Este trabajo fue financiado por NEURON-ERANET descubrir (BMBF 01EW1003) para CK y JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CKVB el apoyo de una subvención de la Forschungskommission de la Facultad de Medicina de la Universidad de Düsseldorf.

1. Preparación de células de donante aggresome: Transfección de monomérico proteína fluorescente roja (mRFP) o aumento de proteína verde fluorescente (EGFP)-etiquetados humana de longitud completa (FL) DISC1 <ol><li> Seed 1,5 x 10 6/10 cm plato de neuroblastoma humano NLF (NLF, el Hospital de Niños de Filadelfia, Filadelfia, PA) en las células de diez platos de 10 cm y crecer durante la noche. Células del FNL se cultivan en RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina / Strepomycin, L-Glutamina. El día siguiente, las células deben estar en una confluencia del 70-80%. </li><li> Transfectar transitoriamente cada placa de 10 cm con 15 g de ADN plásmido y reactivo de transfección Metafectene (Biontex, Martinsried, Alemania). En breve, para un plato de 10 cm, 15 g de ADN plásmido y 30 Metafectene l se añadieron a 750 l de Opti-MEM, se mezcló y se incubó a TA durante 20 min. 5 platos fueron transfectadas con pcDNA3.1 mRFP / EGFP-etiquetados humanos (FL) DISC1 y 5 platos con el solo eGFP-plásmido. </li></ol> 2. AggresomeLa purificación de las células del donante transfectadas El protocolo descrito aquí es una combinación de un método para purificar Lewy-Cuerpos de tejido de cerebro 13 y un protocolo para aislar grandes agregados y aggresomes 14. Dado que los métodos ya existentes se basan en el uso de detergentes, el aislamiento de detergente libre de proteínas para la aplicación en ensayos de invasividad de las células-es crítica. <ol><li> 48 h después de la transfección, controlar la expresión de eGFP y mRFP/eGFP-DISC1 y confirmar la formación de aggresomes bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 1). </li><li> Lavar las células con PBS pH 7,4, raspar con 400 l de PBS cada una, añadir cóctel 1X inhibidor de proteasa (Roche, Indianapolis, IN) y romper las células utilizando un homogeneizador Precellys24 (Bertin Technologies, Francia). En pocas palabras, añadir 1 ml de suspensión celular a un tubo de lisis 2 ml y añadir 10 gotas de cerámica. Lisar las células con 3 x 60 pulsos por segundo. La fuerza mecánica del proceso puedeaumentar la temperatura dentro de la muestra por encima de 37 ° C, de modo se debe tener cuidado para enfriar la muestra en hielo después de que el procedimiento de lisis. </li><li> Enfriar las células en hielo y añadir 10 mM de MgCl 2, 40 U / ml de DNasa A y se incuba durante 60 min a 37 ° C </li><li> Se preparan soluciones de 80%, 50%, 20% de sacarosa (w / v) en PBS pH 7,4 (10 ml cada uno). </li><li> Preparar el gradiente de sacarosa en un tubo Falcon de 15 ml, comenzando con 2 ml de sacarosa 80%, seguido por 50% y 20%. Vierta lentamente la pendiente y tenga cuidado de no molestar a las capas ya derramado. Capa del lisado digerido en la parte superior del gradiente y se centrifuga durante 15 min a 1000 xg a 4 ° C. </li><li> Recoger cuidadosamente la interfase entre la capa de sacarosa al 50-80% con una pipeta y se mezcla con 5 volúmenes de PBS pH 7,4. Centrifugar durante 15 min a 1000 xg a 4 ° C. Repetir el lavado dos veces más. En esta interfase, aggresomes son fluorescentes y pueden ser visualizadas en un microscopio bajo luz UV. </li><li> Eliminar el sobrenadante yresuspender el precipitado en 250-500 l de PBS pH 7,4. Esta pastilla contiene la aggresomes purificado (Figura 2). </li></ol> 3. El tratamiento de los receptores SH-SY5Y células con mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Seed 5 x 10 4 receptores células SH-SY5Y de neuroblastoma humano que expresan constitutivamente GFP-DISC1 (598-854) en cubreobjetos de vidrio estériles en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. SH-SY5Y células se cultivan en DMEM/F-12 medio suplementado con penicilina / estreptomicina, no aminoácidos esenciales (NEAA) y FBS 10%. </li><li> 24 horas más tarde, se añaden 10 l a cada pocillo e incubar durante 48-72 horas. </li><li> Lavar las células 3 x con PBS pH 7,4 y apagar la fluorescencia extracelular con Trypan Blue 0,04% durante 5 min. </li><li> Fijar las células con PFA al 4% en PBS pH 7,4 durante 10 min en hielo, lavar una vez con H 2 O estéril y montar los cubreobjetos sobre el portaobjetos de vidrio con ProLong oro con DAPI medio de montaje (Invitrogen, EE.UU.). </li><li> Confirme la absorción /invasión de aggresomes exógenamente aplicadas por colocalización con proteínas de contratación expresadas por las células receptoras en Z-stack imágenes. </li></ol> Sin embargo, la absorción / invasión de proteína exógena no se podría detectar esencialmente en paralelo con el reclutamiento de proteínas de la célula huésped. En nuestro ejemplo mRFP-etiquetados DISC1 aggresomes recluta soluble GFP-etiquetados DISC1 (598-854) proteína expresada por la célula huésped (ver Figura 3). Las fotografías fueron tomadas en un Zeiss LSM 510 confocal o un microscopio Zeiss Axiovision Apotome2. 4. Generación de DISC1 recombinante (598-785) En una publicación anterior se analizó la capacidad de varios fragmentos de la proteína DISC1 a la libre interacción basado en la presencia de dominios de asociación libre. Entre todos los fragmentos de proteína probado humana DISC1 (598-785) que se muestra la propensión fuerte multimerización 4 (Figura 4). Por lo tanto, humana DISC1 (598 a 785) se clonó en pET15b (nvagen, Madison, Wisconsin) que contiene un 6-histidina N-terminal, expresada en E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, EE.UU.), y se purificó en condiciones desnaturalizantes en 8 mol / l de urea como se ha descrito 4. En resumen, el protocolo se describe a continuación. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli se cultivaron en 2 x 500 ml 2YT que contiene 5 mM-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 g / carbencillin ml, 35 mg / ml de cloramfenicol hasta una DO 600: 0.6-0.8 y DISC1 (598-785) se indujo la expresión con IPTG 1 mM. </li><li> DISC1 (598-785) se expresó durante 4 horas a 37 ° C, la expresión se terminó mediante la recolección de las bacterias por centrifugación. </li><li> El sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de tampón TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) más 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM MgCl 2 y 400 U/50 ml DNasa I. Para asegurar la lisis completa, la reacción se incubó durante 30 min a TA con agitación suave. </li><li> Añadir 10 mM β-mercaptooethanol (ME) y 500 mM NaCl y se incuba durante otros 30 min. </li><li> Decantar cuerpos bacterianos de inclusión a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento en 50 ml de tampón de extracción que contiene 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M de urea y 10 mM β-ME y eliminar los restos por centrifugación a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar el Ni-NTA agarosa matriz con tampón de extracción. Incubar el extracto resuspendido, proteína precleared con matriz de Ni-NTA durante 2 horas a RT. </li><li> Lavar la matriz de Ni-NTA con tampón de extracción que contiene 12 mM de imidazol. </li><li> Eluir la proteína lentamente con 15 ml de tampón de elución que contiene 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA y 10 mM β-ME. </li><li> Dializar la proteína por pasos a PBS pH 7,4 que contiene 10 mM β-ME. </li></ol> De 1 L cultivo bacteriano de partida, es posible aislar de hasta 50 mg de proteína de DISC1 (598-785) protEIN. α-sinucleína replegamiento Para experimentos con α-sinucleína, 500 ug de la proteína recombinante (Sigma-Aldrich, EE.UU.) se disolvió en PBS a una concentración de 1 mg / ml. Para obtener oligómeros, replegamiento se realizó durante la noche a 37 ° C como se describe en una publicación anterior 10. 5. Etiquetado de DISC1 recombinante (598-785) con DyLight594 <ol><li> Antes del proceso de etiquetado posterior, DISC1 (598-785) de proteínas tiene el ser liberado de β-ME. Por lo tanto, la proteína se dializó 3 veces con PBS pH 7,4 a una dilución de 1:2,000. </li><li> Etiqueta de 1 mg DISC1 (598-785) con DyLight 594 maleimida (Thermo Scientific, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se disuelve 1 mg / ml de proteína en PBS pH 7,4 y añadir 5 mM TCEP para recuperar los grupos tiol libres. Añadir 20 l de DMF disuelve el colorante a la reacción y se incuba durante 2 horas a RT. </li><li> Dializar la proteína 3 x PBS a pH7,4 en una proporción de 1:2000 durante 2 horas cada una. </li></ol> Para aumentar aún más la pureza de la proteína marcada una 6-Su etiquetados afinidad basada en la purificación en una columna de Ni-NTA se realiza. <ol start="4"><li> Lavar 1 ml de Ni-NTA matriz (Qiagen, Alemania) con 10 ml de PBS pH 7,4. </li><li> Aplique el etiquetado, la proteína dializada a la columna y se deja correr por la columna lentamente. </li><li> Lávese la proteína con 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 </li><li> Se eluye la proteína con PBS pH 7,4, 500 mM de imidazol gota a gota mientras se monitoriza la banda de color en la columna de Ni-NTA para reducir el volumen eluido. </li><li> Dializar el eluato 3 x a 10 mM NaPi pH 7,4 a una dilución de 1:2000 durante 2 horas cada una. </li><li> Utilice una jeringa estéril de 0,45 micras filtro para filtrar el eluato, la alícuota en 5 x 100 muestras mu l y congelamiento rápido en nitrógeno líquido. La cantidad total de proteínas debe ser 0,5 a 1 mg / ml en cada alícuota de 100 l. </li></ol> opcional concentración paso <ol start="10"><li> Para las inyecciones de rata estereotácticos, la proteína se concentró 10 veces en un Speed-Vac (concentrador de Eppendorf 5301). La condición de tampón final fue de 100 mM NaPi. </li></ol> α-sinucleína Etiquetado El etiquetado y la purificación (columna de Ni-NTA) del recombinante α-sinucleína se realizó en paralelo a DISC1 (598-785). El material de partida total fue de 500 mg en vez de 1 mg por DISC1 (598-785). 6. El tratamiento de los receptores SH-SY5Y células recombinante marcado con DISC1 (598-785) Proteínas <ol><li> Semillas 5x10 4 receptores células SH-SY5Y de neuroblastoma humano que expresan constitutivamente GFP-DISC1 (598-854) en cubreobjetos de vidrio estériles en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Añadir proteína marcada al medio de cultivo celular a una concentración de 5-10 mg / ml y se incuba durante 48-72 h. </li><li> Lavar las células 3 x con PBS pH 7,4 y apagar extracciónfluorescencia ellular con Trypan Blue 0,04% durante 5 min. </li><li> Fijar las células con PFA al 4% en PBS pH 7,4 durante 10 min en hielo, lavar una vez con H 2 O estéril y montar los cubreobjetos sobre el portaobjetos de vidrio con ProLong oro con DAPI medio de montaje (Invitrogen, EE.UU.). </li><li> Confirme la captación / invasión de exógenamente aplicado proteína recombinante por colocalización con proteínas de contratación expresadas por las células receptoras en Z-stack imágenes generadas por microscopía confocal de barrido láser. Sin embargo, el reclutamiento de la proteína endógena no puede ser detectado esencialmente en paralelo con la invasión de la proteína de la célula huésped, Z-Stack imágenes todavía puede confirmar la naturaleza invasiva de la proteína. </li></ol> En nuestro ejemplo rec. DISC1 (598-785) * al menos en parte reclutas soluble GFP-etiquetados DISC1 (598-854) la proteína expresada por la célula huésped (ver Figura 5). Para recombinante invasión α-sinucleína pero el reclutamiento no se muestra (Figura 5 B). Se tomaron fotosen un Zeiss LSM 510 confocal-o un microscopio Zeiss Axiovision Apotome2. La inyección del concentrado (ca. 4 l de 2,5 g / l), con la etiqueta DISC1 (598-785) * en los resultados mPFC en la difusión de la proteína alrededor del sitio de inyección que se puede detectar incluso después de la perfusión de los animales con 4% de PFA en PBS pH 7,4 con un Filterset rodamina. En nuestro ejemplo DISC1 (598 a 785) es tomada por un número distinto de neuronas y pueden ser controlados con Z-pila de imágenes (Figura 6). En general, la inyección de otras proteínas después los utiliza aquí no conducen necesariamente a la celda a la invasión. El evento de invasión es esencialmente dependiente de la naturaleza de la proteína, sin embargo una purificación limpia es un requisito previo para su posterior análisis. 7. Los resultados representativos Aggresomes consistentes recombinante FL DISC1-eGFP purificada a partir de células del FLN invadido destinatario SH-SY5Y ceLLS a la baja eficiencia (aproximadamente 0,3% 5) como se ve por colocalización con microscopía confocal (Figura 3). Como se informó anteriormente, DISC1 (598 a 785) expresada y purificada a partir de E. coli forman multímeros 4 fueron igualmente invasor de células con una eficiencia de aproximadamente 20% 5 (Figura 5A) similar a la de α-sinucleína que se usó en paralelo como control positivo (Figura 5B). DISC1 recombinante marcado (598 a 785) expresada y purificada a partir de E. coli fue también invasor de células de neuronas in vivo cuando la proteína multimérica se inyectaron estereotácticamente en la corteza prefrontal medial de la rata (Figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, no publicado). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Células de neuroblastoma que expresan transitoriamente FNL FP-DISC1 (rojo). Red aggresomes fluorescentes pueden ser deteCTED dentro de las células. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Purificada mRFP-etiquetados DISC1 aggresomes después de la purificación en un gradiente de sacarosa. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagen fluorescente de aggresomes invadidas. mRFP-etiquetados flDISC1 aggresomes se purificaron y se incubaron con células de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan GFP-etiquetados soluble DISC1 (598-854). Una absorción de aggresomes marcados se monitoriza mediante formación de imágenes pila Z en un microscopio láser-Scan (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. SEC-perfil de rec. DISC1 (598-785) que contiene el S704 y C704 los polimorfismos de nucleótido único (SNP). Ambas variantes muestran una interrupción de oligomerización ordenada y la formación de mult de alto peso molecularIMers (flecha roja). Este cuadro se modifica a partir de la publicación de Leliveld et al., Biochemistry, 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Fluorescente Z-stack de imagen invasivas DyLight marcado DISC1 recombinante (598-785). SH-SY5Y neuroblastoma células que expresan GFP-soluble DISC1 (598-854) se incubaron con la etiqueta, la proteína recombinante a una concentración de 5 mg / ml. (A) los agregados roja muestra la invasión de rec. DISC1 (598-785) de proteínas y puntos amarillos indican una selección de soluble GFP-DISC1 (598-854) en agregados. (B) recombinante α-sinucleína (rojo) invade las células sin la contratación con una frecuencia de aproximadamente 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="La figura 6" /> Figura 6. Inmunofluorescente de imageninyecta el etiquetado, DISC1 recombinante (598-785) de proteínas. Z-stack de imágenes confirma la presencia de rec. DISC1 (598-785) de proteínas en las neuronas corticales de rata teñidas con un anticuerpo contra núcleos neuronales (NeuN, verde).

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

En este estudio se describe la purificación de mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes a partir de una línea celular de neuroblastoma transfectadas, la preparación y el etiquetado de una especie de proteína recombinantes DISC1 y su aplicación en experimentos de invasión celular de las células receptoras in vitro e in vivo. La purificación de nativos mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes fue desarrollado a partir de protocolos para aislar Lewy cuerpo como las estructuras y los agregados más grandes 13, 14, pero modificado para evitar el uso de detergentes y para reducir al mínimo el riesgo de falsos positivos de células invasión que pudiera ocurrir debido a la penetración de la membrana detergente facilitado. Una mejora posible futuro podría ser el de aumentar aún más la pureza de los aggresomes por sonicación a completamente membranas separadas restantes y el citoesqueleto de los aggresomes. Al aumentar la pureza total, el número de eventos de invasión total de la registrada para las grandes ma aggresomesy se incrementará 5. Si la definición limitada de nuestra sugerido 3-fases sacarosa es suficiente para aggresomes de especies de otra proteína tiene que ser probado, en este sentido al protocolo descrito aquí debe ser considerado como un punto de partida para una optimización individual. Los aggresomes purificados resultó ser bastante robusto en nuestras manos, los pasos adicionales de lavado (sin detergente) para eliminar las trazas de sacarosa no redujo significativamente el rendimiento global. En una publicación anterior describimos que ensamblaje de oligómeros de DISC1 es dependiente de dominios de multimerización distintas en el extremo C-terminal 4 (Figura 4). Elegimos este fragmento para la expresión recombinante soluble en E. coli y la posterior purificación y Ni-NTA. Para controlar su multimerización y comparar su invasividad de las células con un descrito invasor de células como proteína α-sinucleína, la etiqueta DISC1 (598-785) con el colorante fluorescente DyLight594, y se comparó suinvasividad de células con el de la etiqueta igualmente α-sinucleína. La célula-invasividad del fragmento recombinante DISC1 se incrementó drásticamente en comparación con el de la nativa de longitud, completo DISC1 aggresomes, probablemente debido a su menor tamaño y pureza muy superior. Una vez más, la pureza parece jugar un papel decisivo en la celda de invasividad. En nuestro ejemplo los aggresomes invasivos reclutados proteína soluble homólogo de la línea celular diana que se expresa de forma recombinante en una forma soluble, es decir, células dispersas forman. La expresión de una proteína fluorescente (por ejemplo, GFP o RFP) en la línea de célula receptora es una ventaja, ya que permite la colocalización de aggresomes invasoras y las proteínas recombinantes dentro del límite de la célula receptora a través de imágenes Z-pila. Invasor de células aggresomes DISC1 y fragmentos multiméricos expresada y purificada a partir de E. coli podría ser un rasgo característico de algunas enfermedades conformacionales de proteínas relacionadas con DISC1, DISC1opathies 15. Solución de Problemas: Bajo rendimiento aggresome después de la purificación en gradiente de sacarosa: El gradiente de sacarosa presenta en este protocolo funciona bien con eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes consistentes en otras proteínas podrían ser de dimensiones variables por lo tanto, las concentraciones de sacarosa debe ser optimizado por otros usuarios. Purificación insuficiente de la proteína recombinante: Cualquier contaminantes bacterianos en el proceso de purificación de la proteína recombinante también será etiquetado en pasos posteriores del protocolo. Para evitar contaminaciones, ejecute la proteína en una SDS-PAGE y confirmar que la proteína recombinante es de al menos 95% de pureza por tinción con Coomassie Blue-. Para garantizar la más alta calidad y el rendimiento, el protocolo tiene que ser optimizado para cada proteína individual. Bajo ef etiquetadodeficiencia de proteínas recombinantes: Cualquier contaminaciones que contienen grupos SH libres disminuirá etiquetado eficiente de la proteína. Por lo tanto, la diálisis extensa y Ni-NTA purificación basado es obligatoria.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo nombre </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Medio es dependiente de la línea de células huésped. La línea receptor celular óptimo debe ser determinado por el usuario. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Medio es dependiente de la línea celular receptora. La línea receptor celular óptimo debe ser determinado por el usuario. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Otros reactivos de transfección podría funcionar también, pero no se probaron con el protocolo. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarosa </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Los experimentos se realizaron con Ni_NTA agarosa de Qiagen, otros proveedores deben trabajar también. </td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> No hay necesidad de RNasa libre de DNasa en el proceso de purificación aggresomes. </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Medio libre de suero funciona así </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Suplemento para SH-SY5Y y medianas NLF </td></tr><tr><td> No esencial-aminoácidos (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Suplemento para SH-SY5Y medio </td></tr><tr><td> 0,4% de azul de tripano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Reactivo tóxico </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 46608 </td><td> Reducción de colorante reactivo cisteína para formar enlaces tioéter estables. También disponible en otros colores. </td></tr><tr><td> Prolongar oro con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Este volumen de solución líquida Antifade dio mejores resultados en nuestras manos. </td></tr><tr><td> Cóctel inhibidor de la proteasa </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Disolver una mesa en 500 l de H 2 O para la solución 100X. </td></tr><tr><td> Sintético a-sinucleína </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Replegamiento como se describe en el texto. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla de reactivos específicos. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Tecnologías </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> No hemos probado homogénea otro mecániconizers distintos del presente. Otro método detergente libre homogeneización podría funcionar también, pero no se han probado para este protocolo. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrador (SpeedVac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Sólo es necesario si la proteína tiene que ser concentrado. </td></tr><tr><td> LSM 510 y Apotome2 Axiovision </td><td> Zeiss </td><td> Vea el catálogo de los fabricantes </td><td> Ambos microscopios albergan la capacidad de realizar pila Z de imágenes. Este es un requisito previo para una evaluación sólida y seria de eventos de invasión. </td></tr><tr><td> Cultivo de células de material plástico </td><td> Nunc </td><td> Platos de 10 cm # 172958, placas de 24 pocillos # 142475 </td><td> El uso de material plástico diferente podría influir en la interacción de proteínas recombinantes o aggresomes y las superficies de plástico. No hemos probado otros materiales que los descritos aquí. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla de material y equipos específicos. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Número </td><td> Buffer nombre </td><td> contenido </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Medio de crecimiento bacteriano </td><td> 16 g / l de Bacto triptona, 10 g / l de extracto de levadura Bacto, 5 g / l de NaCl, 5 mM-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 mg / ml de cloramfenicol </td><td> Crecer las bacterias a OD 600: 0.6-0.8 inducir la expresión con IPTG 1 mM. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Tampón de resuspensión bacteriana </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM MgCl 2 y 400 U/50 ml de DNasa I </td><td> Resuspender pellet bacteriano a partir de 1 L overnight cultura en 50 ml de tampón de resuspensión. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Tampón de extracción de proteínas </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M de urea y 10 mM de b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA columna de tampón de lavado </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M de urea y 10 mM de b-ME, 12 mM imidazol </td><td> Tampón modificado de extracción con 12 mM de imidazol añadido. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA columna de tampón de elución </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA y 10 mM de b-ME </td><td> El tampón de elución contiene 10 mM de b-ME, que se dializó después. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,44 g / l de Na 2 HPO 4, 0,24 g / l de KH 2 PO 4, ajustar a pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Etiquetado de búfer </td><td> PBS que contenía 5 mM TCEP </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tabla de recetas. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

La agregación de proteínas es visto como una característica general de las condiciones crónicas, degenerativas del cerebro como, por ejemplo, en las enfermedades neurodegenerativas enfermedad de Alzheimer (Aß, tau), enfermedad de Parkinson (α-sinucleína), enfermedad de Huntington (poliglutamina, huntingtina), y otros. Agregación de proteínas se cree que ocurre debido a proteostasis perturbado, es decir, el desequilibrio entre el surgimiento y la degradación de las proteínas mal plegadas. Es de destacar que las mismas proteínas que se encuentran agregadas en las formas esporádicas de estas enfermedades que son mutantes en las variantes raras de formas familiares. La esquizofrenia es una enfermedad crónica progresiva del cerebro que en muchos casos va junto con un déficit cognitivo permanente e irreversible. En un enfoque de genes candidatos, se investigó si Interrumpido en la esquizofrenia 1 (DISC1), un gen clonado en una familia escocesa con la vinculación con enfermedad mental crónica 1, 2, se puede encontrar en forma de agregados insolubles en el brain de casos esporádicos de esquizofrenia 3. Uso de la CC SMRI, hemos identificado en aproximadamente el 20% de los casos con CMD pero no los controles normales o pacientes con enfermedades neurodegenerativas sarkosyl insoluble en DISC1 inmunorreactividad después de fraccionamiento bioquímico. Estudios posteriores in vitro revelaron que la propensión de agregación de DISC1 fue influenciado por la enfermedad asociada a polimorfismo S704C 4, y que DISC1 aggresomes generados in vitro fueron invasor de células 5, similar a lo que se había mostrado para Aß 6, tau 7-9, α -sinucleína 10, poliglutamina 11, o agregados de SOD1 12. Estos resultados nos impulsó a proponer que al menos un subconjunto de casos con CMD, aquellos con DISC1 agregada podría ser trastornos conformacionales de proteínas. Aquí se describe cómo generar DISC1 aggresomes en células de mamíferos, purificarlos en un gradiente de sacarosa y utilizarlos para studi invasividad celulares. Del mismo modo, se describe cómo generar una exclusiva multimérica C-terminal fragmento DISC1, etiqueta y purificarlo para estudios de invasividad de las células. Uso de los multímeros recombinantes de DISC1 logramos invasividad de las células similar al de una etiquetados de manera similar sintético α-sinucleína fragmento. También se muestra que este fragmento se recoge en vivo cuando estereotácticamente inyectado en el cerebro de los animales receptores.

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

La generación, purificación y la invasión celular de aggresomes intracelulares, citoplasmáticas de longitud completa de proteína DISC1 de cultivos celulares y de un marcado, multimérica fragmento de la proteína recombinante en DISC1<em&gt; E. coli</em&gt; Se describen. Invasividad de las células se muestra para las células receptoras en cultivo celular y para las neuronas<em&gt; In vivo</em&gt; Después de la inoculación cerebro estereotácticos.

Generación, purificación y caracterización de especies invasivas en células de proteína DISC1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K vistas.  Medical School Düsseldorf, Germany. La generación, purificación y la invasión celular de aggresomes intracelulares, citoplasmáticas de longitud completa de proteína DISC1 de cultivos celulares y de un marcado, multimérica fragmento de la proteína recombinante en DISC1 E. coli Se describen. Invasividad de las células se muestra para las células receptoras en cultivo celular y para las neuronas In vivo Después de la inoculación cerebro estereotácticos.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

La purificación de la M. magneticum Tensión AMB-1 magnetosomas proteína asociada MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

La purificación de Hsp104, una proteína Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

La detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

La identificación de la interacción proteína-proteína en<em&gt; Drosophila</em&gt; Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...