Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (KA1270/3-1/2) y BONFOR (O-112.0040).

1. Animales Hombre C57BL6 / J ratones con un peso medio de 25 g se obtuvieron de Harlan Winkelmann (Borchen, Alemania). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la ley federal acerca de la protección de los animales. Los principios del cuidado de los animales de laboratorio fueron seguidos. Los animales se mantuvieron en una luz de 12-hr / oscuridad ciclo y provisto de roedor comercialmente disponible chow y agua del grifo ad libitum. Animales deben ser alojados por lo menos 7 días después de la llegada en su instalación de animales antes de los experimentos. Tenga en cuenta que todos los experimentos se puede adaptar fácilmente a las ratas u otras especies y con ligeras modificaciones en los modelos de animales grandes. 2. Procedimiento Operativo <ol><li> La anestesia se induce y mantiene con isoflurano (Abbott, Wiesbaden, Alemania) en oxígeno. Después de la aparición de los animales en lugar de anestesia posición supina y las extremidades arreglar con cinta adhesiva (Leukosilk, Beiersdorf, Hamburgo, Alemania). </li&gt; <li> Después de la desinfección de afeitado y quirúrgica de la pared abdominal de una laparotomía mediana se realiza en una longitud de 2 centímetros. Introduzca la cavidad abdominal a través de una incisión a lo largo de la línea alba. Coloque dos retractores estériles para mantener el abdomen abierto. Cuidadosamente eventerate el intestino delgado hacia la izquierda y colóquela sobre una gasa de algodón húmeda. </li><li> Evacuar todo el contenido luminal del intestino delgado con dos aplicadores de algodón húmedo y estéril (MaiMed, Neunkirchen, Alemania) a la vez rodando el aplicador del píloro al ciego. PRECAUCIÓN: Evite las hemorragias de la pared del intestino delgado o lesiones de los vasos intestinales. Vuelve a colocar la tripa en la caverna peritoneal sin torcer para prevenir la isquemia o la obstrucción mecánica y cerrar la incisión abdominal utilizando una capa de dos continua 5/0 poliamida suturas no absorbibles (Ethicon, Norderstedt, Alemania). </li></ol> 3. Cuidado Postoperatorio <ol><li> Después de que el procedimiento de colocar al animal bajo una lámpara de calentamiento, observing hasta que se recupere de la anestesia. Ponga el ratón de nuevo en su jaula y permitir el acceso a agua y comida. Debido a la propiedad de los opiáceos afectan a peristalsis, realizamos analgesia perioperatoria con AINE (por ejemplo metamizol) en el agua potable. </li></ol> 4. Funcional estudios de 24 horas después de IM <ol class="lalpha"><li> Tránsito gastrointestinal (GIT) <ol><li> Anestesiar ligeramente ratones con isoflurano en oxígeno 22,5 horas después del IM. Cuidadosamente hiperextensión de la cabeza del ratón y tire de la lengua con unas pinzas romas. Llene una jeringa de 1 ml con al menos 100 l dextrano marcado con fluoresceína (FITC-dextrano, 70.000 MW, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemania), se conecta a un catéter arterial (Vygon, Ecouen, Francia) e inserte con cuidado el catéter como tubo gástrico en el estómago. </li><li> Brevemente se inyectan 100 l de FITC-dextrano y sacar el catéter. Dejar que el animal despierto y esperar 90 min. Durante este tiempo, los ratones tienen acceso a los alimentos o el agua. &lt;/ Li&gt; <li> Preparar quince tubos de 2 ml de hilado y etiquetar consecutivamente. </li><li> La eutanasia a los ratones 90 minutos después de la alimentación forzada y eliminar todo el tracto gastrointestinal desde el estómago hasta el recto. Coloque el intestino en una almohadilla de poliestireno y evitar el estiramiento. CAVE: Es crucial para eliminar el intestino suavemente para evitar el desplazamiento de líquido FITC-dextrano en el segmento de cerca. Para el principio podría ser útil usar clips al principio y al final de cada segmento. </li><li> Medir la longitud completa del intestino delgado y de longitud completa del colon. Divida el intestino delgado en 10 segmentos de igual tamaño por clavándolo a la almohadilla de poliestireno con cánulas. Divida el colon en 3 segmentos. Se han preparado 15 segmentos (estómago # 1), diez segmentos pequeños de igual tamaño intestinales (# 2-11), el ciego (# 12) y tres 3 segmentos colónicos igual tamaño (# 13-15). </li><li> Corte transversal del intestino en las posiciones marcadas, agarra con unas pinzas y lavar una vez con 1,0 ml KHB en el preparado previamente containi KHB2,0 ng ml tubos y agitar vigorosamente durante 20 segundos. El estómago y el intestino ciego se colocan directamente y corte en los tubos preparados. Llenar estos tubos con 1,0 ml de KHB, así enjuague trazas de contenido luminal de la tijera en los tubos. </li><li> Centrifugar las sondas a 12.000 rcf durante 5 min a temperatura ambiente en una centrífuga de mesa. Durante la centrifugación preparar otros 15 numerados consecutivamente tubos de 1,5 ml. </li><li> Transfiera los sobrenadantes claros en el tubo de 1,5 ml nuevo y almacenar en la oscuridad a 4 ° C hasta su análisis (paso siguiente). Las sondas se pueden almacenar durante varios días a 4 ° C sin pérdida significativa de señal de FITC. Para un almacenamiento más prolongado añadir 0,09% Natrium-azida o tienda a &lt;-18 ° C. </li><li> Pipeta 100 dosillos mu l de los sobrenadantes en un negro de 96 pocillos (Greiner Bio One, Frickenhausen, Alemania). Pipeta dos muestras de 100 l de KHB como blanco. </li><li> Leer la placa en un lector de fluorescencia (Safire, Tecan, Crailsheim, Alemania) y cuantificar la fluorescence a 494 nm (absorción) / 521 nm (emisión) de longitud de onda. Restar los valores en blanco de muestras. </li><li> Calcular el centro geométrico (GC) de FITC-dextrano distribución, que es en realidad el centro de gravedad de la distribución de marcador, por la fórmula siguiente: GC = Σ (% del total de la señal fluorescente por segmento * número de segmento) / 100 </li></ol> Nota: Por multiplicando el porcentaje de fluorescencia de cada segmento con su número de segmento una media ponderada de la distribución del marcador en el intestino se evalúa. Este punto está influenciada tanto por la distribución y la distancia recorrida por el marcador, pero no asume ninguna distribución subyacente específica. 7 El valor calculado GC se presenta a menudo en combinación con un gráfico que demuestra la distribución del FITC dextrano sobre el tracto gastrointestinal (Figura 1A). </li><li> Tránsito colónico <ol><li> Los ratones deben ser débilmente anestesiaron con isoflurane 2% en oxígeno. PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el animal se despertará dentro de 40 seg. </li><li> Examine cuidadosamente la permeabilidad del colon mediante la inserción de una sonda de fístula (varilla de metal, 2 mm de diámetro) a través del ano hacia el colon. </li><li> Uso de la sonda de fístula impulsar un vidrio de 2 mm de bola de 3 cm en el colon y saque la sonda inmediatamente. Coloque el ratón en una jaula transparente y comience a medir el tiempo después de la sonda de fístula fue sacado del colon. Mantenga un ojo en el ratón y detener el tiempo inmediatamente después de la bola de cristal se excreta. </li></ol></li></ol> 5. Análisis histoquímico de las muestras aisladas ME <ol><li> Midjejunal segmentos se cortan del intestino y se sumergieron en KHB frío en un plato lleno de Sylgard. </li><li> Mesenterio se fija en el plato con agujas de 0,2 mm de insectos (Herramientas Artes Ciencias, Heidelberg, Alemania). </li><li> Cortar el segmento a lo largo de su borde mesentérico y se extienden a ~ 120% de su longitud y anchura. Finalizar la fijación de los insectospins en el sitio opuesto de la mesenterio. Enjuagar la cápsula sylgard cuidadosamente con KHB fresco frío hielo, con lo que el lavado todos los contenidos luminales. ME puede ahora mecánicamente separada de la túnica mucosa de partida del mesenterio. Durante la preparación reemplazar frescos refrigerados varias veces KHB. </li><li> Separado túnica mucosa se puede choque congelados en nitrógeno líquido para su posterior análisis o descartados. </li><li> Fijar el aislado ME todo el montaje con 100% de etanol durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar los enteros montaje tres veces usando KHB fría. Nota: otros fijadores de formaldehído (es decir, 4%, ácido acético, acetona) también se puede utilizar después de la comprobación de su compatibilidad con el análisis posterior. </li><li> Los soportes ME enteros listos para la tinción histoquímica o más immunhistochemical: </li></ol><ol class="lalpha"><li> Histoquímica: mieloperoxidasa (MPO) tinción PMNs infiltrados pueden ser examinadas por el protocolo de tinción siguiente MPO. <ol><li> Resuelve 10 mg Hancla reactivo Yates (Polyscience Europa, Eppelheim, Alemania) en 10 ml KHB y añadir 100 ml de 3% de H 2 O 2. Prepare la solución recién inmediatamente antes de su uso y no se vuelva a usar. </li><li> Incubar montajes completos para 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague muestras extensamente con KHB frío y se incuba durante 10 min. </li><li> Montar los especímenes en el medio de montaje acuoso (Aquatek, Merck, Darmstadt, Alemania) Después de secar durante 2 hr analizar portaobjetos con un microscopio de luz. </li><li> Contar el número de células en 5 campos seleccionados al azar y calcular como MPO células positivas / mm 2. </li></ol></li><li> Tinción inmunohistoquímica: En consecuencia para la tinción histoquímica de MPO, coloraciones de inmunohistoquímica de los montajes enteros se puede realizar. Principalmente, sus protocolos establecidos tinción inmunohistoquímica de cultivos de células o cortes de tejido se puede adaptar fácilmente a una tinción de todo el montaje. Sin embargo, la optimización del procedimiento para anti específicacuerpos es muy recomendable. <ol><li> Cortar las muestras en trozos de 5 mm x 5 y realizar tinción en 2,0 ml de fondo redondo tubos de centrífuga en ~ 150 l - 200 l solución de anticuerpos. </li><li> La fijación y el bloqueo de procedimiento (es decir, BSA 3% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente) se puede realizar en el &quot;plato sylgard&quot;. </li><li> Los pasos de lavado en PBS o otros tampones puede realizarse en placas de 12-pocillos. </li><li> Transfiera los especímenes. Cuidadosamente con unas pinzas cortantes entre los tubos y placas de tinción de lavado. </li><li> Después de que las muestras de lavado final en el procedimiento de montaje anti-desvanecimiento medio de montaje con cubreobjetos y analizar con un microscopio de fluorescencia. </li></ol></li></ol> 6. Órganos de Cultura ME <ol><li> El intestino delgado entero se reseca 24 hr después de IM y se coloca en KHB frío que contenía 200 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina (KHB + P / S). </li><li> Cortar el intestino a 3 cm de longitud y el pin de cada segmento a un Sylgard contiene glass plato. </li><li> Retire el mesenterio con tijeras finas y deslice el intestino en una aguja de tejer. </li><li> Con cuidado corta el ME con unas pinzas afiladas y despojarlo de la submucosa de usar un aplicador de algodón húmedo. La túnica mucosa permanece en la aguja de tejer y puede ser congelaron para análisis adicionales. El ME se recoge en frío KHB + P / S. </li><li> Cortar las tiras aisladas ME en pequeños trozos de 2 a 4 mm de longitud y se incuba en hielo frío KHB + P / S durante media hora y enjuagar la muestra varias veces. </li><li> Transferir aproximadamente 50-60 mg ME (al menos la mitad de uno ME intestino delgado) en un recipiente estéril 24-así placa que contiene 500 l modificado Dulbecco s medio Eagle (DMEM). </li><li> Incubar a 37 º C y 5% de CO 2 por 24 horas adicionales. </li><li> Inspeccionar los cultivos celulares para la contaminación bacteriana o fúngica en un microscopio. </li><li> Recoger el sobrenadante, girar hacia abajo durante 5 min a 1000 fcr y congelamiento rápido en nitrógeno líquido. Mientras tanto secar secar el muscLe tejido en un tejido limpio durante 30 segundos y peso. </li><li> Los sobrenadantes se puede utilizar para el análisis posterior de la liberación de citocinas (IL-6) por ELISA o otros metabolitos (es decir, nitrito) en el sobrenadante, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Normalizar las concentraciones medidas por peso de tejido ME. </li></ol> 7. Los resultados representativos <ol><li> Estudios funcionales El parámetro más importante para evaluar la gravedad de POI es el examen de GIT in vivo. Figura 1A muestra una distribución típica de FITC dextrano a lo largo del tracto gastrointestinal en los controles no tratados y ratones manipulados intestinalmente 24 hr después de la cirugía. &quot;Operación simulada&quot; animales mostraron un GIT normal con un centro geométrica calculada (GC) en el ciego mientras IM condujo a un retraso significativo del GIT en el yeyuno proximal (Figura 1B) Motilidad colónica se centró por separado en la medición del tiempo bola excreción ofa 2 mm bola de cristal. Sham operado ratones muestran un tiempo de excreción de 48 a 200 segundos, mientras IM llevó a un tiempo prolongado entre la excreción de 470 a 775 seg (Figura 1C). </li><li> Estudios Morfológicos Para describir el inflamatoria se extienden dentro de los fenotipos ME varios de los leucocitos pueden ser analizados mediante histoquímica o inmunohistoquímica. En la figura 2A + B una escasa presencia de PMN en la &quot;operación simulada&quot; los animales se observó (39 ± 7 células / mm 2). IM del intestino delgado condujo a una fuerte infiltración de PMN (660 ± 86 células / mm 2) en comparación con los ratones operación simulada </li><li> ME Organ Culture Muchos mediadores inflamatorios liberados de las células son difíciles de detectar en lisados ​​tisulares. Cultivos de órganos permitir la detección de los mediadores liberados en el sobrenadante de cultivo. Un mediador representante en POI es NO, que es como neurotransmisor inhibidor en el tracto gastrointestinal. 5 NO no podía ser detectado en cul órgano MEtura sobrenadantes de los animales de control no operados (5 ± 6 micras / 24 tejidos hr / mg). En operación simulada (laparotomía) ratones los niveles de NO basal de 53 ± 36 micras / 24 tejidos hr / mg se observaron. ME cultivos de ratones manipulados intestinalmente (cosecharon 24 h después de la cirugía) producen significativamente más NO (2254 ± 853 micras / 24 tejidos hr / mg) durante 24 h de cultivo de órganos ME (Figura 3). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig1.jpg" /> Figura 1. Efecto de IM en GIT (A + B) y el tránsito colónico (C) GIT se midió como el porcentaje de no absorbible dextrano marcado con fluoresceína en 15 segmentos gastrointestinales del estómago (STO), intestino delgado (ID 1-9 ), ciego (CCA) y colon (Co) -90 minutos después de la ingestión oral. Tránsito colónico se midió como el tiempo desde tirando de la sonda de fístula hasta que la excreción de un 2 mm de cuentas de vidrio. (A) Gastrointestinal distribución de isotiocianato de fluoresceína-dextran después de la operación simulada o mensajería instantánea. En los animales operación simulada más del marcador está localizado en el ciego o el colon proximal en comparación con la ubicación proximal del yeyuno en los animales manipulados. Las líneas de puntos indican calculado GC. (B) Cálculo de la GC demostró una prolongación del tránsito gastrointestinal después de IM. (C) el tiempo de tránsito colónico mostró un retraso significativo en ratones IM en comparación con los animales operación simulada. GC para los 15 segmentos de intestino se muestran como la media (n = 5). Tiempos de tránsito colónico se visualiza decir con todos los valores individuales (n = 6). *** = P &lt;0,001, t de Student prueba. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig2.jpg" /> Figura 2. Detección de MPO positivos dentro de las células del intestino delgado ME. (A) ME montajes completos fueron teñidas con Hanker Yates reactivo para la detección de MPO positivo PMN 24 horas después de la laparotomía (simulacro) o el procedimiento de MI. (B) Cuantificación de las células positivas MPO dentro de 5 campos seleccionados al azar por ratón. n = 6 unanimals por grupo. *** = P &lt;0,001, t de Student prueba. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig3.jpg" /> Figura 3. Producción de NO en los sobrenadantes del cultivo de ME. Muestras musculares de los controles no operados, operación simulada y ratones IM fueron tomadas 24 horas después de la operación y se cultivaron durante 24 horas. Ratones no tratados mostraron sólo una producción basal muy bajo de NO. Después de la laparotomía NO liberación se incrementa sin medir diferencias significativas entre el grupo control y los ratones operación simulada. 24 horas después del IM producción de NO se incrementa dramáticamente en comparación con los ratones no tratados operados o simulada. n = 5 animales por grupo. *** = P &lt;0,001, un ANOVA de una vía.

<ol>
	<li>Wehner, S., Behrendt, F. F., Lyutenski, B. N., Lysson, M., Bauer, A. J., Hirner, A., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+macrophage+function+prevents+intestinal+inflammation+and+postoperative+ileus+in+rodents.">Inhibition of macrophage function prevents intestinal inflammation and postoperative ileus in rodents.</a> Gut. 56, 176-185 (2007).</li><li>Kalff, J. C., Schwarz, N. T., Walgenbach, K. J., Schraut, W. H., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+of+the+intestinal+muscularis:+their+phenotype+and+isolation.">Leukocytes of the intestinal muscularis: their phenotype and isolation.</a> J. Leukoc. Biol. 63, 683-691 (1998).</li><li>Kehlet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postoperative+ileus.">Postoperative ileus.</a> Gut. 47, iv85-iv86 (2000).</li><li>Wehner, S., Schwarz, N. T., Hundsdoerfer, R., Hierholzer, C., Tweardy, D. J., Billiar, T. R., Bauer, A. J., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IL-6+within+the+rodent+intestinal+muscularis+after+intestinal+surgical+stress.">Induction of IL-6 within the rodent intestinal muscularis after intestinal surgical stress.</a> Surgery. 137, 436-446 (2005).</li><li>Kalff, J. C., Schraut, W. H., Billiar, T. R., Simmons, R. L., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+inducible+nitric+oxide+synthase+in+postoperative+intestinal+smooth+muscle+dysfunction+in+rodents.">Role of inducible nitric oxide synthase in postoperative intestinal smooth muscle dysfunction in rodents.</a> Gastroenterology. 118, 316-327 (2000).</li><li>Iyer, S., Saunders, W. B., Stemkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+of+postoperative+ileus+associated+with+colectomy+in+the+United+States.">Economic burden of postoperative ileus associated with colectomy in the United States.</a> J. Manag. Care Pharm. 15, 485-494 (2009).</li><li>Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+measurement+of+intestinal+transit+in+the+rat.">Accurate measurement of intestinal transit in the rat.</a> J. Pharmacol. Methods. 6, 211-217 (1981).</li><li>Kalff, J. C., Schraut, W. H., Simmons, R. L., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+manipulation+of+the+gut+elicits+an+intestinal+muscularis+inflammatory+response+resulting+in+postsurgical+ileus.">Surgical manipulation of the gut elicits an intestinal muscularis inflammatory response resulting in postsurgical ileus.</a> Ann. Surg. 228, 652-663 (1998).</li><li>Wehner, S., Straesser, S., Vilz, T. O., Pantelis, D., Sielecki, T., de lC, V., Hirner, A., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+as+prophylaxis+of+postoperative+ileus+in+mice.">Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase pathway as prophylaxis of postoperative ileus in mice.</a> Gastroenterology. 136, 619-629 (2009).</li><li>Konigsrainer, I., Turck, M. H., Eisner, F., Meile, T., Hoffmann, J., Kuper, M., Zieker, D., Glatzle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gut+is+not+only+the+Target+but+a+Source+of+Inflammatory+Mediators+Inhibiting+Gastrointestinal+Motility+During+Sepsis.">The Gut is not only the Target but a Source of Inflammatory Mediators Inhibiting Gastrointestinal Motility During Sepsis.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 753-760 (2011).</li><li>Schwarz, N. T., Kalff, J. C., Turler, A., Speidel, N., Grandis, J. R., Billiar, T. R., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+jejunal+manipulation+causes+postoperative+pan-enteric+inflammation+and+dysmotility.">Selective jejunal manipulation causes postoperative pan-enteric inflammation and dysmotility.</a> Gastroenterology. 26, 159-169 (2004).</li><li>Engel, D. R., Koscielny, A., Wehner, S., Maurer, J., Schiwon, M., Franken, L., Schumak, B., Limmer, A., Sparwasser, T., Hirner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+helper+type+1+memory+cells+disseminate+postoperative+ileus+over+the+entire+intestinal+tract.">T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract.</a> Nat. Med. , (2010).</li><li>Stoffels, B., Schmidt, J., Nakao, A., Nazir, A., Chanthaphavong, R. S., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interleukin+10+in+murine+postoperative+ileus.">Role of interleukin 10 in murine postoperative ileus.</a> Gut. 58, 648-660 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Un estudio comparativo de análisis de los diferentes niveles de IM (eventración intestino delgado durante 10 min versus suavemente inspección del intestino delgado usando dos aplicadores de algodón versus IM con la evacuación del contenido del intestino delgado en el ciego) reveló una correlación entre la magnitud de la manipulación quirúrgica y PDI. En comparación con los otros grupos IM mostraron la mayor cantidad de leucocitos en el ME (PNMS, macrófagos y mastocitos) que resulta en POI prolongada y severa....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Ethilon 5/0 </td><td> Ethicon </td><td> 1666H </td></tr><tr><td> Aplicadores de algodón </td><td> MaiMed </td><td> 71010 </td></tr><tr><td> catéter arterial </td><td> Vygon </td><td> 115-798 </td></tr><tr><td> Placa de 96 pocillos (negro) </td><td> Greiner Bio One </td><td> 655096 </td></tr><tr><td> bola de cristal (2 mm de diámetro) </td><td> Worf </td><td> disponible a petición </td></tr><tr><td> Los alfileres entomológicos </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26000-25 </td></tr><tr><td> Hanker Yates Reactivo </td><td> Polyscience </td><td> 560694 </td></tr><tr><td> Aquatek </td><td> Merck </td><td> HC109850 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-604 F </td></tr><tr><td> FITC-dextrano (PM 70000) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 46945-500MG-F </td></tr></tbody></table>

functional assessment of intestinal motility and gut wall inflammation in rodents: analyses in a standardized model of intestinal manipulation

Inflamación del tracto gastrointestinal es una razón común para una variedad de enfermedades humanas. Los modelos animales de investigación son fundamentales en la investigación del complejo celular y molecular de la patología intestinal. Aunque la túnica mucosa es a menudo el órgano de interés en muchas enfermedades inflamatorias, las obras recientes demostraron que la muscular externa (ME) es también un órgano altamente inmunocompetente que alberga una densa red de inmunocitos residentes. 1,2 Estos trabajos se realizaron dentro de la estandarizado modelo de manipulación intestinal (MI) que conduce a la inflamación de la pared del intestino, principalmente limitada a la ME. Clínicamente esta inflamación conduce a la alteración de la motilidad intestinal prolongado, conocido como el íleo postoperatorio (POI), que es una complicación frecuente e inevitable después de la cirugía abdominal. 3 La inflamación se caracteriza por la liberación de mediadores proinflamatorios tales como IL-6 4 o neurotransmisores IL-1β o inhibidora como Nitric óxido (NO). 5 Posteriormente, un tremendo número de inmunocitos extravasarse en el ME, dominado por los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) y monocitos y finalmente mantener POI. Lasting para 2 días, esta parálisis intestinal conduce a un aumento del riesgo de aspiración, la translocación bacteriana y complicaciones infecciosas hasta sepsis y fallo de órganos múltiples y causa una alta carga económica. 6 En este manuscrito se demuestra el modelo normalizado de mensajería instantánea y evaluación in vivo de tránsito gastrointestinal (GIT) y el tránsito colónico. Además se demuestra un método para la separación de la EM a partir de la túnica mucosa seguido de análisis inmunológico, que es crucial para distinguir entre las respuestas inflamatorias en estos compartimentos de pared ambos altamente inmunoactivos intestinales. Todos los análisis son fácilmente transferibles a los otros modelos de investigación, que afecta la función gastrointestinal.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation at JoVE.com

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

El íleo postoperatorio (POI) es una complicación de la cirugía abdominal que lleva a una mayor morbilidad y una estancia hospitalaria prolongada. Como las estrategias profilácticas o terapéuticas faltan intensificación de la investigación es necesaria. Por lo tanto, se estableció un modelo de ratón estandarizado y factible para investigar la fisiopatología de la PDI y estudiar posibles opciones terapéuticas.

Evaluación funcional de la motilidad intestinal y la inflamación de la pared intestinal en roedores: Análisis de un modelo estandarizado de manipulación intestinal

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

functional-assessment-intestinal-motility-gut-wall-inflammation

Research

JoVE Journal

Medicine

21.9K vistas.  University of Bonn. El íleo postoperatorio (POI) es una complicación de la cirugía abdominal que lleva a una mayor morbilidad y una estancia hospitalaria prolongada. Como las estrategias profilácticas o terapéuticas faltan intensificación de la investigación es necesaria. Por lo tanto, se estableció un modelo de ratón estandarizado y factible para investigar la fisiopatología de la PDI y estudiar posibles opciones terapéuticas.

Video: Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murino Endoscopia para<em&gt; En Vivo</em&gt; Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Investigación

Medicina

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modelo murino de isquemia-reperfusión intestinal Lesiones

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ischemia, when the blood supply and therefore oxygen is decreased to the intestine. This leads to intestinal barrier loss and damage to the underlying tissue. Intestinal stem cells reside at the base of the crypts of Lieberk&#252;hn and are responsible for intestinal renewal during homeostasis and following injury. Ex vivo cell culture techniques have allowed for the successful study of epithelial stem cell interactions by establishing culture conditions that support the growth of three-dimensional epithelial organ-like systems (termed "enteroids" and "colonoids" from the small and large intestine, respectively). These enteroids are composed of crypt and villus-like domains and mature to contain all of the cell types found within the epithelium. Historically, murine models have been utilized to study intestinal injury. However, a porcine model offers several advantages including similarity of size as well as gastrointestinal anatomy and physiology to that of humans. By utilizing a porcine model, we establish a protocol in which segmental loops of intestinal ischemia can be created within a single animal, enabling the study of differing time points of ischemic injury and repair in vivo. Additionally, we describe a method to isolate and culture the intestinal stem cells from the ischemic loops of intestine, allowing for the continued study of epithelial repair, modulated by stem cells, ex vivo.

This protocol will enable readers to successfully establish a porcine model of segmental intestinal ischemia and subsequently isolate and culture intestinal stem cells for the study of epithelial repair following injury.

Aislamiento de células madre intestinales y de la cultura en un modelo porcino de isquemia Intestinal pequeño segmentaria

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

Uso de una biopsia química para la evaluación de la calidad del injerto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

Evaluación histomorfométrica estandarizada de la osteoartritis en un modelo de ratón quirúrgico

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Aislamiento del mesénquima intestinal murino que resulta en un alto rendimiento de telocitos

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Manipulación estandarizada de Tuina para la artrosis de rodilla en ratas

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Autor destacado: Entendiendo el mecanismo de la manipulación de la tuina en ratas 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Manipulación de Tuina para reducir la inflamación y la pérdida de cartílago en ratas con artrosis de rodilla

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...