Hay muchas personas que contribuyeron a este trabajo y la mayoría son de la membrana estructural y Grupo de Biología Funcional, ambos miembros pasados ​​y presentes. A todos les extendemos nuestro más sincero agradecimiento y reconocimiento. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), los Institutos Nacionales de Salud (GM75915, P50GM073210 y U54GM094599) y FP7 CM0902 Acción COST.

1. Preparación de la placa de cristalización Configuración de hacer un ensayo de cristalización robóticamente comienza con la preparación de la placa de base de la placa de vidrio cristalización sándwich (Figura 2), se describe en detalle en la referencia 2. La placa de base debe ser primero silanizada y el perforado de doble palo espaciador que crea los pocillos, se debe aplicar a la placa. Los materiales y suministros necesarios para ello se detalla en Materiales. <ol><li> Coloque la placa sobre una toalla de papel, se aplican unas pocas gotas de solución de silanización y distribuir uniformemente sobre la superficie de la placa con un pañuelo de papel. </li><li> Eliminar el exceso de solución silanizante por inmersión de la placa en un vaso de precipitados de agua. </li><li> Sacar la placa de la cubeta, colóquelo sobre una toalla de papel seca, lado silanizada, y secar la superficie expuesta frotando suavemente con una toalla de papel. </li><li> Retire la cubierta protectora de la perforación, doble palo separadory aplicar el espaciador, el lado adhesivo hacia abajo, sobre la superficie seca, silanizada de la placa de vidrio. Asegúrese de que el separador está colocado correctamente en la placa base, con la esquina superior izquierda y los dos lados adyacentes del espaciador y la placa, coincidente. </li><li> Utilizar un rodillo o rodillo para aplanar el espaciador en la placa base y para crear un sello hermético entre ellos. </li></ol> Premontados placas están disponibles comercialmente (HR3-151, Hampton Research; MD11-55-100, las dimensiones moleculares, y LCP96T UVP70U-, Swissci). Por razones de coste, se prefiere montar nuestros propios platos siguiendo el protocolo anterior. 2. En Meso Robot 1 El primero en meso robot que se muestra en este artículo de vídeo es la actualmente en uso en la MS y Grupo FB (Figura 3). Los detalles completos del robot se puede encontrar en Materiales y en la sección de referencia 5. Los materiales y equipment necesario establecer un ensayo de cristalización utilizando el robot se detallan en Materiales. <ol><li> Coloque la placa base con el espaciador preparado en la Sección 1 en la cubierta del robot. Tiene su propia plataforma marcados con posiciones bien para efectos de alineación placa base. La placa debe ser marcado para fines de identificación. </li><li> Fijar el bloque de 96 pocillos precipitante en su propia plataforma en la cubierta del robot junto a la placa de cristalización. </li><li> Abrir el bloque cuidadosamente despegando la tapa de sellado de plástico. </li><li> Encender el humidificador y dirigir el chorro de aire húmedo a través de una y la placa de base en la cubierta del robot. El humidificador se ha demostrado para reducir la evaporación de la solución precipitante y para mejorar la reproducibilidad a través de la placa de cristalización 5. Se puede activar antes de la puesta en marcha para pre-humedecer el área cuando la humedad relativa ambiente es baja, o de otro modo, justo antes de la dispensación de mesofase comienza. </li><li> Inicializar el robot siguiendo las instrucciones del fabricante. Instrucciones específicas del instrumento no se describirá aquí en detalle, porque los procedimientos exactos cambiará con el tiempo. Esencialmente, lo que ocurre durante la inicialización es que la mesofase dispensación brazo del robot está provisto de posiciones de referencia en tres direcciones ortogonales X, Y y Z. </li><li> Fije la mesofase proteína cargada en una jeringa de Hamilton, con aguja de dispensación, a 1 Brazo del robot (Figura 3). Los detalles completos de la forma de preparar la mesofase y cómo cargarlo en la jeringa se han descrito en las Referencias 3,7-10. </li><li> Retire la cubierta protectora superior del espaciador en la cristalización placa base y alinee los pozos en la placa con fiduciales en la plataforma placa base. Nota, con el fin de reproducir el vídeo, la cubierta de protección se deja en su lugar para ayudar al espectador durante el paso de alineación. </li><li> Alinee la punta de la aguja de la jeringuilla de dispensacióne con la parte inferior de la parte más alta y en la parte izquierda de la placa de cristalización (pocillo A1). Esto se hace por ojo ajustar la altura o la coordenada Z-del brazo de dispensación mientras ve la proximidad de la punta de la aguja llega a la parte inferior del pozo. Que la punta está justo tocando el fondo del pozo puede ser juzgado por desplazamiento de la placa de lado a lado en la plataforma mientras que muy ligeramente el ajuste de la altura del brazo de dispensación. </li><li> Entra en el ordenador la coordenada Z del brazo de distribución donde los contactos de la punta de la placa. De dispensación está programado para tener lugar con la punta de la aguja 80 micrómetros de esta referencia de posición Z que corresponde a la superficie de la placa base. </li><li> Posición por el ojo de la punta de la aguja en el centro del pocillo A1. Conservar en el ordenador de control en la X de referencia, la coordenada Y del brazo de distribución donde se centra la punta. Esta coordenada se utiliza para definir el centro de los pocillos restantes en la placa. </li><li> Prime la jeringa con el comando apropiado en el equipo robot para que mesofase fresca llena la aguja de dispensación y que los primeros pozos y posterior recibir su asignación completa de mesofase. Limpie mesofase extruido en la punta de la aguja con un pañuelo de papel. </li><li> Inicie el Run Robot (X-AP) programa para iniciar una ronda de lavado pasos donde las puntas de dispensación precipitantes en el brazo del robot 2 se lavan y se preparan para aspirar soluciones desde el bloque precipitante. </li><li> Activar el. Dispensar función en el robot para poner en movimiento la carga secuencial de los pocillos con proteína cargada de mesofase (generalmente 50 nl) primero, una columna de ocho pocillos a la vez, seguido por soluciones precipitantes (por lo general 800 nl) Entre las columnas de carga, los rendimientos de dispensación de mesofase brazo a una posición de estacionamiento donde se coloca el extremo de la aguja en una esponja humedecida para evitar la mesofase en la punta de la desecación. El proceso de dispensación de mesofase y precipitante se repite11 veces a través de la placa hasta que la placa está llena. La carga de una placa de 96 pocillos con mesofase y precipitante tarda 5 minutos para completar. </li><li> Tan pronto como la placa se llena y los brazos del robot han vuelto a sus posiciones de parque, retirar la placa de la cubierta del robot y colocarlo en una superficie sólida plana. </li><li> Inmediatamente, sellar la placa con una cubierta de vidrio para minimizar cambios dependientes del tiempo en la composición también. Es importante asegurarse de que todos los 96 pozos están completamente cubiertos, que la cubierta de cristal está alineado cuadrado con la placa de base y que ninguno de la cubierta de vidrio se extiende más allá de la huella de la base de la placa. Un rodillo o rodillo se utiliza para crear un apretado y un sello uniforme entre la cubierta de vidrio y el espaciador. </li><li> Inspeccione la placa para asegurarse de que la configuración fue como debería. Lo que se busca es un &quot;huevo frito en una sartén &#39;aparición en cada pocillo. La yema del huevo frito corresponde a la mesofase. La clara del huevo es el precipitante solutiy en el borde de la cazuela es el perímetro de la cristalización bien. Idealmente, los tres son concéntricos. </li><li> Colocar la placa en un área de almacenamiento de temperatura controlada para el crecimiento de cristales. </li><li> Si no hay más placas se van a instalar, quitar el bloqueo precipitante de la cubierta del robot, sellarlo herméticamente y poner de nuevo en el almacenamiento. </li><li> Retire la jeringa que contiene la mesofase del brazo del robot de dispensación, desmontarlo, y lavar sus piezas, incluidos aguja de dispensación y la férula, cuidadosamente con metanol y se seca en preparación para el próximo uso. </li></ol> 3. En Meso Robot 2. Mosquito LCP El Mosquito LCP robot (figura 4) incorpora un dispensador de mesofase similar a la utilizada por Robot 1. En contraste con Robot 1, se prescinde precipitante por medio de puntas desechables. Software de programación se utiliza para configurar el instrumento para trabajar con placas de cristalización particulares y precipitbloques de hormigas, y para dispensar volúmenes definidos por el usuario de mesofase y precipitante en una secuencia especificada. Estos detalles se proporcionan por el fabricante y no se describirá aquí. <ol><li> Preparar una jeringa Hamilton, y provista de aguja y llena de proteína cargada de mesofase, como se describe anteriormente bajo Robot 1 y en el artículo JoVE 1712 1. </li><li> Abrazadera de la jeringa en posición en el brazo de dispensación del robot. </li><li> Utilice la cubierta montada sensor láser para establecer las coordenadas X e Y de la aguja de la jeringa de dispensación. Este es un paso importante que se requiere para asegurar que la mesofase se dispensa con precisión en el centro de cada pocillo de la placa. </li><li> Con el toque de un botón en el panel de control principal de la jeringa para expulsar mesofase de la aguja. Eliminar mesofase extruido de la punta de la aguja con un pañuelo de papel en la preparación para usar el robot para cargar los pocillos. </li><li> Antes de colocar la placa de cristalización en la cubierta de la humedad de roboten la superficie de la plataforma con unas cuantas gotas de agua para ayudar a mantener la placa en su lugar por capilaridad. </li><li> Retire la cubierta protectora del espaciador en el cristal de la placa de base y colóquela en su plataforma firme para asegurar una buena adherencia. Utilizar las tres marcas fiduciales en la plataforma para alinear los pozos de esquina 3, garantizando así el correcto posicionamiento de los pozos de la placa con respecto a la punta de la aguja de dispensación. El instrumento está ahora manda a entrar en un ciclo de distribución. </li><li> El ciclo comienza con una etapa de cebado segundo donde mesofase es dispensado sobre una placa de vidrio pequeño inmediatamente antes de pasar a cargar pozos con mesofase fresco. Las cargas primer robot con mesofase una columna vertical de 8 pozos en la placa y luego utiliza las puntas desechables para dispensar solución precipitante en la parte superior del bolo mesofase. El proceso se repite 11 veces a lo largo de la longitud de la placa hasta que todos los pocillos se llenan. Todo el proceso toma alrededor de 5 minutos para completar. </li><li> Quitarla placa de llenado de la plataforma del robot y sellarla con una cubierta de vidrio como se describió anteriormente bajo Robot 1. </li><li> Colocar la placa, debidamente etiquetados, en un ambiente de temperatura controlada para el crecimiento de cristales. </li></ol> 4. En Meso Robot 3. Gryphon LCP El Grifo LCP robot (Figura 5) incorpora un sistema de dispensación de mesofase similares a la descrita anteriormente para Robots 1 y 2. Lo que lo distingue de los otros dos es que todas las 96 soluciones precipitantes se dispensan simultáneamente. <ol><li> Preparar la mesofase proteína cargada y cargarlo en la jeringa de dosificación, como se describe más arriba, en Robots 1 y 2, y en el artículo 1 JoVE 1712. </li><li> Abrazadera de la jeringa en posición en el brazo de dispensación del robot. </li><li> Colocar el bloque de solución precipitante y la placa de cristalización en la cubierta del robot. </li><li> Cargue la Ley de Educación Superior de 96 puntad con soluciones precipitantes. A definido por el usuario el tiempo de retardo se proporciona para facilitar la aspiración precipitantes viscosos. </li><li> Comandar el instrumento para entrar en un ciclo de distribución. El ciclo comienza con la mesofase se dispensa secuencialmente en los 96 pocillos en un proceso que toma alrededor de 1 min para completar. La cabeza 96 de punta a continuación, dispensa todos 96 soluciones precipitantes a la vez en la parte superior de los bolos de mesofase en los pocillos de la cristalización. El proceso de placa de carga completa se terminó en 2 min. </li><li> Retire la placa de llenado de la plataforma del robot y sellarla con una cubierta de vidrio como se describió anteriormente bajo Robot 1. </li><li> Colocar la placa, debidamente etiquetados, en un ambiente de temperatura controlada para el crecimiento de cristales. </li></ol> 5. Los resultados representativos El propósito de este artículo es demostrar vídeo cómo configurar automáticamente los ensayos de cristalización con un viscoso, la membrana de proteína cargada de mesofase en vidrio sandwich placas de 96 pocillos cristalización. El énfasis está en la automatización mediante el uso de robots especializados que requieren intervención manual mínima. La reproducibilidad y precisión, en términos de volúmenes de mesofase y precipitante dispensado y la colocación de ambos dentro del pozo, se espera que cuando un robot se utiliza. Estos son importantes desde el punto de vista de la detección eficaz de condiciones que apoyan crystallogenesis. Ellos también son críticos para el siguiente paso en el análisis de tuberías que es evaluar el crecimiento del cristal hace a menudo con equipos de imágenes. Ubicación de colocación o de bolo es clave para el proceso de imágenes, y la colocación irregular e incorrecta de bolo en el pozo por lo general requiere la intervención del usuario para corregir y lleva tiempo. Para fines de ilustración, ejemplos de placas correctamente y cargado incorrectamente se muestra en la Figura 6. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <html> Figura 1. El diagrama de flujo resume los pasos involucrados en la producción, cosecha y enfriamiento criogénico de meso-cultivadas en cristales de proteínas de membrana. Pasos rodeados por la línea de puntos rojos son el foco de este artículo Jove. Los robots fueron utilizados para dispensar soluciones mesofase y precipitación en los pasos 29-32. De Referencia 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A plena carga y sellado de 96 pocillos placa de vidrio sándwich cristalización. Cada pocillo contiene 50 nl fase cúbica y una solución precipitante l. Para mayor claridad, la fase cúbica se ha manchado con el rojo Sudán y la solución precipitante incluye azul de metileno. De la referencia 5. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. El meso en robot (Robot 1). El robot tiene dos brazos. Brazo 1 dispensa la mesofase lipídica proteína cargada. Brazo 2 dispensa soluciones precipitantes. Durante el llenado, la placa de 96 pocillos se mantiene en una posición fija en la cubierta del robot que es en sí mismo estacionario. Los dos brazos se mueven para ofrecer soluciones de mesofase y precipitante. De la referencia 3. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. El Mosquito LCP robot (Robot 2). En contraste con Robot 1, la cubierta de la LCP Mosquito, sobre la que sentarse la placa de 96 pocillos y el bloque de solución precipitante, se mueve horizontalmente durante el llenado. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. El Grifo LCP robot (Robot 3). Durante unaestablecido, el dispensador lipídica fase cúbica se traslada a entregar proteína cargada de mesofase en la placa de 96 pocillos. La cubierta se traduce luego en horizontal para colocar la placa bajo la cabeza punta solución precipitante. Todas las 96 soluciones precipitantes se dispensan simultáneamente. Fotografía de origen del fabricante ( <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) y etiquetado. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="La figura 6" /> Figura 6. Un completamente cargado y sellado 96 y placa sándwich de vidrio (A) y pocillos correctamente (B) y incorrectamente (C, D) llena utilizando el robot en meso (Robot 1). La etiqueta de código de barras en la placa en A se utiliza para el seguimiento de la placa en la placa de incubadora / formación de imágenes del dispositivo. En los paneles de BD, solución precipitante y mesofase se marcan P y M, respectivamente. La esperada &quot;huevo frito en una sartén &#39;apariencia del pozo en B es característica de una carga correctamente y bien sellada. En C, el precipitado se ha dispensado en el pozo incorrectamente en una posición fuera del centro y ha entrado en contacto con el espaciador. En C, parece también que el volumen de mesofase es menos de lo que debería ser. Un ejemplo de carga incompleta con solución precipitante se muestra en D. Para la escala, el diámetro de todos los pozos es de 6 mm.

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Eng. 4, 129-140 (2007).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination:+use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+crystallization.">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. 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T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution.">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li><li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis.">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography.">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001 (2012).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este artículo hemos demostrado vídeo cómo utilizar un robot para configurar automáticamente en los ensayos de cristalización meso en el 96-y placas de vidrio sándwich usando una mesofase lipídica proteína cargada. Los robots utilizados en este trabajo fueron especialmente diseñados para incluir una jeringa de vidrio de desplazamiento positivo para la entrega precisa y reproducible de volúmenes de nanolitros de la mesofase viscoso y pegajoso, como se describió originalmente 7. La exactitud y la precisión son características importantes de un robot. Sin embargo, estas características son sólo tan buena como el grado y la regularidad que se evalúa el rendimiento del robot y la calibración se realiza. No hace falta decir que el rendimiento del robot debe ser evaluado mientras que las placas individuales se están creando. No es correcto suponer que el robot funcione sin problemas y dejar que el robot ejecute de forma desatendida. El operador atento y observador debe estar en posesiónition notar por un sonido o una aparición cuando algo no está funcionando correctamente y para corregirlo de inmediato. Además, cada placa debe ser cuidadosamente inspeccionados por ojo para la uniformidad de contenido de los pocillos tan pronto como se cierra la placa y antes de que se pone de distancia para pruebas de cristalización. Esto sólo se requieren unos pocos segundos para realizar y se puede hacer mientras que la siguiente placa se está cargando. Al darse cuenta, por ejemplo, que los pozos particulares no estén llenos como puede resaltar el hecho de que un precipitante cierta punta dispensadora está funcionando mal. Si la entrega de mesofase se ve que es irregular, el elemento defectuoso relevante tendría que ser corregido inmediatamente. Al tomar nota de estas cuestiones y hacer los ajustes pertinentes durante el tiempo que ahorrará tiempo y materiales, incluyendo lípidos y valiosa proteína de membrana. Si un generador de imágenes se utiliza para seguir el crecimiento del cristal, la exactitud y precisión también se puede monitorizar durante la exploración. Por ejemplo, los problemas sistemáticos con gota o boloubicación de la cámara indican que algo no está bien y que la acción correctiva en algún lugar río arriba en el protocolo que se necesita. En aras de un rendimiento fiable tanto, el robot debe ser calibrado en un horario regular y según sea necesario. Calibraciones debe incluir el volumen de precipitante y mesofase suministrar, así como la colocación de bolo y precipitante en el pocillo. Obviamente, siempre que sea posible la calibración se debe hacer uso de volúmenes y materiales similares a aquellos que se utilizan en los ensayos llevados a cabo en el período cubierto por el ejercicio de control de calidad. Tan importante como la calibración también lo es tener en stock un suministro adecuado de piezas de robot y suministros. Fracasos catastróficos e inesperados, bloqueos y caídas pueden ocurrir y ocurren. En tal caso, disponer de una punta de repuesto de entrega precipitante, por ejemplo, puede significar que una preparación de proteínas de membrana extremadamente valioso se utiliza como debería yno se desperdicia. Algunas de las ventajas de un robot incluyen el hecho de que funcionará esencialmente de forma continua y que no sufre de o &#39;se quejan de &quot;fatiga. Un robot también puede ser utilizado en condiciones que no son considerados humano de usar, tales como en la oscuridad, bajo una iluminación controlada y las condiciones ambientales, y en los extremos de temperatura. Los robots se demuestra en este artículo se han utilizado todos en condiciones ambientales a ~ 20 ° C. Sin embargo, hay proteínas y proyectos que requieren temperaturas no ambientales, luz controlada 11,12 y un oxidante o un entorno de reducción 13. Todos estos pueden ser atendidos, con relativa facilidad, cuando un robot de cristalización se utiliza. En un artículo anterior vídeo JoVE hemos demostrado cómo los ensayos de cristalización por el método de meso se configuran manualmente 1. El volumen mínimo de mesofase que se puede prescindir de manera fiable a mano se limita by la agudeza visual y constante uso de las manos de la persona que configura los ensayos. En nuestra experiencia, los volúmenes de mesofase tan bajas como 100 nl son fácilmente manipulados. Sabemos de un laboratorio donde el volumen predeterminado dispensado manual es de aproximadamente 40 nl. Sin embargo, los volúmenes considerablemente más pequeños son posibles utilizando un robot. Por otra parte, hemos demostrado que los volúmenes de mesofase tan bajas como 550 picolitros se puede prescindir de un robot 14. A partir de ese trabajo estaba claro que miniaturización por robot es posible que, si se aplica, daría lugar a una gran reducción en la cantidad de proteína de membrana valiosa necesaria para llevar a cabo un ensayo de cristalización. En este artículo de vídeo, tres robots disponibles comercialmente se utilizaron para demostrar de alto rendimiento de la cristalización de proteínas de membrana utilizando mesofases lipídicas. El primero de estos fue desarrollado en el Grupo de MS y FB basado en nuestra experiencia en el establecimiento ensayos manualmente, como se describe en JoVE 1712 1. Este es el instrumentoción tenemos más familiaridad y la mayor parte del artículo actual está dedicada a su uso. Los otros dos robots estaban en manifestación en el Grupo MS &amp; FB en el momento en que fue escrito el artículo y el material pertinente se incluye aquí en aras de la exhaustividad. Los tres robots usan mucho la mesofase mismo sistema de dispensación, la característica esencial de que es una jeringa de vidrio de desplazamiento positivo 5,7. Ellos difieren más significativamente con respecto a la entrega precipitante. Robots 1 y 2 puede prescindir precipitante simultáneamente en 8 pozos, una sola columna en una placa de cristalización a la vez. Por el contrario, Robot 3 dispensa los 96 soluciones precipitantes en una sola acción. Robot 2 es el único instrumento con puntas desechables precipitantes de dispensación. Hay ventajas y desventajas asociadas con los diferentes instrumentos que dependen de la aplicación particular, los cuales no serán elaborados por aquí. Basta con decir que todo el trabajo y han producido tres cristales de mímbrane proteínas por el método en meso. Los próximos pasos en el proceso general de determinación de la estructura por cristalografía macromolecular son para la cosecha y para la crio-cool cristales de las placas tal como se establece en este artículo y vídeo para grabar y proceso de difracción de rayos X de ellos. Estos temas se tratan en sendos artículos de esta serie Jove 1,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Componentes </td></tr><tr><td> Brayer (rodillo) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Impermeables a los gases jeringas </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Desechable </td></tr><tr><td> Las placas de vidrio </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Desechable </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Art Robbins </td><td> NA </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> En meso robot </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Laboratorio portátil </td><td> Vario </td><td> NA </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Mosquito LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Perforada de doble barra espaciadora cinta </td><td> Saunders Corporation (perforadas) </td><td> personalizado </td><td> Desechable </td></tr><tr><td> Soluciones precipitantes </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> El agua purificada </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Rain-X </td><td> Shell Car Care </td><td> 80199200 </td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Puntas de jeringa </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (calibre 22) </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Los tejidos </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Desechable </td></tr><tr><td> Cantimplora </td><td> vario </td><td> NA </td><td> Reactivo </td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

Los estudios de estructura-función de las proteínas de membrana se benefician mucho de tener disponibles de alta resolución de estructuras 3-D del tipo previsto a través de macromolecular cristalografía de rayos X (MX). Un ingrediente esencial del MX es una fuente constante de lo ideal de calidad de difracción de cristales. El meso o lipídica en fase cúbica (LCP) método para la cristalización de proteínas de la membrana es uno de varios métodos disponibles para la cristalización de proteínas de membrana. Se hace uso de una mesofase bicontinua en el cual crecer cristales. Como método, ha tenido algunos éxitos espectaculares en los últimos tiempos y ha llamado mucho la atención de los grupos de investigación ya muchos interesados ​​en su uso. Uno de los desafíos asociados con el método es que la mesofase de alojamiento es extremadamente viscoso y pegajoso, que recuerda a una pasta de dientes de espesor. Por lo tanto, la dispensación de forma manual de una manera reproducible en pequeños volúmenes en los pozos de cristalización requiere habilidad, paciencia y una mano firme. Un protocolo para hacer just que se desarrolló en la membrana Estructural y Funcional de Biología (MS &amp; FB) Grupo 1-3. Artículos Jove de vídeo que describen el método son 1,4 disponibles. El enfoque manual para la instalación en meso ensayos tiene claras ventajas con aplicaciones especializadas, tales como la optimización de cristal y derivatización. Lo hace sin embargo sufren de ser un método de bajo rendimiento. Aquí, demostramos un protocolo para la realización de ensayos de cristalización en meso robóticamente. Un robot ofrece las ventajas de velocidad, exactitud, precisión, la miniaturización y ser capaz de trabajar de forma continua durante largos períodos de tiempo menores de lo que podría considerarse como condiciones hostiles, tales como en la oscuridad, en una atmósfera reductora o a temperaturas bajas o altas. Un robot en meso, cuando se utiliza correctamente, puede mejorar enormemente la productividad de la estructura de proteínas de membrana y la investigación función facilitando la cristalización que es uno de los pasos lentos en laestructura general tubería determinación. En este artículo de vídeo, se demuestra el uso de tres robots disponibles comercialmente que pueden prescindir de la mesofase viscoso y pegajoso integral en crystallogenesis meso. El primer robot fue desarrollado en la MS y FB Group 5,6. Los otros dos se han convertido recientemente disponible y se incluyen aquí por completitud. Una visión general del protocolo cubierto en este artículo se presenta en la Figura 1. Todas las manipulaciones se realizaron a temperatura ambiente (~ 20 ° C) en condiciones ambientales.

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Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Aquí se describe un enfoque robótico a alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídicos para su uso en la determinación de estructura macromolecular usando cristalografía de rayos X. Tres robots capaces de manejar la viscosa y pegajosa proteína cargada de mesofase integral con el método se introducen.

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K vistas.  Trinity College Dublin. Aquí se describe un enfoque robótico a alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídicos para su uso en la determinación de estructura macromolecular usando cristalografía de rayos X. Tres robots capaces de manejar la viscosa y pegajosa proteína cargada de mesofase integral con el método se introducen.

Video: Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Investigación

Biología

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

La evaluación de dos dimensiones ensayos de cristalización de proteínas de membrana pequeña de Estudios de Biología Estructural de Cristalografía de electrones

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimiento de purificación de afinidad de proteínas marcadas con recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un método de alto rendimiento para la medición de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...