El trabajo en el laboratorio de los autores es apoyada por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (GM41628) y con una donación al Instituto Stowers de Investigación Médica de la Fundación para la Investigación Médica Nelson Helen en la Fundación de la Comunidad metropolitana de Kansas City.

1. Generación y Cultura de HEK293 líneas estables celulares que expresan versiones mutantes de la BANDERA de cuerpo entero o epítopo de etiquetado Ino80 o otras subunidades INO80 complejas <ol><li> Clon de ADNc de longitud completa que codifica o mutante humana Ino80 ATPasa u otra subunidad INO80 en el vector de expresión de mamífero pcADN5 / FRT con un terminal N etiqueta de epítopo FLAG en el marco. </li><li> Confirme la secuencia de los ADNc insertados por secuenciación de ADN antes de proceder. </li><li> Para realizar la transfección, Flp-In crecer células HEK293 en 10 cm de platos de cultivo de tejidos en un medio que contiene DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco), 5% de glutamina, y 10% de FBS (suero fetal bovino). </li><li> Cuando las células alcanzan ~ 70% de confluencia, añadir a cada placa de cultivo tisular de una mezcla de 40 l de reactivo de transfección FuGENE6, 0,5 g del plásmido de expresión pcDNA5 / FRT adecuada, y 9,5 g de pOG44, que codifica la recombinasa Flp, en un volumen total de 800 l. </li><li> 48 horas más tarde, y s trypsinizePlit células en una relación de 01:30 en 10 cm de platos, y hacerlas crecer en DMEM con 5% de glutamina, 10% de FBS y 100 g / ml de higromicina B para 3 - 4 semanas. Cambie el medio de cultivo cada vez que empieza a volverse amarilla (normalmente cada 3 - 5 días). </li><li> Para identificar los clones positivos que expresan el nivel más alto de la proteína marcada con FLAG, seleccionar colonias higromicina B individuo resistente y transferirlos a un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. <ol><li> Una vez que las células alcanzan 80% de confluencia, las células de la cosecha de cada pocillo en ~ 1 ml de PBS y sedimento por centrifugación a 1000 xg durante 5 min. </li><li> Después de retirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 60 l de tampón de muestra de SDS-PAGE. </li><li> Asunto medio del sedimento de células se resuspendió a la página SDS y Western Blot para controlar la expresión de la proteína marcada con FLAG cebo; guardar la otra mitad para análisis futuros. </li></ol></li><li> Si no se detecta una proteína humana Ino80 bandera de etiquetado en lisados ​​celulares, expanda la popu inicial de células clonalmento más en placas células de los pocillos individuales de una placa de 24 pocillos en 15 cm de platos de cultivo de tejidos. <ol><li> Para cosechar las células de 15 cm de platos, resuspender cerca de las células confluentes en PBS enfriado con hielo y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Llevar a un volumen final de 50 ml mediante la adición de PBS adicional. </li><li> Precipitar las células a 1.000 g durante 5 min, y eliminar lo más posible del sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de tampón de Lys450 (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, NaCl 450 mM, 0,5% Triton X-100, 10 mM de KCl, 4 mM de MgCl 2, EDTA 0,2 mM, glicerol al 10%, DTT 1 mM, 200 M PMSF y 1: 1000 cóctel inhibidor de proteasas). NOTA: aquí y en otros lugares, siempre agregar la TDT, PMSF y cóctel inhibidor de la proteasa para tampones inmediatamente antes de comenzar un experimento. </li><li> Inmuno-precipitado proteínas del lisado de células enteras resultante FLAG-etiquetados utilizando 20 l de gel de agarosa anti-FLAG, y analizar los eluidos BANDERA de Western Blot. [Para más detalles sobre immunprocedimiento oprecipitation, ver paso 5] </li></ol></li><li> Preparar material congelado de líneas celulares clonales deseados 12 y almacenarlos en nitrógeno líquido hasta su uso. </li></ol> 2. Growing HEK293 líneas celulares en frascos rotatorios Para la preparación a gran escala de complejos INO80, células de cultivo en 10 - 20 botellas de rodillos; un rendimiento típico de cada frasco rotativo es ~ 1 ml de concentrado de hematíes. <ol><li> Para cada botella rodillo, añadir 200 ml de DMEM, 5% de glutamina, y 10% de suero de ternera, sin higromicina B. </li><li> Transferir todas las células de un solo cerca de 15 cm confluente plato en cada botella rodillo </li><li> Botellas Lugar de rodillos en un 37 ° C rodillo botella incubadora y giran a 0,2 rpm. </li><li> Una vez que las células alcanzan ~ 70% de confluencia, verter y desechar el medio. </li><li> Añadir PBS ~ 50 ml de hielo frío a cada botella. La celebración de botellas en posición horizontal, homogeneizar suavemente para aflojar la monocapa celular. </li><li> Transferir las células se volvieron a suspender a 250 ml plastbotellas cónicas ic y el lugar en el hielo. </li><li> Enjuague las botellas de rodillos con PBS adicional, transfiriéndolo secuencialmente de botella a botella. Cuando la solución de enjuague ya no está claro (normalmente después de haber sido usada para enjuagar unos 5 botellas), añadir a la suspensión celular. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 400 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en PBS, combinarlos en un solo frasco cónico de 250 ml, y mantener en hielo hasta su posterior procesamiento. </li></ol> 3. siRNA mediada Derribo de INO80 Subunidades en células que expresan Otra bandera de etiquetado INO80 Subunidad Para obtener subcomplexes INO80 que carecen de una única subunidad, uso FLAG-inmunopurificación para purificar Ino80 de células siRNA tratados o células que expresan establemente shRNA. El siRNA &quot;marcha atrás&quot; (pequeños ARN de interferencia) protocolo de transfección descrito aquí está optimizado para las células HEK293 que crecen en placas de 15 cm. El protocolo es para un solo plato de 15 cm de células y shoULD ser ampliado en consecuencia en función del número de células necesarias. Para preparar cantidades bioquímicamente útiles del complejo INO80 a partir de células tratadas con siRNA, se debe ampliar a las culturas crecido en 40 de 15 cm de platos; éstas producen aproximadamente el 2 - 4 ml de pellet hematocrito. <ol><li> Se cultivan las células HEK293 que expresan establemente la subunidad deseada del complejo INO80 hasta casi confluencia en placas de 15 cm. </li><li> Añadir un volumen de tampón de resuspensión de siRNA (mM KCl 20 mM, HEPES 6-pH 7,5, y 0,2 mM de MgCl 2) suficiente para preparar una solución madre 50 mM de ARNsi a un tubo que contiene liofilizado siRNA. Pipetear la solución arriba y abajo un par de veces y se incuba en un nutator durante 30 minutos a temperatura ambiente para garantizar el siRNA se haya disuelto completamente. </li><li> Preparar un cóctel de transfección que contiene siRNAs y reactivo de transfección. Mezclar 10 l de la solución madre 50 mM siRNA con 32 l Lipofectamine RNAiMAX y añadirlo a 4 ml de Opti-MEM medio de suero reducido con mezcla muy suave; albajo todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de su uso. </li><li> Incubar la mezcla a TA durante 30 min. </li><li> Preparar las células Flp-In HEK293 que expresan establemente la subunidad INO80 deseada para la transfección. <ol><li> Durante la incubación de la Etapa 3.4, lavar las células en las placas de 15 cm una vez con PBS RT. </li><li> Después de la eliminación de PBS, el tratamiento de las células con 1 ml de tripsina hasta que empiecen a levantar la placa. </li><li> Inmediatamente después, añadir 10 ml de medio completo (DMEM + 5% de glutamina + 10% de FBS) a las células se trataron con tripsina y mezclar suavemente. Recoger las células por centrifugación a 1000 xg durante 5 min a TA. </li><li> Resuspender el sedimento celular en ~ 4 ml de medio completo, y contar el resuspensión de células usando un hemocitómetro. </li><li> Diluir las células con medio completo a una concentración de ~ 5,4 x 10 6 / ml. </li></ol></li><li> Para cada plato 15 cm, añadir 15 ml de medio de cultivo completo seguido por 4 ml de cóctel de transfección. Agitar suavemente para asegurar el medio de transfección y cócteles son thoroughly mezclado. Por último, añadir un ml de suspensión de células y de nuevo agitar suavemente para dispersar las células de manera uniforme. </li><li> Después de 60 horas de cultivo en un 37 ° C, 5% de CO2, retire con cuidado medio, suspender las células en hielo frío PBS, y proceder de inmediato a preparar extractos nucleares. </li></ol> 4 Preparación de extractos nucleares Este procedimiento se ha modificado desde el protocolo de Dignam 13 y se puede escalar hacia arriba o hacia abajo, dependiendo del tamaño de iniciar sedimentos celulares. Típicamente, 1 ml de concentrado de rendimientos sedimento celular 1 ml de extracto nuclear final. Todos los tampones deben ser fría como el hielo, y todos los pasos deben realizarse en una habitación fría o con hielo si una habitación fría conveniente no esté disponible. <ol><li> Aislamiento de los núcleos: <ol><li> Transferir suavemente las células de un tamaño adecuado (15 o 50 ml) se graduó tubo cónico y centrifugado a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante, y medir el volumen de la pel celular aglomeradodejar. 1 ml de concentrado de eritrocitos corresponde a ~ 3 x 10 8 células HEK293. </li><li> Añadir 5 volúmenes envasados ​​celulares de tampón A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM KCl y recién añadido DTT 1 mM, 200 mM PMSF y 1: 1000 de cóctel inhibidor de proteasa). Resuspender el sedimento celular por pipeteo suave. </li><li> Incubar en hielo durante exactamente 10 min. </li><li> Sedimentar las células a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante. </li><li> El tamaño del sedimento celular debería aumentar hasta 2 veces durante la incubación en tampón A. </li><li> Resuspender las células en dos volúmenes de células empaquetadas de tampón A, y transferir la suspensión celular a un tamaño apropiado homogeneizador de tejidos Dounce. Si a partir de menos de 2 ml de concentrado de hematíes, utilizar un homogeneizador 7 ml; para 2 - 4 ml concentrado de hematíes, utilizar un homogeneizador 15 ml; y de 10 o más ml de concentrado de hematíes, utilizar un homogeneizador 40 ml. </li><li> Homogeneizar la suspensión celular con la mano del mortero de vidrio sueltas del homogeneizador Dounce ONUhasta 90% de las células teñir positivamente con 1% de azul de tripano. </li><li> Transferir la suspensión a un tubo de centrífuga de alta velocidad de 45 ml y centrifugar a 25.000 xg durante 20 min a 4 ° C en un rotor JA-17 o similar (véase la Tabla de Materiales / Equipos). </li><li> Desde el sedimento nuclear, separar el sobrenadante, que contiene proteínas o proteínas que se filtran fuera del núcleo durante el fraccionamiento citosólicas. </li></ol></li><li> La extracción de núcleos con sal: <ol><li> Añadir Tampón C (HEPES 20 mM, pH 7,9, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM EDTA, y recién añadido DTT 1 mM, PMSF 200 mM, y 1: 1000 de cóctel inhibidor de la proteasa) al sedimento nuclear; utilizar 2,5 ml Tampón C por cada 3 ml de comenzar el hematocrito (~ 1 x 10 9 células). </li><li> Usando una varilla de vidrio o una pipeta, desalojar el sedimento nuclear de la pared del tubo y transferir toda la mezcla a un homogeneizador Dounce de un tamaño apropiado. </li><li> Resuspender los núcleos por homogeneización ªmezcla e con dos golpes de una mano de mortero suelto. </li><li> Transferir la fracción nuclear se resuspendió en un vaso de precipitados enfriado. Elija un vaso de precipitados de tal modo que la suspensión se llenará el vaso de precipitados a por lo menos 0,5 cm de profundidad. </li><li> Para extraer las proteínas nucleares de la cromatina o de otras estructuras insolubles, aumentar gradualmente la concentración de sal de la suspensión a NaCl 0,42 M mediante la adición gota a gota de NaCl 5 M mientras se agita suavemente la suspensión con una pipeta o varilla de vidrio en hielo; Una vez que todo el M NaCl 5 ha sido añadido, la solución debe ser muy viscoso o similar a un gel. Calcular el volumen de 5 M de NaCl necesaria para llevar la solución a una concentración final de NaCl 0,42 M de acuerdo con la siguiente fórmula: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Transferir cuidadosamente la suspensión viscosa en 10 ml tubos de policarbonato para un tipo de 70,1 rotor Ti (o equivalentes) botellas de policarbonato o 70 ml para un tipo 45 Ti or rotor similar (véase la Tabla de Materiales / Equipos). Selle herméticamente con Parafilm si utiliza tubos de 10 ml o con el conjunto de la tapa si está utilizando 70 ml botellas. </li><li> Roca lentamente los tubos sellados a 4 ° C durante 30 min usando un nutator. </li><li> Haga girar las muestras de un tipo de 45 o 70.1 Ti Ti rotor durante 30 minutos a 120.000 xg a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de plástico simple o botella. Este sobrenadante es el extracto nuclear, y el sedimento contiene la cromatina nuclear y otros desechos. </li><li> Dividir el extracto nuclear en alícuotas convenientemente dimensionados, congelar en nitrógeno líquido y almacenarlo a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Inmunoafinidad Purificación del INO80 humano o INO80 Subcomplejos <ol><li> Para descongelar el extracto nuclear congelada, coloque los tubos que contienen el extracto de los tubos de sobremesa o rollo entre las manos hasta que el material congelado se convierte en una suspensión. A continuación, coloque los tubos en hielo o en la cámara frigorífica hasta que el extracto es completamente thawed. </li><li> Transferir el extracto nuclear descongelado a tubos de ultracentrífuga de policarbonato de 10 ml, y centrifugado a 100.000 xg durante 20 min a 4 ° C en un rotor Ti Tipo 70.1 o equivalente para eliminar cualquier precipitado que se pueden haber formado durante el ciclo de congelación-descongelación. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 15 ml. Añadir fresco cóctel TDT, PMSF, y inhibidor de proteasa a concentraciones finales de 1 mM DTT, 200 mM PMSF y 1: 1000 cóctel inhibidor de proteasas. </li><li> Para preparar agarosa anti-FLAG para la inmunopurificación, transferir 200 l de suspensión al 50% de perlas de agarosa anti-FLAG a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml usando una pipeta P200 o similar con una punta de la que el extremo se ha cortado con un escalpelo limpio o cuchilla de afeitar. </li><li> Sedimentar las perlas por centrifugación en una microcentrífuga de sobremesa a 8.000 xg durante 30 seg. Eliminar el sobrenadante y lavar las perlas mediante resuspensión de las perlas en 1 ml de tampón de Lys450, y sedimentar las perlas a 8.000 xg durante 30 seg. Lave la bEADS dos veces más. </li><li> Resuspender las perlas de agarosa anti-FLAG lavadas en aproximadamente 100 l de extracto nuclear usando un P200 o una pipeta de volumen ajustable similar con una punta de la que el extremo se ha cortado con un escalpelo limpio o cuchilla de afeitar y, empleando la misma punta, la transferencia las perlas se resuspendieron en el tubo cónico de 15 ml que contiene el extracto. Repita varias veces hasta que todas las cuentas han sido transferidas al tubo de 15 ml. </li><li> Incubar la mezcla de extracto / perlas durante 4 horas a 4 ° C con rotación lenta en un rotor de laboratorio. OPCIONAL: Incluir benzonasa a una concentración de 25 unidades / ml para eliminar la contaminación de ADN. </li><li> Recoge la agarosa FLAG por centrifugación a 1000 × g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Volver a suspender en 10 ml Lys450 para lavar, incubar 5 min a 4 ° C con agitación suave en un nutator. Sedimentar las cuentas a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender en 100 - 150 l de Lys450 y transferencia de cuentas a un tubo de 1.5 ml. Continue para enjuagar el tubo cónico de 15 ml con 100 - 150 l de Lys450 hasta que todos los granos se han transferido al tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar las cuentas a 8.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C en una microcentrífuga. Lavar tres veces más con 1 ml Lys450 y una vez con 1 ml de tampón EB100 (10 mM HEPES pH 7,9, 10% de glicerol, NaCl 100 mM, 1,5 mM de MgCl 2, 0,05% Triton X-100, y recién añadió DTT 1 mM, PMSF 200 mM , y 1: 1000 cóctel inhibidor de proteasas). </li><li> Para eluir las proteínas unidas, añadir tampón EB100 200 l que contiene 0,25 mg ml 1x péptido / FLAG. Incubar 30 min a 4 ° C cada uno en una nutator. </li><li> Sedimentar las cuentas a 8.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C en una microcentrífuga. Transferir el sobrenadante, que contiene el complejo INO80 eluido, a un tubo de microcentrífuga fresco. </li><li> Repetir la elución cuatro veces más, y poner en común todos los sobrenadantes en un solo tubo. </li><li> Para eliminar las cuentas residual FLAG-agarosa de la fracción de proteína eluida,pasar el eluato a través de una columna de centrifugación vacío. </li><li> Se concentra la fracción de proteína se eluyó ~ 10 veces usando un dispositivo de filtro centrífugo de ultra (corte de peso molecular 50.000). </li><li> Para eliminar el péptido FLAG, pasar la fracción de proteína concentrada secuencialmente a través de dos columnas de desalación. </li><li> Divida la fracción de proteína purificada, desalado en 20 alícuotas, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. </li><li> Analizar la composición de la subunidad de INO80 o subcomplexes INO80 en geles teñidos con plata o por el Western Blot, y estimar su concentración por el Western Blot semi-cuantitativo utilizando preparaciones de subunidades INO80 recombinantes de concentración conocida como estándares. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los estudios estructurales y funcionales de múltiples subunidades complejos de remodelación de la cromatina de mamíferos a partir de eucariotas superiores se han visto obstaculizados por la dificultad de preparar bioquímicamente cantidades útiles de tales complejos que contienen subunidades mutantes o que carecen de ciertas subunidades completo. Hay un número de obstáculos técnicos: En primer lugar, la manipulación genética en células de mamíferos ha sido técnicamente difícil y consume mucho tiempo. A dife...

Complejos remodeladores de cromatina familiares SNF2 conservadas evolutivamente son reguladores clave de la organización de la cromatina y la accesibilidad de ADN 1. Estos complejos de remodelación siempre incluyen una subunidad ATPasa-SNF2 como central, que, en algunos casos, se reúne con diversas proteínas accesorias y forma de múltiples subunidades asambleas macromoleculares. Para estudiar los detalles moleculares del proceso de remodelación de la cromatina dependiente de ATP, es importante para entender las contribuciones de los subconjuntos dados de subunidades y / o estructuras de dominio a las actividades de los complejos. Tales análisis requieren la capacidad de generar complejos de mutantes altamente purificados que carecen de subunidades de proteínas particulares o estructuras de dominio. Anteriores estudios de estructura-función de los complejos de remodelación de la cromatina dependientes de ATP han ampliamente centrado en el sistema modelo de levadura debido a la manipulabilidad superior del genoma de la levadura (véase, por ejemplo, refs 1-4). Dada la conservación de loscomposición de la subunidad y funcionalidad entre los complejos de remodelación de ortólogos, los estudios sobre la estructura y función de los complejos de remodelación de levadura han aportado importantes conocimientos sobre sus homólogos en eucariotas superiores. No obstante, existen especies específicas apreciables diferencias entre los complejos de remodelación, que resulta de la ganancia o pérdida de especies específicas de subunidades, la ganancia o pérdida de los dominios específicos de especies de subunidades conservados, y la secuencia de la variabilidad dentro de dominios conservados de subunidades conservados. Estas diferencias no pueden en principio ser impulsados ​​por la necesidad de que las células eucarióticas superiores para adaptarse a nuevos entornos moleculares y celulares. Por lo tanto, la comprensión de cómo las subunidades de los complejos de remodelación de eucariotas superiores contribuyen al proceso de remodelación nucleosoma es valiosa, ya que no sólo arroja luz sobre los mecanismos básicos del proceso de remodelación de la cromatina dependiente de ATP, pero también puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos por los que la estructura de la cromatina y la expresión génica en higsus eucariotas están regulados. Hasta el momento, sólo se han limitado los estudios estructurales y funcionales de los complejos de remodelación de la cromatina de mamíferos múltiples subunidades, debido en parte a las dificultades en la obtención de los complejos de remodelación de la cromatina bioquímicamente definidos y subcomplexes. Hemos eludido parcialmente estas dificultades con los procedimientos descritos a continuación, en el que la purificación de inmunoafinidad se utiliza para preparar INO80 o INO80 subcomplexes intactos de las células humanas que expresan establemente N-terminal FLAG epítopo etiquetado de tipo salvaje o versiones mutantes de Ino80 5-7 (Figura 1) . Para obtener complejos de INO80 intactos de las células humanas, la recombinación mediada por FLP se utiliza para generar líneas celulares transgénicas HEK293 que expresan de forma estable epítopo FLAG ADNc etiquetados que codifican subunidades de los complejos INO80 8-10. Debido a la sobre expresión de subunidades INO80 puede ser algo tóxicos, es necesario aislar y mantener líneas celulares clonales menores de co selectivanditions para asegurar la expresión transgénica estable durante los muchos pasajes necesarios para la expansión de los cultivos celulares a gran escala. Para obtener subcomplexes INO80 más pequeños que contienen solamente un subconjunto de subunidades, hemos utilizado con éxito dos enfoques (Figura 2A, B). En la primera, generamos líneas celulares HEK293 Flp-In que expresan de forma estable versiones mutantes de Ino80 que carecen de dominios requeridos para la interacción con las subunidades específicas 5. Alternativamente, mediada desmontables-siRNA se utiliza para agotar la subunidad deseada a partir de células que expresan una subunidad INO80 marcado con FLAG apropiado (datos no publicados). Por último, para purificar los complejos INO80 humanos, FLAG cromatografía basada agarosa 11 se utiliza para enriquecer la fracción que contiene INO80-a partir de extractos nucleares, lo que reduce de manera efectiva la presencia de proteínas contaminantes citosólicas en la fracción final que contiene INO80 o INO80 subcomplexes purificados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
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		<tr height="21">
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			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

Complejos remodeladores de cromatina INO80 regulan la dinámica de nucleosomas y la accesibilidad de ADN al catalizar la remodelación de nucleosomas dependiente de ATP. Ino80 Humanos constan de 14 subunidades de proteínas incluyendo Ino80, un SNF2-como ATPasa, que sirve tanto como la subunidad catalítica y el andamio para el ensamblaje de los complejos. Funciones de las otras subunidades y los mecanismos por los que contribuyen a la actividad de remodelación de la cromatina del complejo INO80 siguen siendo poco conocidos, en parte debido al desafío de generar subconjuntos INO80 en células humanas o sistemas de expresión heteróloga. Este protocolo JOVE describe un procedimiento que permite la purificación de subcomplexes remodelación de la cromatina INO80 humanos que carecen de una subunidad o un subconjunto de subunidades. N-terminal BANDERA epítopo etiquetados cDNA Ino80 se introducen de manera estable en el riñón embrionario humano (HEK) 293 líneas celulares que utilizan la recombinación mediada por FLP. En el caso de que un subconjunto de subunidades del complejo INO80 es abe borrado, uno expresa las proteínas mutantes Ino80 vez que carecen de la plataforma necesaria para el montaje de esas subunidades. En el caso de una subunidad individual es a agotarse, uno transfecta siRNAs dirigidos a esta subunidad en una línea celular HEK 293 que expresan establemente FLAG etiquetados Ino80 ATPasa. Nuclear extractos se preparan, e inmunoprecipitación FLAG se realiza para enriquecer las fracciones de proteínas que contienen derivados Ino80. Las composiciones de subcomplexes INO80 purificados a continuación, se pueden analizar utilizando métodos tales como la inmunotransferencia, la tinción con plata, y espectrometría de masas. Los subcomplexes INO80 y INO80 generados de acuerdo con este protocolo se pueden analizar posteriormente utilizando diversos ensayos bioquímicos, que se describen en el protocolo JOVE acompaña. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar para los estudios de las propiedades estructurales y funcionales de cualquier remodelación de la cromatina multi-subunidad de mamíferos y en complejos de modificadores.

La figura 1 muestra un diagrama de flujo que resume los procedimientos que se utilizan para generar, purificar y caracterizar los complejos de remodelación de la cromatina INO80 ATP-dependientes humanos. Como se ilustra en las figuras 2 y 3, estos procedimientos permiten la generación de ambos tipo INO80 y INO80 subcomplexes salvajes que carecen de varias subunidades, permitiendo así que los análisis bioquímicos posteriores de la contri...

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Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Este protocolo describe un procedimiento para la generación y purificación de tipo salvaje y versiones mutantes del complejo de remodelación de la cromatina INO80 humano. Etiquetadas con epítopo versiones de subunidades INO80 se expresaron de manera estable en células HEK293, y los complejos completos y complejos que carecen de conjuntos específicos de subunidades se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Generación y purificación de Humanos INO80 remodelación de la cromatina complejos y Subcomplejos

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

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JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K vistas.  Stowers Institute for Medical Research.  Este protocolo describe un procedimiento para la generación y purificación de tipo salvaje y versiones mutantes del complejo de remodelación de la cromatina INO80 humano. Etiquetadas con epítopo versiones de subunidades INO80 se expresaron de manera estable en células HEK293, y los complejos completos y complejos que carecen de conjuntos específicos de subunidades se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad. 

Video: Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Investigación

Biología

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

La visualización de las células intersticiales de Cajal (ICC) de red en ratones

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Many commercially available ligands are especially useful because they contain 
functional groups that allow for fast, high-purity, and high-yielding conjugation to macromolecules and biomolecules via amine-reactive 
activated esters and isothiocyanate groups or thiol-reactive maleimides. While metalation of these ligands is considered common 
knowledge in the field of bioconjugation chemistry, subtle differences in metalation procedures must be taken into account when 
selecting metal starting materials. Furthermore, multiple options for purification and characterization exist, and selection of the most 
effective procedure partially depends on the selection of starting materials. These subtle differences are often neglected in published 
protocols. Here, our goal is to demonstrate common methods for metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes 
that can be used as contrast agents for MRI (Figure 1). We expect that this publication will enable biomedical scientists to incorporate 
lanthanide complexation reactions into their repertoire of commonly used reactions by easing the selection of starting materials and 
purification methods.

We demonstrate the metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes. The complexes described here can be conjugated to macromolecules to enable tracking of these molecules using magnetic resonance imaging.

Preparación, purificación y caracterización de los complejos lantánidos para el uso de agentes de contraste para resonancia magnética

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Generación, purificación y caracterización de especies invasivas en células de proteína DISC1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Los ensayos bioquímicos para Actividades Analizando de ATP-dependientes remodelación de la cromatina enzimas

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...