El análisis sistemático de puntuación es una técnica para evaluar lesiones mucosas, facilitando la interpretación histológica que pueden realizar investigadores capacitados. Las principales ventajas de este método es que es gratuito y fácil de usar. Permite el análisis cuantitativo de los datos histológicos obtenidos de los intestinos de ratones con colitis.
Este protocolo proporciona una forma rápida y reproducible de interpretar la gravedad de la enfermedad de todo el colon, que es necesaria para comparar enfermedades de animales de diferentes orígenes genéticos. Para la preparación de tejidos, es importante organizar todos los reactivos y materiales. Comience colocando un ratón eutanasiado en una almohadilla de disección en una posición supina e inmovilice las extremidades del ratón usando agujas de 20 calibres y 1,5 pulgadas.
Usando fórceps y tijeras, hacer una pequeña incisión en la piel abdominal y tirar de ella hacia un lado para exponer el peritoneo, luego abrir la cavidad abdominal con una incisión de línea media en el peritoneo desde el hueso púbico a los lados del abdomen. Retire cuidadosamente los tejidos y órganos hasta que se visualice el intestino grueso. Corte el hueso pélvico a ambos lados del colon para visualizar completamente el órgano, extendiéndose desde el ano hacia el cecum.
Retire suavemente la grasa, las venas pequeñas y las arterias unidas al colon mientras disecciona cuidadosamente el órgano, cortando simplemente proximal al ano y distal al cecum. Enjuague cuidadosamente el colon con PBS para eliminar el contenido fecal utilizando una aguja de gavage de plástico flexible insertada a través del ano. Coloque el colon en línea recta y abra longitudinalmente a lo largo de la arteria mesenterica.
Bisect el colon longitudinalmente desde el distal hasta el extremo proximal. Utilice la mitad del tejido para el análisis histológico y la otra mitad para la mancha occidental, PCR, o enrollado en un segundo rollo suizo para la microscopía de inmunofluorescencia congelada fresca. Recorte el tejido adicional del colon proximal con una cuchilla de afeitar hasta que se obtenga aproximadamente la misma anchura a lo largo de la longitud de todo el colon.
Alinee el colon para exponer el lúmenes y aplanar el tejido completamente usando una aguja de gavage flexible. Agregue más PBS si es necesario para mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento. Retire el exceso de PBS con una toallita de papel.
Con una aguja de jeringa y gavage, agregue una solución de formalina tamponada 10% neutra durante dos o tres minutos para fijar y aplanar el tejido, luego use fórceps rectos para agarrar el extremo del colon distal y girar el colon en círculos concéntricos desde el extremo distal hasta el extremo proximal. Inserte una aguja del calibre 27 para fijar el colon en el medio y mantener su forma de rollo suizo, luego coloque el rollo suizo en un casete de incrustación dentro de un recipiente de muestra histológica orientando el tejido en paralelo con respecto al cassette. Fije el tejido en solución de formalina tamponada 10% neutral durante la noche a cuatro grados Celsius.
Después de la fijación durante la noche, lave el tejido tres veces con PBS. Agregue un 70% de etanol antes del proceso de incrustación de parafina y retire la aguja del rollo suizo antes de proceder. El tejido se puede almacenar en etanol a temperatura ambiente hasta la incrustación de parafina.
Después de abrir las imágenes escaneadas en el software de procesamiento de imágenes, compruebe que todo el punto es visible y que no faltan áreas de la muestra. Active las herramientas del imager de etiquetas y de la barra de escala para identificar correctamente las diapositivas escaneadas haciendo clic en imager de etiquetas. Abra la herramienta de anotaciones haciendo clic en anotaciones y cree tres capas diferentes haciendo clic en nueva capa para cuantificar la longitud total del rollo suizo, la inflamación o lesión, y la erosión o ulceración.
Elija un color diferente para cada capa haciendo clic en color de capa. Mida la longitud de cada capa o categoría haciendo clic en la herramienta pluma para dibujar una línea siguiendo la mucosa muscularis, moviendo el puntero según sea necesario para visualizar el área adyacente para su análisis. Ver la imagen a zoom de 400 micrómetros para facilitar una visualización adecuada de la mucosa muscularis.
Cada vez que se detenga el lápiz, se generará una nueva región de capa pequeña. Se puede visualizar y editar con la pestaña regiones de capa. Revise la longitud total, inflamación o lesión, y la erosión o ulceración medida usando la mucosa muscularis como referencia.
Una vez definidas todas las capas, exporte los datos mediante el botón exportar cuadrícula a archivo de texto dentro de las opciones de regiones de capa. Abra los archivos de texto y copie los datos en un software de hoja de cálculo. Totalizar todos los segmentos de cada región y calcular el porcentaje de lesiones y ulceración con respecto a la longitud total.
Considere tres características principales para calcular la puntuación de colitis histológica y evaluar la gravedad de la enfermedad. Compruebe si hay mucosa intestinal saludable, que se caracteriza por células epiteliales organizadas en el eje luminal cripta, propria lamina con pocas células inmunes y mucosa muscular subjacente. A continuación, compruebe si hay inflamación o lesión, que se caracteriza por criptas epiteliales que son atenuadas o parcialmente faltantes células epiteliales e inflamación mucosa con infiltración de neutrófilos en criptas.
Por último, compruebe la presencia de erosión o ulceración, que se caracteriza por zonas desprovistas de epitelio superficial o zonas completamente carentes de criptas de epitelio con o sin leucocitos asociados. Para ilustrar la fiabilidad de este análisis histológico de puntuación de colitis en el contexto de daños mucosos, se administró un 2,5% de DSS en el agua potable de ocho ratones de tipo salvaje C57BL6 durante cinco días, seguido de un período de recuperación con agua regular durante cinco días. El peso corporal se mantuvo constante durante la administración aguda de DSS, pero disminuyó drásticamente cuando los ratones comenzaron a beber agua corriente del grifo.
La sangre y las heces blandas aparecieron después de tres días de administración del SSD y continuaron hasta el octavo día del experimento. Estas observaciones sugirieron que los efectos más perjudiciales de la exposición al SSD se observaron durante el período de recuperación entre los días cinco y ocho. La medición de la longitud del colon el día 10 confirmó un acortamiento significativo al final del experimento.
Los colones fueron cosechados en el día cero, dos, cinco, siete, ocho y 10 para hacer rollos suizos de parafina. El tejido fue manchado con H&E y se analizaron exploraciones de alta definición para calcular la puntuación de colitis histológica y el porcentaje de lesiones y ulceración. Se observó arquitectura de cripta normal en ratones no tratados.
Después de dos días de administración del SSD, se observó el reclutamiento de células inmunes. El quinto día, las células epiteliales parecen dañadas y hubo una infiltración de neutrófilos a través del epitelio asociado con lesiones epiteliales. Desde el quinto al ocho día, se observaron áreas de pérdida epitelial con inflamación y ulceración.
El día 10, las células epiteliales comenzaron a regenerarse y repoblar áreas ulceradas, restaurando lentamente la mucosa colonica. Al intentar este protocolo, es importante crear un rollo suizo debidamente orientado y bien conservado, así como identificar correctamente la inflamación mucosa o lesiones y ulceración o erosión. Este método se puede utilizar para evaluar cuantitativamente lesiones a lo largo de toda la longitud de la mucosa colonica en otros modelos de colitis, como TMS o modelo de transferencia de células T.
