikalen Neuronen exprimiert, ein Signal endogenen dieser Mauslinie, können gleichzeitig in einem zweiten Kanal 10 (2B bis 2H) abgebildet werden. Die zweite harmonische Signal des Knochens wurde in einem dritten Kanal gesammelt und verwendet werden, um die Dicke des dünner Schädel nach der Entnahme des Bildes Stapel (2A bis 2C) abzuschätzen. Kortikale vaskuläre Dynamik sind zutiefst Anästhetika 11 betroffen. In einem zweiten Beispiel zeigen wir ein Video von spontanen Vasoaktivität durch Zwei-Photonen-Mikroskopie von einem habituierten wach Maus gesammelt. Klare vasomotorischen Schwingungen im Lumendurchmesser mit einem Pia-Arterie gesehen, aber nicht mit einem benachbarten Venole. Diesbasalen Bereich der Vasoaktivität ist mit Urethannarkose 4 vermindert. Um spontanen und evozierten Veränderungen im Blutfluss zu quantifizieren, verwenden wir angepasst Linie Scan-Techniken, um sowohl die Gefäßdurchmesser und roten Blutkörperchen Geschwindigkeit der einzelnen Fahrzeuge erfassen. Detaillierte Ressourcen auf quantitativen Blutfluss Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie sind 3, 12. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vorgehensweise bei einer Ports Fenster. (A bis K) Bilder von aufeinander folgenden Schritte in dem Verfahren zur Erzeugung eines Ports Fenster. Siehe Text für detaillierte Anweisungen. β = Bregma und λ = Lambda. (L) aus Schrauben und Muttern zur Befestigung des Kopfes während der Bildgebung von narkotisierten Vorbereitungen. (M) Custom bearbeitet Querstange Kopfhalterung für Zubereitungen wach. In diesem Beispiel wurde ein Verbinder auch zur wiederholten Aufzeichnungen Elektrokortikogramm implantiert. (N)Schematische Darstellung dorsale Ansicht des Galgens und Position der verschiedenen Komponenten. Die Mutter in L-Panel verwendet wird als Alternative zu der Querstange mit Panel in M. Zwei bedeutete # 000 selbstschneidende Schrauben sind mit der Traverse für stabilen Stand mit wach Bildgebung Vorbereitungen aufgenommen. (O) Schematische Darstellung Querschnitt eines Ports Fenster. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zwei-Photonen-Imaging von Gefäßen und neuronale Struktur im Kortex der Maus. Alle Bilder wurden durch einen Ports Fenster in einem Thy1-YFP Maus 2 Tage nach der Implantation Fenster 10 gesammelt. Maximale Projektion über 150 um von Gewebe in der koronalen Orientierung zeigt den verdünnten Schädel in Bezug auf das Gefäßsystem (A) und Dendriten (B). Der Knochen (blau) durch das Sammeln der zweiten Harmonischen Fluoreszenz bei 450 nm Emission mit 900 nm Anregung erkannt <sup&gt; 8. Das Gefäßsystem (rot) wurde von intravenös injizierten 70 kDa Texas Red Dextran 6 beschriftet. Die dendritischen Felder von Neuronen (grün) sind endogene dem Thy1-YFP transgene Mauslinie. (CH) Maximale Projektionen über 50 mu m von Gewebe in der horizontalen Ausrichtung in verschiedenen Tiefen unterhalb der Pia. Die Daten sind aus dem gleichen Bildstapel in Panels A und B gezeigt Dural Gefäße sichtbar sein knapp oberhalb der kortikalen Oberfläche (Pfeil in C). Abkürzungen ACSF = künstliche Rückenmarksflüssigkeit PORTS = poliert und verstärkte ausgedünnt Schädel Fenster YFP = gelb fluoreszierendes Protein i Stellen Sie sicher, dass die Verfahren beschrieben, die von Ihrem lokalen institutionellen Animal Care sind genehmigt und Verwenden Ausschuss.

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Nichts zu offenbaren.

Zwei-Photonen-Bildgebung durch eine Ports Fenster erfordert die Übertragung durch den ausgedünnten Knochen und Dura, welches das Laserlicht dämpft und fügt optischen Aberrationen in größeren Tiefen 8. Doch trotz dieses Nachteils kann bildgebenden Tiefen bis zu 250 mu m unterhalb der Pia-Oberfläche mit 900 nm Anregung erreicht werden. Größere Tiefen Bildgebung kann im Prinzip möglich sein, mit mehr Anregungswellenlängen 13. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist das Fehlen von kortik...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agent </td><td> Route der Lieferung </td><td> Dosis für die Maus </td><td> Dauer </td><td> Hinweise </td><td> Quelle </td><td> Ref </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 ug / g </td><td> 15-60 min </td><td> Schmale Sicherheitsmarge. Arbeiten Sie bis zu richtigen Dosis der Narkose langsam. Zuschlag 10% der Induktionsdosis wie erforderlich. </td><td> 036093; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Ketamin (Ketaset) mit Xylazin (Anased) gemischt </td><td> IP </td><td> 60 ug / g (K) 10 ug / g (X) (Mischung in derselben Spritze) </td><td> 20-30 min </td><td> Xylazin wird als Muskelrelaxans und Analgetikum co-injiziert. Zuschlag nur Ketamin bei 50% der Induktion Dosis erforderlich. </td><td> (K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Isofluran (Isothesia) </td><td> Inhalation </td><td> 4% bedeuten alveolare Konzentration (MAC) für die Induktion; 1-2% MAC für die Wartung </td><td> 06.04 Uhr. </td><td> Bildquelle in einer Mischung aus 70% Sauerstoff und 30% Distickstoffmonoxid. Längerer Betäubung führt zur Genesung verlangsamen. </td><td> 029403; Butler Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Empfohlene Anästhetika für das Überleben Studien. <table border="1"><tbody><tr><td> ITEM </td><td> UNTERNEHMEN </td><td><strong&gt; Catalog # / MODELL </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Butler Schein </td><td> 6906950 </td></tr><tr><td> Buprenorphin (Buprenex) </td><td> Butler Schein </td><td> 031919 </td></tr><tr><td> Fluoresceinisothiocyanat Dextran, 2 MDa Molekulargewicht </td><td> Sigma </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> Isopropylalkohol </td><td> Fischer </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Ringer-Laktat-Lösung </td><td> Butler Schein </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> Lidocain-Lösung, 2% (v / v) </td><td> Butler Schein </td><td> 002468 </td></tr><tr><td> Saline </td><td> Butler Schein </td><td> 009861 </td></tr><tr><td> Chirurgische Milk </td><td> Butler Schein </td><td&gt; 014325 </td></tr><tr><td> Texas Red Dextran, 70 kDa Molekulargewicht </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> Butler Schein </td><td> 035646 </td></tr><tr><td> EINWEGARTIKEL </td></tr><tr><td> Hartmetallfräser, 1/2 mm Düsengröße </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Cottoned Spitze Applikatoren </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> Deckglas, nein. 0 Dicke </td><td> Thomas Scientific </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> Sekundenkleber </td><td> ND Industries </td><td> 31428 H04308 </td></tr><tr><td> Gas-Staubtuch </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> Grip Zementpulver </td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td> Grip Zement Lösungsmittel </td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td> Insulinspritze, 0,3 ml Volumen mit 29,5 Gauge-Nadel </td><td> Butler Schein </td><td> 018384 </td></tr><tr><td> Mutter und Schraube, um den Kopf zu sichern </td><td> Digikey </td><td> Nuss-, H723-ND, Bolzen, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Ophthalmische Salbe </td><td> Butler Schein </td><td> 039886 </td></tr><tr><td> Skalpellklingen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> Schrauben, selbstschneidend # 000 </td><td> JI Morris Company </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> Silikon-Dichtstoff Aquarium </td><td> Perfecto Fertigung </td><td> 31001 </td></tr><tr><td> Zinnoxidpulver </td><td> Mamas Minerals </td><td> EQT-TiNOX </td></tr><tr><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Glas-Schreiber </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td> Elektrische Bohrmaschine </td><td> Foredom oder Osada </td><td> K.1020 (Foredom) oder EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> Elektrische Rasierer </td><td> Wahl </td><td> Serie 8900 </td></tr><tr><td> Pinzetten, Dumont-Nr. 55 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Ihre Meinung geregelten Heizkissen </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (rektal Thermistor, 40-90-5D-02; hessen-Pad, 40-90-2-07) </td></tr><tr><td> Isofluran Verdampfer </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> Pulsoximeter </td><td> Starr Life Sciences </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> Schraubendreher, Miniatur </td><td> Garret Wade </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Stereotaktischen Rahmen </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modell 900 (mit der Maus Narkosemaske und Nicht-Bruch Ohr Bars) </td></tr><tr><td> Chirurgische Schere, stumpfen Ende </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> Ultraschallreiniger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Liste der spezifischen Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräten.

a polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain

In-vivo-Bildgebung der kortikalen Funktion erfordert optische Zugang zum Gehirn ohne Störung des intrakraniellen Umwelt. Wir stellen eine Methode, um eine polierte und verstärkte ausgedünnt Schädel (Ports) Fenster in der Maus Schädel, die mehrere Millimeter im Durchmesser überspannt und ist über Monate stabil zu bilden. Der Schädel auf 10 bis 15 um in der Dicke mit einer Hand gehalten Bohrer optische Klarheit zu erreichen verdünnt und dann mit Sekundenkleber und ein Deckglas zu überlagern: 1) für Steifigkeit, 2) zu verhindern Knochenwachstum und 3) zu reduzieren Lichtstreuung von Unregelmäßigkeiten auf der Knochenoberfläche. Da der Schädel nicht verletzt ist, wird jede Entzündung, die den Prozess beeinflussen könnten, untersucht stark reduziert. Imaging Tiefen von bis zu 250 mu m unterhalb der kortikalen Oberfläche kann mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie werden. Dieses Fenster eignet sich gut zur Hirndurchblutung und zelluläre Funktion in beide betäubt und wach Vorbereitungen zu studieren. Es bietet darüber hinaus den OPPortunity zu manipulieren Zellaktivität mit Optogenetik oder um den Blutfluss in ausgewählten Behältern durch Bestrahlung der zirkulierenden Photosensibilisatoren stören.

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A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.8K Aufrufe.  University of California, San Diego. Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Serie: A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Extinction Training Während der Rückverfestigung Fenster Verhindert Recovery-of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...