Name: Video: Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster
Uploaded: 2013-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 34.0K vistas. University of Michigan. Drosophila melanogaster es un organismo modelo eficaz para explorar las bases moleculares de la regulación de la longevidad. Este protocolo se discutirán los pasos involucrados en la generación de un reproducible, basado en la población de medición de la longevidad, así como los posibles escollos y cómo evitarlos.

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Médica Ellison (SDP, <a href="http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp" target="_blank">http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp</a> ), NIH K01AG031917 (NJL, <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) y NIH R01AG030593 (SDP). En este trabajo se utilizan los recursos del núcleo Drosophila Envejecimiento (DAC) del Centro de Excelencia de choque Nathan en la biología del envejecimiento financiado por el Instituto Nacional del Envejecimiento P30-AG-013283 ( <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ). Los autores desean agradecer al Laboratorio Pletcher útil para los debates y, en particular Brian Chung para la lectura crítica del manuscrito. Nos gustaría reconocer Nick Asher y Borowicz Kathryn para asistencia para la recopilación de datos.

Se recomienda almacenar alimentos experimentales, la pasta de levadura, y placas de agar de uva que aparecen en el protocolo a 4 º C y su uso dentro de 1-2 meses, siempre y cuando el molde y la sequedad no han fijado pulg condiciones ambientales estándar, tanto para el larvas y adultos escenificar implican el mantenimiento de moscas en una incubadora a 25 ° C con un ciclo de luz de 12:12 h de obscuridad y 60% de humedad relativa. 1. Preparación de Alimentos Experimental <ol><li> Para el crecimiento larval, se utiliza una versión modificada Caltech Medio 5, que se abrevia en este protocolo como CT. </li><li> Se recomienda una dieta para adultos de Drosophila (SY) que se compone de azúcar (sacarosa) y levadura (levadura de cerveza liofilizado entera) en una base de agar 2%, que se ha hervido, suplementado con antibióticos y agentes anti-hongos, y distribuido (10 ml por vial) 6. Los alimentos deben ser deja solidificar y se evapora para 12-24 horas antes del almacenamiento. Debido a que el entorno de nutrientes puede Sustanciacialmente longevidad impacto, la coherencia en los procesos de cocción es esencial, tanto dentro de un experimento y para la comparación entre los experimentos. </li><li> Si un agente farmacológico que se añaden a los alimentos para adultos, este fármaco puede ser mezclado en una pequeña cantidad de comida y en capas (2 ml) sobre la superficie de los alimentos, con los viales de control que recibían las capas que contienen vehículo solo. </li></ol> 2. Preparación de una pasta de levadura vivas Combinar 5-6 ml de agua con 3 g de levadura seca activa y mezclar bien. La consistencia de la pasta de levadura debe ser la de una mantequilla de cacahuete lisa. 3. Preparación de una placa de agar de uva <ol><li> Añadir un paquete de una premezcla de uva agar en 500 ml de agua destilada en un matraz de 1.000 ml y seguir las instrucciones en el paquete para disolver la mezcla de agar de uva. </li><li> Vierta cuidadosamente una capa gruesa de la mezcla en 100 mm placas de Petri mientras que evita la formación de burbujas. Un paquete de premezcla produce aproximadamente 14 grape placas de agar. </li><li> Que los medios de comunicación enfriar y solidificar a temperatura ambiente con tapas en los de 15 min. Las placas pueden mantenerse a 4 ° C, envuelto en una envoltura de plástico, o se utiliza inmediatamente. </li></ol> 4. Colección de huevos sincronizados Todos los medios utilizados en este protocolo, la levadura es decir, las placas de agar de uva, CT y 10% de alimentos SY, deben estar a temperatura ambiente. <ol><li> Extender una capa de 2-3 cm de diámetro de la levadura pega en una placa de agar uva y reservar. </li><li> Coloque un huevo jaula amplia colección en una plataforma de CO 2 con la malla hacia abajo para anestesiar a las moscas. A base de nitrógeno anestesia es una alternativa a CO 2, utilizado por algunos laboratorios, que puede producir resultados de alta calidad 7. </li><li> Usando un embudo, transferir 150-200 pares de moscas en la jaula de recolección de huevos. </li><li> Colocar la placa de agar de uva para cubrir el extremo abierto de la jaula y asegurar con una tapa de extremo. </li><li> Coloque la jaula de su lado hasta que las moscas despertar.A continuación, mantenga la caja, lado uva placa de agar hacia abajo, en la incubadora durante la noche. </li><li> En el día siguiente, intercambiar la placa de uva con una placa de uva recién yeasted. Sólo coloque alrededor de 1 cm de diámetro de pasta de levadura en la superficie de la placa. Deseche el 1er día placa uva. </li><li> Permita que los embriones a acumularse en la superficie de la placa de agar uva por 16-22 h. Una vez hecho esto, recoge la placa de agar uva y deseche las moscas de los padres. </li><li> Lavar la superficie de las placas de agar de uva con 1x Tampón fosfato salino (PBS). Los huevos pueden ser movilizados, raspando suavemente con un hisopo de algodón. Tenga cuidado de no rayar, dañar o raspar las piezas delgadas de agar de la superficie de la placa. Con la ayuda de un embudo, vierta los huevos lavados en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Deje que los huevos se depositan en el fondo del tubo y retirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder ningún huevo. El volumen restante debe ser alrededor de 2-3 ml. </li><li> Añadir 8-10 ml de PBS al tubo y repetir el paso por encima de 2-3 morveces e de lavar bien los huevos hasta que el sobrenadante es claro. Deshacerse de la levadura residual es la clave en este paso. </li><li> Después del lavado, drenar todo el sobrenadante hasta que el volumen restante es 2 ml. Alícuota 32 l de huevos en botellas de TC con una punta de pipeta de grueso calibre. Huevos en la punta de la pipeta debe ser compacto, con poco o ningún líquido aspirado. Esto puede lograrse mediante la inserción de la punta de la pipeta profundamente en la solución de huevo y soltando rápidamente el émbolo para aspirar. </li><li> Lugar cabeza de serie CT botellas de nuevo en la incubadora durante todo el desarrollo mosca. </li></ol> 5. Colección de la Edad de concordancia moscas adultas <ol><li> Los adultos generalmente se ECierre desde el día 9 en adelante. Deseche las moscas que surgieron en el primer día y colocar las botellas de nuevo en la noche a la mañana incubadora. Esta práctica evitará la selección inadvertida para los primeros emergentes y permiten la recolección de un número máximo de moscas sincronizados. </li><li> 16-22 horas más tarde, traslado al adulto días de edad moscas into 10% SY botellas de alimentos. Si es necesario, otro lote se puede recoger el día siguiente. </li><li> Volver vuela de nuevo en la incubadora y permitir que las moscas en alcanzar la madurez sexual y se aparean durante dos días. Registre el día de la transferencia a 10% botellas SY como el primer día de la edad adulta. </li></ol> 6. Clasificación moscas y configuración Experimento Longevidad <ol><li> Anestesie pequeños grupos de moscas en la almohadilla anestésico, entonces los machos y las hembras de clasificación en dos grupos utilizando un pincel. Si se utiliza CO 2, es crítico para minimizar la exposición para prevenir posibles duraderos problemas de salud que pueden comprometer la integridad de la longevidad experimento. </li><li> Coloque 30 moscas del mismo sexo en viales individuales. Suponiendo que no hay cromosomas equilibradores de la población y de la progenie saludable, cada botella debe producir alrededor de 3-4 viales de cada sexo. Moscas alícuotas en viales individuales deben tener no más de 3-4 min, de modo que, en total, moscas sólo están expuestos a la anestesia durante un máximo de9-10 min. </li><li> Repita los pasos 6.1-6.2 hasta que haya vial 8-10 repeticiones para cada género y el tratamiento experimental. </li></ol> 7. Configuración de la hoja de cálculo Excel para realizar el seguimiento del experimento Longevidad <ol><li> Recomendamos aleatorizar posición vial en lugar de viales de Agrupación por condición experimental con el fin de evitar el sesgo asociado con la ubicación vial en la incubadora y para ocultar la identidad del vial en el experimentador. Para ello, primero asigne un ID aleatorio numérico a cada frasco en un programa de hoja de cálculo, a continuación, organizar los viales en bandejas por número de ID. Si está utilizando el software de gestión de dLife experimento, siga el tutorial de configuración del experimento para generar el número de identificación para cada vial. </li><li> (Opcional) Si utiliza un lector de código de barras o lector RFID en asociación con dLife, adjuntar una etiqueta RFID o códigos de barras a cada vial y asociar la etiqueta con el identificador numérico del vial en dLife. El programa reconocerá cada vial cuando se escanea con un lectory una guía para grabar los datos en la ubicación correcta en una hoja de cálculo. Uso de un lector de etiquetas, en relación con dLife reduce significativamente el tiempo de recogida de datos y el error de grabación. </li></ol> 8. Mantener el Experimento Longevidad Los viales que contienen los alimentos frescos deben estar a temperatura ambiente para cada transferencia. <ol><li> Durante el período experimental, las moscas de transferencia sobre nuevos viales que contienen los alimentos frescos cada 2 días (mujeres jóvenes), o 3 veces a la semana (masculino o el femenino&gt; 3 semanas de edad). Este paso se asegurará de que el entorno de la alimentación para las hembras jóvenes no se vea perturbado por la presencia de larvas. Esta transferencia debe realizarse sin anestesia, que puede inducir la mortalidad aguda, particularmente en los mayores moscas (Pletcher, observaciones personales). </li><li> Durante cada vial de transferencia, registrar la edad, recuento de las moscas muertas en el vial de edad, y las moscas muertas que se llevan al vial de nuevo. Registre esta información por separado endos columnas en una hoja de cálculo (ya sea dLife o su propia hoja de cálculo). Esto asegurará que las moscas no son llevadas en cuenta dos veces. El número total de muertos (muertos + arrastrados) debe por lo menos igual al número de moscas realizadas a partir de la transferencia anterior. Reste el número de moscas previamente realizadas a partir del número total de muertes para determinar el número de nuevas muertes. </li><li> Una mosca se considera de derecha censurado si dejaba en el experimento antes de la muerte natural a través de fuga o muerte accidental. Los animales que salen del experimento de esta manera debería ser introducido en una columna separada en el día en que la marcha salió del experimento. Moscas censurado no se registran como muerto (ver más abajo). </li><li> Continúe repitiendo los pasos 8.1-8.2 hasta el último sobreviviente está muerto. Tenga en cuenta que a medida que la edad de las moscas, unas moscas pueden mentir sobre su espalda y aparecen muertos debido a su inactiveness. Por lo tanto, cuando se cuentan las moscas realizadas (muerto), toque en el lado de los viales para determinar si hay movimientos de las piernas. Si es así, thesmoscas correos están todavía vivos. En el caso en que las moscas quedan adheridas a la comida en el frasco viejo, pero vivos, no deberían ser contados como muertos y debe ser rescatado por más tapping del vial para desalojar la marcha. Censurar las moscas deben utilizarse con precaución, ya que puede dar lugar a sesgo experimental. </li></ol> 9. Análisis de Datos <ol><li> La curva de supervivencia muestra la probabilidad de que un individuo sobreviva para una edad dada y se calcula típicamente usando un enfoque de Kaplan-Meier (Figura 1) 8. En ausencia de datos de la derecha censurados, la fórmula se puede simplificar de tal manera que la supervivencia específica de la edad a la edad x (S x) se determina dividiendo el número de individuos vivos en el inicio de un tiempo de censo a la edad x (N x) por el número total de moscas en el experimento (N 0); x S = N x N / 0. 9.2) curvas de supervivencia son la forma más común de presentación de datos, y sepuede ser probado por la igualdad entre los grupos utilizando una prueba de log-rank. Inferencia razonable puede sacar de tan sólo 50 a 100 individuos de una cohorte. Supervivencia es una medida acumulativa, sin embargo, y por lo tanto las muertes que no están relacionadas con el envejecimiento, tales como los primeros años de vida, deprimirá la supervivencia a lo largo de la vida útil por lo que es difícil determinar los efectos específicos de envejecimiento. </li><li> Un método de visualización de datos es la segunda función de mortalidad específica por edad, que muestra el riesgo de morir por cada intervalo de edad y presenta una descripción más matizada de 9,10 datos de supervivencia. Medidas de mortalidad son independientes de una edad a otra, y la forma de la curva de mortalidad es útil para la inferencia sobre la dinámica de envejecimiento, particularmente cuando los tratamientos se ajustan durante la vida adulta. Las estimaciones de la mortalidad específica por edad, sin embargo, carecen de precisión y exactitud con tamaños de muestra pequeños, y con frecuencia requieren varios a varios centenares de individuos por cohorte para una es fiabletimate 11. </li><li> Otros métodos para la estimación de las diferencias de longevidad incluyen paramétrico (por ejemplo Gompertz) y semi-modelos paramétricos (por ejemplo, regresión de Cox). Estos modelos pueden ser de gran alcance, pero debe aplicarse con cautela debido a los supuestos acerca de la forma de las curvas de mortalidad y la naturaleza de los efectos del tratamiento, que podría llevar a la inferencia incorrecta 11,12. </li></ol>

<ol>
	<li>Toivonen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+influence+of+Indy+on+lifespan+in+Drosophila+after+correction+for+genetic+and+cytoplasmic+background+effects.">No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects.</a> PLoS Genet. 3, e95 (2007).</li><li>Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+an+'aging+gene'+in+long-lived+drosophila+strains:+increased+longevity+depends+on+sex+and+genetic+background.">Testing an 'aging gene' in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background.</a> Aging Cell. 2, 123-130 (2003).</li><li>Burnett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+effects+of+Sir2+overexpression+on+lifespan+in+C.+elegans+and+Drosophila.">Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila.</a> Nature. 477, 482-485 (2011).</li><li>Bokov, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+reduced+IGF-1R+signaling+in+Igf1r+/-+mice+alter+aging?.">Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging?.</a> PLoS One. 6, e26891 (2011).</li><li>Lewis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+standard+food+medium.">A new standard food medium.</a> Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).</li><li>Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+composition+specifies+consumption,+obesity,+and+lifespan+in+Drosophila+melanogaster.">Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster.</a> Aging Cell. 7, 478-490 (2008).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metab. 14, 623-634 (2011).</li><li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparametric+Estimation+from+Incomplete+Observations.">Nonparametric Estimation from Incomplete Observations.</a> Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).</li><li>Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+the+Tithonus+Error:+Genetic+Analysis+of+Mortality+Phenotypes.">Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes.</a> Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).</li><li>Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+life+spans+differ?+Partitioning+mean+longevity+differences+in+terms+of+age-specific+mortality+parameters.">Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).</li><li>Promislow, , Tatar, , Pletcher, , Carey, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Below-threshold+mortality:+implications+for+studies+in+evolution,+ecology+and+demography.">Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography.</a> Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).</li><li>Pletcher, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+fitting+and+hypothesis+testing+for+age-specific+mortality+data.">Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data.</a> Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).</li><li>Partridge, L., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarks+for+ageing+studies.">Benchmarks for ageing studies.</a> Nature. 450, 165-167 (2007).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Ford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+Drosophila+life+span+using+conditional,+tissue-specific+expression+of+transgenes+triggered+by+doxycyline+or+RU486/Mifepristone.">Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone.</a> Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).</li><li>Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parental+age+effects+on+the+evolution+of+aging.">The role of parental age effects on the evolution of aging.</a> Evolution. 56, 927-935 (2002).</li><li>Smith, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns.">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).</li><li>Sorensen, J. G., Loeschcke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+crowding+in+Drosophila+melanogaster+induces+Hsp70+expression,+and+leads+to+increased+adult+longevity+and+adult+thermal+stress+resistance.">Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance.</a> J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).</li><li>Bass, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+dietary+restriction+protocols+in+Drosophila.">Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).</li><li>Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+the+life+span,+vitality+and+fine+structure+of+Drosophila+melanogaster.">Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).</li><li>Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+systems:+longevity+as+a+function+of+circadian+resonance+in+Drosophila+melanogaster.">Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).</li><li>Joshi, A., Mueller, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+crowding+effects+on+longevity+in+Drosophila+melanogaster:+Increase+in+age-dependent+mortality.">Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality.</a> Current Science. 72, 255-260 (1997).</li><li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay.">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).</li><li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+reproduction+in+Drosophila:+New+insights+from+nutritional+geometry.">Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo presentado aquí describe un método para producir mediciones reproducibles de la longevidad de adultos de Drosophila que es adaptable para la evaluación de las intervenciones genéticas, farmacológicos, y ambientales. Aspectos cruciales del protocolo incluyen el control cuidadoso del entorno de desarrollo larval, reduciendo al mínimo el estrés adulto, y minimizar el sesgo entre los grupos experimentales y controles. También presentamos el uso del software de gestión de ciclo de vida dLife ex...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> La levadura seca activa </td><td> Levadura de Fleishmann </td><td> 2192 </td><td></td></tr><tr><td> Agar uva Premezcla en polvo </td><td> Genesee Científico </td><td> 47-102 </td><td></td></tr><tr><td> Grandes jaulas de recogida de embriones </td><td> Genesee Científico </td><td> 59-101 </td><td></td></tr><tr><td> Grandes capitalizaciones de repuesto End </td><td> Genesee Científico </td><td> 59-103 </td><td></td></tr><tr><td> 6 oz botellas cuadradas de fondo, polipropileno </td><td> Genesee Científico </td><td> 32-130 </td><td></td></tr><tr><td> Cierres para botellas de flugs </td><td> Genesee Científico </td><td> 49-100 </td><td></td></tr><tr><td> DrosophilaViales, poliestireno ancha, </td><td> Genesee Científico </td><td> 32-117 </td><td></td></tr><tr><td> Cierres para viales anchos flugs </td><td> Genesee Científico </td><td> 49-101 </td><td></td></tr><tr><td> Wide orificio Aardvark Puntas de pipetas, 200 ul </td><td> Denville Científico </td><td> P1105-CP </td><td></td></tr><tr><td> Flystuff Flypad, tamaño estándar </td><td> Genesee Científico </td><td> 59-114 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon de 15 ml Tubos de centrífuga cónicos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-70C </td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand platos Petri con tapas transparentes, levantó Ridge; OD 100 x 15 mm H; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Kimax * Colorware Frascos 1.000 ml amarillo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-200-47 </td><td></td></tr><tr><td> PBS pH 7,4 10 veces </td><td> Envitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> Gelidium Agar </td><td> Mooragar </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Levadura </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0290331280 </td><td></td></tr><tr><td> Azúcar Granulada </td><td> Kroger </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Tegosept </td><td> Genesee Científico </td><td> 20-266 </td><td> Fly conservante de alimentos </td></tr><tr><td> Ácido propiónico, 99% </td><td> Acros Organics </td><td> 149300025 </td><td> Fly conservante de alimentos </td></tr><tr><td> Sulfato de Kanamicina </td><td> ISC BioExpress </td><td> 0408-10G </td><td></td></tr><tr><td> Tetraciclina HCl </td><td> VWR </td><td> 80058-724 </td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of lifespan in drosophila melanogaster

El envejecimiento es un fenómeno que provoca deterioro constante fisiológica en casi todos los organismos en los que se ha examinado, que conducen a una disminución del rendimiento físico y un mayor riesgo de enfermedad. Envejecimiento individual se manifiesta a nivel de población como un aumento en la mortalidad dependiente de la edad, que a menudo se mide en el laboratorio mediante la observación de la vida útil en grandes cohortes de individuos de igual edad. Los experimentos que buscan cuantificar el grado en que las manipulaciones genéticas o ambientales impacto esperanza de vida en organismos modelo simples han tenido un éxito notable para la comprensión de los aspectos del envejecimiento que se conservan a través de taxones y para inspirar nuevas estrategias para extender la esperanza de vida y la prevención de la enfermedad asociada a la edad en mamíferos . La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo atractivo para el estudio de los mecanismos del envejecimiento debido a su relativamente corta vida, la cría conveniente, y la genética fáciles.Sin embargo, las medidas demográficas del envejecimiento, incluyendo la edad y la supervivencia específica de la mortalidad, son extraordinariamente sensibles a incluso pequeñas variaciones en el diseño experimental y el medio ambiente, y el mantenimiento de las prácticas de laboratorio estrictos para la duración de los experimentos de envejecimiento se requiere. Estas consideraciones, junto con la necesidad de practicar un cuidadoso control de los antecedentes genéticos, son esenciales para la generación de mediciones robustas. De hecho, hay muchas controversias notables que rodean inferencia a partir de experimentos de longevidad en la levadura, gusanos, moscas y ratones que han sido relacionados con artefactos ambientales o genéticos 1-4. En este protocolo se describe un conjunto de procedimientos que se han optimizado durante muchos años de la medición de la longevidad en Drosophila utilizando frascos de laboratorio. También se describe el uso del software dLife, que fue desarrollado por nuestro laboratorio y está disponible para descarga ( <a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/ple</a>tcherlab / software). dLife acelera el rendimiento y promueve las buenas prácticas mediante la incorporación de diseño experimental óptima, lo que simplifica el manejo mosca y recopilación de datos, análisis de datos y la normalización. También vamos a discutir los muchos escollos potenciales en el diseño, la recogida e interpretación de datos de vida útil, y proporcionar medidas para evitar estos peligros.

Un esquema simplificado del protocolo se presentan en la Figura 1, donde se describen los pasos clave. La parte de sincronización del protocolo se puede utilizar para diversos ensayos que requieren emparejados por edad moscas adultas. Las curvas típicas de supervivencia de moscas de tipo silvestre se muestran en la Figura 2a, utilizando el experimento dLife software de gestión (Figura 2b, c). Los machos adultos suelen vivir más corto, co...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster es un organismo modelo eficaz para explorar las bases moleculares de la regulación de la longevidad. Este protocolo se discutirán los pasos involucrados en la generación de un reproducible, basado en la población de medición de la longevidad, así como los posibles escollos y cómo evitarlos.

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

measurement-of-lifespan-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

34.0K vistas.  University of Michigan. Drosophila melanogaster es un organismo modelo eficaz para explorar las bases moleculares de la regulación de la longevidad. Este protocolo se discutirán los pasos involucrados en la generación de un reproducible, basado en la población de medición de la longevidad, así como los posibles escollos y cómo evitarlos.

Video: Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Investigación

Biología

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Monitorización de la función del corazón en las larvas Drosophila melanogaster Para los estudios fisiológicos

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

La disección de Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Mejorada del Norte Blot Detección de los Pequeños ARN Especies en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

El mantenimiento de una<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Jaula Población

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...